Методическая статья

Липидов Bilayer везикул поколения Использование микрофлюидных струйное

DOI:

10.3791/51510

⸱

21 февраля 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, Institute for Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin, 4Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, 5Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микрофлюидных струйное против интерфейса капли липидного бислоя обеспечивает надежный способ генерировать пузырьки с контролем над мембраной асимметрии, включения трансмембранных белков, и инкапсуляции материала. Этот метод может быть применен для исследования различных биологических системах, где узконаправленных биомолекулы желательно.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Снизу вверх синтетическая биология представляет собой новый подход к расследованию и воссоздания биохимические системы и, возможно, минимальные организмы. Это новая область участвует инженеров, химиков, биологов, и физиков в разработке и сборке основных биологических компонентов в сложных функционирующих систем снизу вверх. Такие системы снизу вверх может привести к развитию искусственных клеток для фундаментальных биологических запросов и инновационных методов лечения 1,2. Гигантские однослойные везикулы (GUVs) может служить в качестве платформы для модели синтетической биологии из-за их клеток-подобную структуру мембраны и размера. Микрофлюидных струйное или microjetting, является метод, который позволяет для генерации GUVs с контролируемым размером, состава мембраны, трансмембранный белок включения, и инкапсуляции 3. Основной принцип этого метода является использование нескольких, бобовых высокочастотных жидкости, порожденных пьезо-приводом струйный устройства для деформации условный лIPID двухслойная в GUV. Процесс сродни дует мыльные пузыри от мыльной пленке. Изменяя состав летают решения, состава, охватывающего решения, и / или компонентов, включенных в бислой, исследователи могут применять эту методику для создания пользовательских пузырьки. Эта статья описывает процедуру для создания простых пузырьки из интерфейса капли бислоя на microjetting.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Она становится все более ясно, что клеточная биология является многопрофильным масштаб проблемы, что предполагает интеграцию наше понимание от молекул к клеткам. Следовательно, зная точно, как молекулы работать индивидуально не достаточно, чтобы понять сложные клеточные поведения. Отчасти это связано с существованием возникающих поведения многокомпонентных систем, о чем свидетельствует воссоздания актина сетевого взаимодействия с липидный бислой пузырьков 4, митотической сборки шпинделя в Xenopus извлечь 5, и пространственная динамика бактериальных деления клеток механизмов 6. Один из способов, чтобы дополнить подход редукционистской в ​​рассекает молекулярные процессы живых систем является взять противоположный подход о возвращении к сотовой поведения с использованием минимального набора биологических компонентов. Важной частью этого подхода предполагает надежную герметизацию биомолекул в ограниченном объеме, ключевую функцию клетки.

e_content "> Несколько стратегии существуют для инкапсуляции биомолекул для изучения биомиметических систем. Наиболее биологически значимым система липидные двухслойные мембраны, которые имитируют биохимических и физических ограничений, налагаемых мембране клетки плазмы. Формирование гигантских однослойные пузырьки (GUVs) по electroformation 7, один из наиболее широко используемых методов для генерации GUV 14, как правило, имеет плохой урожай инкапсуляции из-за его несовместимости с высоким содержанием соли буфера 8. Electroformation также требует больших объемов выборки (> 100 мкл), которые могли бы быть проблемой для работы с очищенных белков , и неэффективно включает большие молекулы из-за сложности диффузии между близко расположенными слоями липидов. Несколько микрофлюидных подходы к генерации липидные пузырьки были разработаны. двойной методы эмульсии, которые проходят компонентов через два интерфейса между слоями воды-масло-вода (W / O / W), зависит от испарения VOlatile растворителя ездить липидный образование двухслойную 9. Другие использовали микрофлюидных конвейера, который производит непрерывный поток липидного бислоя везикулы 10 или на два этапа: 11. Мы разработали альтернативный метод, основанный на быстро подаче импульсов жидкости против интерфейса капель бислой 12 для получения GUVs контролируемого размера, состава и инкапсуляции. Наш подход, известный как микрофлюидный струей, предлагает сочетает в себе преимущества из нескольких существующих методов генерации пузырьков, обеспечивая подход для создания функциональных биомолекулярные системы для исследования различных биологических проблем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Бесконечность палата Изготовление

  1. Дизайн бесконечности камеру (названный так в честь его формы), используя автоматизированного проектирования (САПР), и сохраните файл так, что он совместим с лазерным резаком. Чтобы создать эту форму, отдельные два круга диаметром 0,183 в на расстоянии от центра до центра 0,15 дюйма Cut камеру от 1/8- 3/16 в прозрачного акрила с лазерным резаком. Форма бесконечности облегчает капель интерфейса образование двухслойную и стабильности.
  2. Дрель 1/16 в отверстие через края акриловой камеры в хорошо бесконечность-образную форму. Повторите на противоположной стороне. Вырезать небольшой прямоугольник от 0,2 мм акрилового листа с помощью ножниц или лазерный резак, чтобы служить в качестве основания до лунок.
  3. Нанесите тонкий но полный слой клея быстросохнущие к одной стороне 0,2 мм акрила и приклеить его к нижней части камеры. Удерживая 0,2 мм акриловые плотно на месте против нижней части камеры и обойтиськлей на границе, чтобы клей для создания герметичности, но избежать покрывая область просмотра. Будьте уверены, чтобы выровнять акрил так, чтобы его края находится на одном уровне с краем стенки камеры и полностью покрывает бесконечности камеры вырез. Это позволит в течение достаточного проникновения струи и предотвратить утечку колодца.
  4. Вырежьте два небольшие кусочки натурального каучука, чтобы покрыть просверленные отверстия. Нанесите клей быстрой сушки вокруг отверстия. Поместите резину над отверстием и нажмите на всех областях с парой щипцов по обеспечению. Повторите эти действия для обоих просверленные отверстия. Убедитесь, что все клееные соединения являются полными уплотнения, чтобы предотвратить любую утечку.
  5. Использование 23 г, 1 в игле, совать отверстие в натурального каучука с обеих сторон камеры, упрощающий установку пьезоэлектрического струйной наконечника.

2. Экспериментальная Подготовка

Магазин складе липидов решение в хлороформе в -20 ° C морозильник. Для этого исследования, либо 1,2-diphytanoбыл использован ил-Sn-глицеро-3-фосфохолин (DPhPC) или 1,2-диолеоил-Sn-глицеро-3-фосфохолина (DOPC). 2 мл 25 мг / мл липидов решение обычно готовят в этом протоколе и продлится в течение двух месяцев при хранении при температуре -20 ° С.

  1. Чтобы ресуспендируют липидов в н-декане, сначала передать его из исходного флакона в небольшом стеклянную банку и осторожно сухой атмосфере аргона или азота. Удерживая банку под углом во время сушки, чтобы выставить большую площадь поверхности для газа, что позволяет липид высохнуть быстрее.
  2. С колпачком банку лишь незначительно резьбовым на, позволяют Высушенный раствор сидеть под вакуумом в эксикаторе в течение 1-2 часов. Затем добавляют н-деканом до resolubilize липида при 25 мг / мл. Vortex липид раствор кратко и разрушать ультразвуком его в ванну для обработки ультразвуком в течение 15 мин. Храните водостойких липидов в н-декана при -20 ° С
  3. Приготовьте раствор складе сахарозы. В 1,5 мл микроцентрифужных трубки, добавьте 900 мкл 300 мМ сахарозы и 100 мкл1% метилцеллюлозы (МС). Метилцеллюлозы добавляется к увеличению вязкости раствора, который содействует струей. Необязательный шаг: добавить дополнительный 1 мкл темного цвета пищевого красителя или флуоресцентных шариков кредитовать больше контраста или флуоресценции в области обработки изображений, соответственно. Это решение является 300 мОсм раствор сахарозы создан, чтобы соответствовать сотовой осмолярность и обеспечить контраст во microjetting.
  4. Draw раствора в одноразовом 1 мл пластиковый шприц. Удерживая шприц с верхушкой вверх, Флик вал несколько раз, чтобы изгнать любые пузыри в сторону кончика, и толкать поршень, чтобы извлечь попавший воздух. Будьте уверены, чтобы эвакуировать весь воздух из шприца, прежде чем продолжить, как это будет препятствовать надлежащему пьезоэлектрического сжатия, ответственного за струей.
  5. Установите фильтр 0,22 мкм на конце шприца. Чтобы предотвратить попадание воздуха в ловушке в фильтре, держать шприц вертикально и толкать поршень, пока капля не образуется над чаевых. Примечание:33 мм диаметр блок шприц был найден фильтр, работает лучше, но альтернативные фильтры, как маленький диаметром 3 мм шприцевой фильтр может быть использован для уменьшения мертвого объема.
  6. Отвинтите женского Luer адаптер струйных, и надежно нажать его на месте на конце фильтра. Опять же, извлечь жидкость, чтобы предотвратить попадания воздуха. Винт в верхней части струйных. Жидкость должна ехать в наконечнике струйной печати после того, как будет полностью установлен.

3. Готовится Оборудования

  1. Использование V-зажим, крепление шприца в сборе на столике микроскопа. Прикрепите провод от струйных к струйной контроллера. Примечание: пользовательские этап был построен для этого протокола, в то время стадии проектирования можно определить пользователем, важно иметь независимое управление хуг шприца и ху от держателя образца.
  2. Определить увеличение и необходимую комбинацию линз для достижения желаемого изображения. Здесь цель 10X и 10X окуляр используются.
  3. Используйте высокоскоростную камеру (≥ 1000 кадров в секунду), чтобы визуализировать струйное и генерации пузырьков. До изображений, выполнять необходимую калибровку камеры. Использование на основе образа авто-триггер в программном обеспечении камеры, чтобы начать захват изображения.
  4. Установите пейзажный камеру на столике микроскопа. Закрепите камеру, записывая на пленку его на место на сцене.
  5. Тщательно выровняйте струйный наконечник с отверстием проколотой в натуральный каучук (см. рисунок 1b). Чтобы сделать это, довести струйный близко к камере и отрегулировать позиционирование на глаз, а затем сделать более точные настройки через микроскоп линзы. Продолжать осторожно, как грубые движения могут привести к повреждению струйный наконечник.
  6. После того, как струйный выравнивается, поддержать шприца от камеры, чтобы предотвратить повреждение струйных во время погрузки скважин. Будьте уверены, что движение струйных является однонаправленным, так что он остается совпадает с отверстием в мембране.
  7. Слегка нажмите на plunгер из шприца до маленькую капельку форм на струйном сопле. Это даст некоторое начальное противодавление.
  8. Входной параметры струйные. Для трапециевидной биполярного волны, используйте следующие параметры: частота 20 кГц импульсов, 3 времени мкс рост, 35 продолжительность мкс импульса, 3 времени мкс осенью, 65 В приложенного напряжения (амплитуда импульса) и 100 реактивных импульсов на спусковой крючок (количество импульсов) . Тем не менее, приложенное напряжение (амплитуда импульса) и число импульсов (реактивные импульсов на триггер) может изменяться для регулирования размера пузырьков.

4. Везикул поколения

  1. Добавить 25-30 мкл раствора липидов суспендируют в н-деканом до бесконечности камеры, охватывающей всю поверхность обеих скважин.
  2. Добавьте 25 мкл глюкозы (из той же осмолярности как раствора сахарозы) к внешнему краю одной скважины, пипетки медленно и плавно. По осаждения, падение глюкозы должны формировать, потому что глюкоза и липидов решение не смешиваются. Добавить еще 251; л глюкозы к противоположной скважины, что сделает еще одну каплю и образуют липидный бислой мембраны в середине камеры в течение 5-10 мин.
  3. Вставьте струйный через натурального каучука, и тщательно направлять его в сторону интерфейса капли бислоя. Подойдите к бислой медленно, как представил струйный будет вытеснять объем и может привести к разрыву бислой.
  4. Когда струйный находится в пределах ~ 200 мкм, применить струйное с настройками, описанными в пункте 3.8. Расстояние от бислоя может изменяться в первую очередь в зависимости от напряжения и импульса числа, наряду с другими параметрами. Этот протокол рекомендует медленно растет настройки (напряжения и количество импульсов) и наблюдая двухслойную деформации.

5. Очистка оборудования

  1. Снимите шприц в сборе с столике микроскопа, и распоряжаться 1 мл пластиковый шприц и фильтра.
  2. Для очистки струйный, аспирация следующие решения в порядке, опуская кончик в SOLUTION 7-10x каждый: 70% этанол, 2%-ный раствор Neutrad в теплой воде, 70% этанолом, и DDH 2 O. Если струйный не соответствовать надежно на аспирационной пипетки, вырезать пипетки для формирования дополнительного адаптера.
  3. Высушите камеру с ткани. Поместите бесконечности камеру в 250 мл химический стакан с 2% об / об Neutrad в теплой воде, а ультразвуком в течение 5-10 мин. После обработки ультразвуком, тщательно просушите скважин под сжатым воздухом. Любая влага в лунках может поставить под угрозу стабильность липидный бислой мембраны, так что рекомендуется также, что камеры расположены в сушильном шкафу при 60 ° С в течение 15 мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы собрали микрофлюидных настройки струйного на обычном перевернутой флуоресцентного микроскопа с пользовательским этапе, собранного из обработанных деталей и ручных микрометров (рис. 1). Характеристика струйных дает представление о процессе создания пузырьков. Изменения расстояния между струйного сопла и липидный бислой влияет на усилие, прилагаемое к вызвать деформацию мембраны. Вблизи от бислой фокусирует струю и предотвращает мембрану из диспергирующих энергию от точки генерации пузырьков. Вихревые ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие методы были разработаны для генерации пузырьков, в том числе electroformation, эмульсии, капли и генерации 14-16. Тем не менее, новые экспериментальные методы необходимо учитывать при проектировании биологических систем с растущей сходство с живыми системами. Микрофлюидных методы в частности предложили повышенный уровень контроля, регулирующий мембранный unilamellarity, монодисперсности размера, и внутреннее содержание 17,18, в результате чего модели везикул ближе к биологии. Кроме того, хар...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Майк Vahey от Флетчера Lab при Университете Калифорнии, Беркли за советом о параметрах microjetting. Эта работа была организована NIH грант DP2 HL117748-01.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пьезоэлектрический струйныйMicroFab TechnologiesMJ-AL-01-xxxxxx обозначает диаметр отверстия в микронах
Контроллер Jet Drive IIIMicroFab TechnologiesCT-M3-02
Высокоскоростная камераVision ResearchMiroEX2 DPhPC
липид в хлороформеAvanti850356CЗаказывается в небольших аликвотах во флаконах
33 мм PVDF фильтры, 0,2 & микро; mFisher ScientificSLGV033RS
1 мл шприцыFisher Scientific14823434
n-деканаAcros Organics111871000
глюкозойAcros Organics410950010
сахарозойSigma-AldrichS7903-1KG
метилцеллюлозыFisher ScientificNC9084958
1/8 в акрилеMcMaster Carr8560K239CAD проекты для камеры в форме бесконечности доступны по запросу
0,2 мм АкрилAstra ProductsClarex clear 001
Акриловый цементTAP Пластик10693
Loctite 495 СуперклейFisher ScientificNC9011323
Loctite 3494 УФ упрочняющий клейStrobels Поставка30765
Натуральный каучукMcMaster Carr85995K14
Изготовленная на заказ сценаДомашниен/дСАПР доступны по запросу

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
  2. Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
  3. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
  4. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
  5. Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
  8. Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
  9. Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
  10. Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
  11. Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
  12. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
  14. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  15. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
  16. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  17. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
  18. Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
  19. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи