Электропрядения фактор роста Освобождение микросфер в волокнистых Строительные леса

Один из текущих проблем в нервной тканевой инженерии является создание нерва канал (NC), который имитирует внеклеточного матрикса, где нервы расти естественным образом. Исследования показали, что клетки реагируют на нескольких факторов, в их среде, включая механическое, топографических, клея и химических сигналов ^1-3. Одной из основных проблем в этой области состоит в определении соответствующую комбинацию сигналов и изготовления систему, которая может поддерживать сигналы в течение длительного периода, чтобы поддерживать рост клеток ^4. Периферические нейроны, как известно, предпочитают мягкую подложку, быть направлены на выровненных волокон и отвечать фактора роста нервов (NGF) ^5-7. НК, который может обеспечить химические сигналы, в течение нескольких недель, как было показано, чтобы обеспечить улучшенную функциональное восстановление ближе к аллотрансплантатов, текущего золотого стандарта для ремонта нерва ^8,9.

Различные материалы и способы производства могут быть использованы для производства механической и Топографическаяаль киев ^10-13. Механические сигналы присущи выбранного материала, что делает выбор соответствующей материала для применения критического ^1,13. Методы производства контролировать топографические сигналы включают разделение фаз, самосборки и электропрядения ^1,13. Для приложений, микромасштабных микрофлюидики, photopatterning, травление, соли выщелачивании или газа пены также можно использовать ^14-17. Электропрядения стала самой популярной пути к инженеру волокнистые субстраты для тканевой культуры благодаря своей гибкости и простоте производства ^13,18-23. Нановолокна изготавливают путем приложения высокого напряжения к полимерного раствора заставляя его отражению себя и протянуть короткого промежутка для выполнения ^24. Выровнены каркас может быть создана путем сбора волокон на заземленной вращающейся оправке, и неприсоединившиеся каркасы собирают на неподвижной плите ^25. Адгезия сигнализации может быть достигнуто путем нанесения покрытия на волокнистую базового интерфейса умч фибронектин или конъюгации адгезии пептид, например, РГД, к HA до электропрядения ^26.

Химические сигналы, такие как факторы роста, наиболее трудно поддерживать в течение длительного периода, так как они нуждаются в источнике для контролируемого высвобождения. Многие системы были попытки добавить контролируемого высвобождения в electrospun волокнистых сетей с различной степенью успеха. Эти методы включают наложения электропрядения, эмульсии электропрядения, основной оболочки электропрядения и белка сопряжение ^27. Кроме того, электропрядения традиционно делается в летучем растворителе, который может влиять на жизнеспособность белка ^28, таким образом сохраняя биологическую активность белка должны быть рассмотрены.

Этот подход непосредственно касается объединения механические, топографические, химические и клейкие сигналы, чтобы создать настраиваемый каркас для роста периферических нервов. Механика Леса точно регулируется путем синтезаметакрилированные гиалуроновой кислоты (ГК). Сайты methacrylation применяются для крепления фото реактивные сшивателей. не сшитый материал уже не растворимы в воде и исключительно с разбивкой по ферментов ^29. Степень сшивания изменяет скорость деградации, механики и другие физические свойства материала. Использование HA с 30% methacrylation, который имеет модуль упругости при растяжении ~ 500 Па, создает мягкий субстрат, который близок к родным механики нервной ткани и, как правило, предпочтительный для нейронов ^26,29. Электропрядения на вращающейся оправке используется для создания выровненных волокон для топографической кия. Использование электропрядения наряду с микросфер обеспечивает химические сигналы в эшафот в течение длительного периода. Для поддержки нейрита микросферы роста содержащие NGF используются для создания химического сигнала. В отличие от большинства материалов electrospun ГА растворим в воде, так что NGF не сталкивается жесткие растворители в процессе производства. Чтобы добавить клейкую сигнал, СКСffold покрыта фибронектина. Заполненный система содержит все четыре типа сигналов, описанных выше: мягкие (механических) выровненных (топографических) волокон с NGF выпуская микросферы (химические), покрытую фибронектина (клея). Производство и тестирование этой системы описывается в данном протоколе.

Процесс начинается с производства микросфер с вода-в-масле-в-воде двойной эмульсии. Эмульсии стабилизируют, поверхностно-активного вещества, поливиниловый спирт (ПВС). Внутренняя водная фаза содержит белок. Как он будет добавлен к масляной фазе, содержащей материал оболочки PLGA растворяли в дихлорметане (ДХМ), поверхностно-активное вещество создает барьер между фазами, защищающих белка из DCM. Эта эмульсия является чем диспергируют в другой водной фазе, содержащей ПВС, чтобы создать внешнюю поверхность микросфер. Стабильная эмульсия перемешивают, чтобы позволить ДХМ испаряется. После промывки и лиофилизации вы остались с сухой микросфер продолжениеAining белок.

После того, как микросферы будут завершены, они будут готовы к electrospun в каркасах. Сначала вы подготовить электропрядения решение. Вязкость раствора имеет решающее значение для правильного формирования волокна. Решения чистого HA не отвечают этому требованию; ПЭО добавляется в качестве полимера-носителя, чтобы дать возможность электропрядения. Микросферы добавляют к раствору и electrospun в результате волокнистой строительные леса, с микросферами, распределенных по всему.

После того, как производство завершено, белок должен быть проверен, чтобы проверить свою жизнеспособность. Для этого, первичка, который реагирует на NGF может быть использован. Этот протокол использует ганглии задних корешков (DRG) с 8-10 дневных куриных эмбрионах. Клеточные пучки высевают на каркасах, содержащих микросферы, наполненные NGF или те, которые являются пустыми. Если NGF все еще жизнеспособна вы должны увидеть расширенную рост аксонов на NGF, содержащих лесов. Если NGF, больше не жизнеспособны он будетне способствует нейриты для расширения и должны выглядеть примерно контролем.

Точная процедура описано здесь сосредоточено на нервной поддержки, однако, с простых изменений в материале, методом электроформования и белков система может быть оптимизирована для различных типов клеток и тканей.

1 вода / масло / вода Двухместный Эмульсия Microsphere Производство

1. Первый подготовить 2% и 0,5% вес / объем растворов поливинилового спирта (ПВС) в деионизированной воде. Перемешать решения при 50 ° С, до момента отрыва, это может занять несколько часов. Готовят раствор 2% объем / объем изопропилового спирта в деионизированной воде.
2. Готовят водный раствор гидрофильного желаемого белка. В таблице ниже приведены примеры формулировок.

Таблица 1:. Пример белковых растворов следующие белковые растворы успешно инкапсулируются и electrospun с использованием этого протокола. Другие гидрофильные белковые растворы могут быть использованы при необходимости.

3. Поместите 40 мл 0,5% раствора ПВА в 50 мл центрифужную пробирку и отложите в сторону.
4. В 15 мл центрифужную пробирку растворить 300 мг 65:35поли (молочной-со-гликолевой кислоты) (PLGA), в 3 мл дихлорметана. Вихревой смеситель может быть использован для ускорения растворения PLGA.
5. Объединить 200 мкл раствора белка и 4 мкл 2% раствора PVA. Вылейте белка смесь в раствор PLGA (шаг 1,4). Решения останется в основном отдельно.
6. Поместите пробирку в стакан воды со льдом. Используя палочку ультразвукового при ~ 10 Вт (RMS), не агитировать решение в течение нескольких секунд (5-10) до получения однородной кремово-белые эмульсии создается.
7. Налейте эмульсии в 50 мл пробирку, содержащую 0,5% PVA (этап 1.3). Смешайте раствор на высокой скорости на вортексе для ~ 20 сек. Решение будет развиваться мутный вид.
8. Эмульсию переносили в химический стакан 200 мл и место на магнитной мешалки при 350 оборотах в минуту в течение 2 мин. Добавить 50 мл 2% изопропилового спирта в стакан на мешалке. Смесь оставляют продолжают перемешивание в течение не менее 1 часа, чтобы позволить, чтобы испарить DCM и PLGA, чтобы затвердеть.
9. Передача тОн микросфер раствор в центрифужные пробирки.
10. Центрифуга при 425 мкг в течение 3 мин. Микросферы будет собирать на дне пробирки, и появляется белая. Осторожно удалите супернатант из трубы, выше микросфер, и хранить в бутылке 500 мл.
11. Промыть микросферы с деионизированной воды на заполнение трубы три четверти полный и встряхивая его, чтобы перераспределить микросфер в жидкости.
12. Повторите шаги 1,10 и 1,11 в четыре раза.
13. После окончательного полоскания, удалите супернатант снова и место в бутылке 500 мл с другими образцами. Замораживание микросферы, полученные в центрифужную пробирку, а затем лиофилизуют в течение по крайней мере 24 часов.
14. Визуализация микросферы под световым микроскопом или с помощью сканирующего электронного микроскопа. Микросферы размером не более 60 мкм являются для эффективного электропрядения. Если микросферы являются слишком большими, более длинные ультразвуком или вортексе раз может потребоваться на этапе 1,6 или 1,7.
<литий> Храните высушенные микросферы в -20 ° C морозильник.
15. Дополнительно: Используйте анализа белка, в соответствии с инструкциями производителя, чтобы проверить количество белка в бутылке 500 мл с шага 1,10 ^30. Это используется, чтобы вычислить процент инкапсулированного белка в микросферах, путем вычитания количества в растворе от того, что был использован в процессе производства.

Примечание: Чтобы визуализировать расположение белка в микросферы добавить родамин 2 мкг / мл в растворе PLGA ³¹ и инкапсулировать FITC конъюгированного белка 1 показан пример..

2 электропрядения с микросфер

1. Перед подготовкой электроформования решение, создать 0,5% вес / об раствора фотоинициатора, в деионизированной воде при растворении при 37 ° С. Этот процесс может занять несколько часов.
2. Создание 2% вес / объем метакрилированные гиалуроновой кислоты (MEHA) (см Burdick и соавт. Для синтеза) ^29, 3%вес / объем 900 кДа поли (этиленоксид) (ПЭО) и 0,05% вес / об раствора инициатора фото в деионизированной воде.
   1. Рассчитать необходимое количество Меха и ПЭО для требуемого объема. Например, 10 мл электропрядения решение требует 200 мг MEHA и 300 мг ПЭО.
   2. Растворить ПЭО в деионизированной воде при 90% от требуемого конечного объема (9 мл на данном примере). Это может занять несколько часов, нагревают мешалка или водяной бане при 37 ° С может быть использован для ускорения процесса.
   3. Затем добавьте Меха и использовать вихревой смеситель для перемешивания раствора до ясно. Это займет всего несколько минут.
   4. Наконец добавить 0,5% раствор фото инициатора заполнить оставшийся объем 10% (1 мл на этом примере).
3. Добавить микросфер в нужной концентрации до 400 мг / мл. Смешайте раствор на вихревом смесителе до тех пор, микросферы не будут равномерно распределены в растворе.
4. Перенесите раствор в шприц и присоединить 6 дюймовый 18 калибра блЕНТ кончик иглы.
5. Поместите шприц в шприцевой насос и установить его обойтись в 1,2 мл / час.
6. Лента слой алюминиевой фольги по сбору пластины или оправки. Это позволяет легко чистить и хранения готовой эшафот. Вращающейся оправки используется для создания выровненных волокон. Плоской пластины или стационарный сердечник приведет к случайным образом расположенных волокон.
7. Подключите провод заземления от источника питания высокого напряжения к устройству сбора. Подключите положительный вывод к игле.
8. Регулировка шприцевой насос, и сбора поверхность таким образом, что существует 15 см между кончиком иглы и поверхности сбора.
9. Начните полимерной накачки, когда решение видна в конце шприца, включите источник напряжения и установить напряжение до 24 кВ. Внимание: После того, как напряжение включен не прикасайтесь к металлическим частям системы. Зарядка может также перейти на короткие расстояния от электрифицированных частей к коже.
10. Запустите решение до гesired толщина леса достигается. После завершения отключите источник напряжения и шприцевой насос.
11. Удалить фольгу с эшафот прилагается. Заполненные леса, содержащие белок, хранятся в -20 ° C морозильник.

3 Белки Биоактивность Тестирование

1. Подготовка питательных сред клеток. Добавить 10% об / об эмбриональной телячьей сыворотки, 1% об / об L-глутамина и 1% объем / объем пенициллин-стрептомицин в модифицированную по способу Дульбекко среде Игла в.
2. Выберите покровные стекла, которые соответствуют полностью в луночного планшета.
3. Использование 3- (триметоксисилил) пропилметакрилат для лечения покровные, как описано производителем. Methacrylation повышает эшафот приверженность покровные.
4. Прикрепите метакрилированные покровные в области сбора в electrospinner со съемной двухсторонней ленты перед электропрядения. Спиннинг на покровные облегчает обработку и осмотр.
5. Electrospin до желаемой толщины, как описано выше.
6. осле электропрядения осторожно удалите покровные от оправки. Поместите на эшафот покровные покрытием в ясный камеры азота и убедитесь, что весь кислород продувается.
7. Поместите камеру и эшафот под 10 мВт / см ² 365 нм света в течение 15 мин. После сшивания место в соответствующего размера пластины а. Убедитесь, что эшафот стороной вверх.
8. Место леса под бактерицидной лампой в течение 30 мин для стерилизации. При желании фибронектина или другого белка, используется в качестве покрытия, чтобы усиливать адгезию клеток. Следуйте инструкциям производителя для покрытия строительных лесов.
9. Урожай ганглии задних корешков (DRG), как описано ранее Холленбек ^32. Один DRG будут необходимы для каждого лесов покрыты покровным испытания.
10. Поместите 100-200 мкл СМИ на каждом эшафот в пластине также. Осторожно поместите одну DRG на каждом эшафот в медиа-капли. Для толстой эшафот могут быть необходимы больше средств массовой информации; DRG должны быть полностью погружен, а не floaтин.
11. Выдержите на эшафот и DRG на 37 ° С в течение 4 часов, чтобы позволить сотовый придерживаться на эшафот.
12. Заполните СМИ до соответствующего уровня для колодца и поместить обратно в инкубатор. Продолжить инкубации в течение 4-6 дней.
13. После инкубационного периода тщательно удалять из каждой лунки и осторожно мыть один раз с PBS. Закрепить клетки в течение 30 мин с использованием 4% вес / об параформальдегида.
14. Пятно клетки, использующие пятно антитела для нейрофиламентов. Это позволит визуализировать из нейритов для количественного определения. DAPI также может быть использован для просмотра ядра клеток. Протокол пример окрашивание описывается Sundararaghavan и коллег ^14.
15. Визуализация клеток с использованием флуоресцентного микроскопа.
    1. Поместите планшет, на столик микроскопа.
    2. Найдите клеточной массы с помощью фильтра и возбуждения настройки для DAPI.
    3. После того, как клетки является переключение фильтра для FITC визуализировать расширенные нейриты. Uпеть функцию стежка на микроскопом собирать и объединять столько изображений, сколько необходимо, чтобы увидеть всю структуру. Повторите эти действия для DAPI, FITC и светлом поле.

Микросферы 50 ± 14 мкм в диаметре со инкапсуляции белка более 85% были последовательно производятся и electrospun в каркасах. Размер определялась визуализации образцы микросфер из трех отдельных производственных партий. Образы, где захваченные на оптическом микроскопе и длины, где определяли с помощью коммерческого программного обеспечения лаборатории. Рисунок 1 показана гистограмма распределения по размерам. Скорость Инкапсуляция также тестировали из трех отдельных партий микросфер, путем количественного определения белка, которые избежали в процессе производства.

Рисунок 2 показывает репрезентативные микросферы родамин (2 мкг / мл) в PLGA оболочки и бычий сывороточный альбумин (БСА) -FITC инкапсулированного пределах. Снимки были сделаны с помощью флуоресцентного микроскопа. Оболочка может быть хорошо видно (красный) с белком сосредоточено на интерьере (зеленый).

Для оценки инкапсуляции, микросферыс были заполнены BSA и протестированы на белок с выпуском анализа Брэдфорда. ПМГК ломается путем гидролиза эфирных связей, создавая большие пробелы для белка побега. Микросферы продолжать выпускать более 60 дней (рисунок 3). Выпуск начинается с первоначальный выброс затем продолжает как микросферы сломать.

После электропрядения микросферы можно увидеть по всей 3D волокнистой структуры. Рисунок 4 показана СЭМ-изображение полной строительные леса, где сферы можно увидеть в несколько слоев (указаны стрелками). Распределение микросфер в каркасах было измерено, 15,3 ± 3,6 сфер / мм 2. Каркас имеет микросфер в месте, предотвращающие миграцию от целевого сайта. Как микросферы сломать они выпускают NGF в эшафот поощрять отрастание 33,34 роста. Это создает постоянную доставку белка в течение эшафоте поддержать рост клетки и стимулируют клетки проникнуть в эшафот.

И, наконец, ганглии задних корешков (DRG) были использованы для проверки жизнеспособности NGF в микросферах, в строительные леса. 5 показана DRG высевали на леске, содержащей микросферы, загруженные с NGF рядом с одной содержащих микросфер, без белка в них. Есть длинные расширения нейритов видимые, идущие от DRG на эшафоте NGF, указывая, что NGF остаются жизнеспособными и стимулирования роста.

Рис.1 Microsphere распределение размера. Микросферы, производимые этого протокола 50 ± 14 мкм в диаметре. На графике показана гистограмма диаметра микросфер в 5 мкм бункеров.

2highres.jpg "/>
Рисунок 2 флуоресцентное изображение микросфер. 2 мкг / мл родамина был включен в решении ПМГК визуализировать микросфер оболочку (красный) и BSA-FITC было помещено для того чтобы визуализации белка (зеленый). Белок можно ясно увидеть в сферу. Шкала бар = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3 Белок выпуска Кривая. BSA релиз из микросфер более 60 дней измеряли с помощью анализа Брэдфорда. Первоначальный выброс, вероятно, связано с БСА, который был прикреплен к внешней поверхности. Как PLGA ломается, белок высвобождается в течение долгого времени.

/ftp_upload/51517/51517fig4highres.jpg "/>
Рисунок 4 Эшафот содержащий микросферы. Процесс электропрядения позволяет микросферы, которые будут включены по всей глубине эшафот. (A) стрелки, которые показывают расположение микросфер. Шкала бар = 500 мкм. (В) высокого увеличенное изображение одной микросферы с нановолокон Из сказанного выше строительные леса. Шкала бар = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис.5 NGF Биоактивность испытаний. Ганглии задних корешков первичные клетки собирали из 8-дневных куриных яиц и высевали на каркасах с NGF, заполненных микросфер (А) или пустые микросферы (B). DRGsокрашивали с нейрофиламентов антитела, вторичного антитела FITC и DAPI для визуализации клеточных ядер. Изображения показывают увеличение рост аксонов в присутствии ФРН загружалась микросфер, как указано FITC окрашенных нейритах (зеленый). Это показывает выпущен NGF является жизнеспособным и может способствовать росту. Изображения были сделаны с помощью конфокальной микроскопии. Шкала бар = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.