Здесь мы представляем протоколы культивирования человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC), основанные на монослое неколониального типа (NCM) диссоциированных одиночных клеток. Этот новый метод, использующий Rho-ассоциированные ингибиторы киназы или изоформу ламинина 521 (LN-521), подходит для производства большого количества гомогенных hPSCs, генетических манипуляций и разработки лекарств.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Альтернативные Культуры для человека плюрипотентных стволовых клеток производство, техобслуживание, и генетический анализ
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) имеют большие перспективы для регенеративной медицины и биофармацевтических приложений. В настоящее время оптимальная культура и эффективное увеличение большого количества ПСК клинической степени являются критическими вопросами в терапии на основе ПССК. Как правило, hPSCs размножаются колониями как в фидерных, так и в безфидерных системах культивирования. Однако эти методы имеют несколько существенных ограничений, в том числе низкий выход клеток и генерацию гетерогенных дифференцированных клеток. Для улучшения существующих методов культивирования hPSC мы недавно разработали новый метод, который основан на монослойном культуре неколониального типа (NCM) диссоциированных одиночных клеток. Здесь мы представляем подробные протоколы NCM, основанные на ингибиторе Rho-ассоциированной киназы (ROCK) Y-27632. Мы также предоставляем новую информацию о культуре NCM с различными малыми молекулами, такими как Y-39983 (ингибитор ROCK I), фенилбензодиоксан (ингибитор ROCK II) и тиазовавин (новый ингибитор ROCK). Кроме того, мы расширяем наш базовый протокол для культивирования hPSCs на определенных внеклеточных белках, таких как изоформа ламинина 521 (LN-521), без использования ингибиторов ROCK. Кроме того, на основе НКМ мы продемонстрировали эффективную трансфекцию или трансдукцию плазмидных ДНК, лентивирусных частиц и микроРНК на основе олигонуклеотидов в ПСК с целью генетической модификации этих клеток для молекулярного анализа и разработки лекарств. Методы, основанные на НКМ, преодолевают основные недостатки культуры колонийного типа и, таким образом, могут быть пригодны для производства больших количеств гомогенных ПСК для будущих клинических терапий, исследований стволовых клеток и разработки лекарств.
Введение
Емкость hPSCs дифференцировать к мультилинейной взрослых тканей открывает новые возможности для лечения пациентов, страдающих от тяжелых заболеваний, которые связаны с сердечно-сосудистой, печени, поджелудочной железы, и неврологические системы 1-4. Различные типы клеток, полученные из hPSCs также обеспечит надежные сотовые платформы для моделирования заболевания, генной инженерии, скрининга лекарственных средств и токсикологические испытания 1,4. Ключевой вопрос, который обеспечивает их будущие клинические и фармакологические приложений является генерация большого числа клинико-класса hPSCs через в пробирке культуре клеток. Тем не мене....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Одноклеточный основе не-колония Тип монослой (NCM) культура hPSCs.
1. Подготовка
- Сделать 500 мл среды для культуры мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs): DMEM среде, содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина и 0,1 мМ заменимых аминокислот (NEAA).
- Изолировать мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) клетки, полученные из штамма CF1 после обычного протокола 16 и культуры MEFs на 0,1% желатин покрытием клеточной культуральной пластины 6-луночный в DMEM среде. Кроме того, приобрести акции MEF при прохождении 3 из коммерческих ресурсов.
- Подготовка Матригель пластины.
- Развести 5 мл чЭСК квалифи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Общая схема NCM культуры
Рисунок 1 представляет собой типичный NCM культуры схему, показывающую динамических изменений hPSCs после высокой плотности посева одноклеточных в присутствии ингибитора ROCK Y-27632. Эти морфологические изменения включают межклеточные связи после посева, образование сотовой кластеров, и экспоненциальный рост клеток с последующей конденсацией клеток (рис. 1А). Представитель эксперимент показывает, WA01 (H1) ЭСК, высе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть два основных пути к культуре hPSCs в пробирке: обычные колонии типа культуры (ячеек на фидерах или внеклеточных матриц) и подвеска культура hPSCs как агрегатов без фидеров 6. Ограничения и колонии типа подвески и методами культивирования включают накопленный неоднородность и наследуемые эпигенетические изменения. NCM культура, на основе как пассажей одноклеточных и обшивки высокой плотности клеток, представляет собой новый метод культуры для HPSC роста 6,18. Хотя различные методы одно.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Программой внутренних исследований Национальных институтов здравоохранения (NIH) в Национальном институте неврологических расстройств и инсульта. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Рональда Д. Маккея за его обсуждение и комментарии по этому проекту.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Графиня автоматизированный счетчик клеток | Invitrogen Inc. | C10227 | Автоматический подсчет ячеек |
| Факситронный шкаф Рентгеновская система | Факситронная рентгеновская корпорация, Уилинг, Иллинойс; | Модель RX-650 | Рентгеновское облучение MEFs |
| MULTIWELL 6-луночные планшеты | Becton Dickinson Labware | 353046 | полистирольные пластины |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965– 092 | Для среды MEF |
| Mitomycin C | Roche | 107409 | ингибитор митоза |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | Для диссоциации MEF |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330– 032 | Для hPSC medium |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Инвитроген Инк. | 31985-062 | Для трансфекции hPSC |
| термоинактивированный FBS | Invitrogen Inc. | 16000– 044 | Компонент MEF medium |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen Inc. | 10828– 028 | KSR, Компонент hPSC среды |
| Dulbecco' s Фосфатно-буферный физиологический раствор | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, без Ca2+/Mg2+ |
| Заменимые аминокислоты | Invitrogen | 11140– 050 | NEAA, компонент среды hPSC |
| L-глутамин | Invitrogen | 25030– 081 | Компонент среды hPSC |
| mTeSR1 & Добавки | StemCell Technologies | 5850 | Animal protein-free |
| TeSR2 & Добавки StemCell | Technologies | 5860 | Среда без ксено-бета |
| ;-меркаптоэтанола | Sigma | M7522 | Компонент hPSC средний |
MEF (CF-1) ATCC | Американская коллекция типовых культур (ATCC) | SCRC-1040 | Для фидерной культуры hPSCs сертифицированный |
| hESC-сертифицированный Matrigel | BD Bioscience | 354277 | Для фидерной культуры hPSCs |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | Человеческий рекомбинантный белок |
| FGF-2 (рекомбинантный FGF, базовый) | R& D Systems, MN | 223-FB | Фактор роста в среде hPSC |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X Смешанный ферментативный раствор |
| Ингибитор JAK I | EMD4 Biosciences | 420099 | Ингибитор янус-киназы |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | Ингибитор ROCK |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | Ингибитор ROCK |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | Ингибитор ROCK I |
| Фенилбензодиоксан | Stemgent | 04-0030 | Ингибитор ROCK II |
| Тиазовивин | Stemgent | 04-0017 | Новый ингибитор ROCK |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 &; m клеточный фильтр |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 ° C | Thermo Scientific | C6516F-1 | "Мистер Фрости" Контейнер для заморозки |
| Липофектамин 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Реагенты для трансфекции |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | Реагент для трансфекции |
| Нецелевые miRIDIAN miRNA Transfection Control | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Меченый Dy547, для контроля доставки микроРНК |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | Для определения | лентивирусного вектора |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Входит в каждый набор для трансфекции | Экспрессия плазмиды для контроля трансфекции |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Мышь IgG2b, плюрипотентный маркер |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Мышь IgM, маркер дифференцировки |
| SSEA-4 | Santa Cruz Биотехнология | sc-21704 | Мышь IgG3, плюрипотентный маркер |
| Tra-1-60 | Santa Cruz | Биотехнология sc-21705 | Мышиный IgM, плюрипотентный маркер |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | Мышь IgM, плюрипотентный маркер |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | Мышь IgG1, против цитокератина 8 |
| &альфа;-фетопротеина | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, мышь IgG2a |
| HNF-3β (-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, козье поликлональное антитело |
| тропонин T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | мышиное IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Япония | RCAB0004P-F | Поликлональное антитело |
| Крысиный анти-GFAP | Zymed | 13-0300 | Глиальный фибриллярный кислый белок |
| альбумин (клон HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | Мышь IgG1 |
| Гладкомышечный актин (клон 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | Мышь IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Кролик поликлональное антитело |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, мышь IgG2a |
| HNF4&альфа; (С11Ф12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Моноклональное антитело |
| Параформальдегид (раствор) | Электронная микроскопия наук | 15710 | PFA, фиксатор, разведенный в D-PBS |
Ссылки
- Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
