Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Альтернативные Культуры для человека плюрипотентных стволовых клеток производство, техобслуживание, и генетический анализ

12.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51519

⸱

24 июля 2014 г.

 ,  ,  , 
1NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протоколы культивирования человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC), основанные на монослое неколониального типа (NCM) диссоциированных одиночных клеток. Этот новый метод, использующий Rho-ассоциированные ингибиторы киназы или изоформу ламинина 521 (LN-521), подходит для производства большого количества гомогенных hPSCs, генетических манипуляций и разработки лекарств.

Аннотация

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) имеют большие перспективы для регенеративной медицины и биофармацевтических приложений. В настоящее время оптимальная культура и эффективное увеличение большого количества ПСК клинической степени являются критическими вопросами в терапии на основе ПССК. Как правило, hPSCs размножаются колониями как в фидерных, так и в безфидерных системах культивирования. Однако эти методы имеют несколько существенных ограничений, в том числе низкий выход клеток и генерацию гетерогенных дифференцированных клеток. Для улучшения существующих методов культивирования hPSC мы недавно разработали новый метод, который основан на монослойном культуре неколониального типа (NCM) диссоциированных одиночных клеток. Здесь мы представляем подробные протоколы NCM, основанные на ингибиторе Rho-ассоциированной киназы (ROCK) Y-27632. Мы также предоставляем новую информацию о культуре NCM с различными малыми молекулами, такими как Y-39983 (ингибитор ROCK I), фенилбензодиоксан (ингибитор ROCK II) и тиазовавин (новый ингибитор ROCK). Кроме того, мы расширяем наш базовый протокол для культивирования hPSCs на определенных внеклеточных белках, таких как изоформа ламинина 521 (LN-521), без использования ингибиторов ROCK. Кроме того, на основе НКМ мы продемонстрировали эффективную трансфекцию или трансдукцию плазмидных ДНК, лентивирусных частиц и микроРНК на основе олигонуклеотидов в ПСК с целью генетической модификации этих клеток для молекулярного анализа и разработки лекарств. Методы, основанные на НКМ, преодолевают основные недостатки культуры колонийного типа и, таким образом, могут быть пригодны для производства больших количеств гомогенных ПСК для будущих клинических терапий, исследований стволовых клеток и разработки лекарств.

Введение

Емкость hPSCs дифференцировать к мультилинейной взрослых тканей открывает новые возможности для лечения пациентов, страдающих от тяжелых заболеваний, которые связаны с сердечно-сосудистой, печени, поджелудочной железы, и неврологические системы 1-4. Различные типы клеток, полученные из hPSCs также обеспечит надежные сотовые платформы для моделирования заболевания, генной инженерии, скрининга лекарственных средств и токсикологические испытания 1,4. Ключевой вопрос, который обеспечивает их будущие клинические и фармакологические приложений является генерация большого числа клинико-класса hPSCs через в пробирке культуре клеток. Тем не менее, в настоящее время системы культуры либо недостаточны, либо по своей сути переменная, с участием различных фидерных и фидерных без культуры hPSCs как колоний 5,6.

Рост колоний тип hPSCs акций многие структурные особенности внутренней клеточной массы (ICM) ранних эмбрионов млекопитающих. ICM склонна к дифференцировке в трех зародышевых слоевв многоклеточного среды из-за существования гетерогенных градиентов сигнализации. Таким образом, приобретение неоднородности в начале эмбрионального развития рассматривается как необходимого процесса дифференциации, но нежелательный особенностью HPSC культуры. Неоднородность в HPSC культуры часто бывают вызваны чрезмерным апоптотических сигналов и спонтанной дифференцировки из-за неоптимальных условий роста. Таким образом, в колонии типа культуры, гетерогенные клетки часто наблюдаются на периферии колоний 7,8. Было также показано, что клетки человеческого эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) колонии экспонат дифференциальные ответы на сигнальные молекулы, такие как BMP-4 9. Более того, методы колония культуры производят низкие урожаи клеток, а также темпы восстановления очень низкая клеток от криоконсервации из-за неконтролируемых темпов роста и апоптоза сигнальных путей 6,9. В последние годы в различных суспензионных культур были разработаны для культивирования hPSCs, particulарли для расширения больших количеств hPSCs в фидерной и матричных без условий 6,10-13. Очевидно, разные системы культуры имеют свои преимущества и недостатки. В общем, гетерогенный характер hPSCs представляет собой один из основных недостатков в колонии типа и агрегированный культуры методов, которые субоптимальным для доставки ДНК и РНК материалов в hPSCs для генной инженерии 6.

Очевидно, что существует настоятельная необходимость в разработке новых систем, которые обойти некоторые недостатки существующих методов культивирования. Открытия низкомолекулярные ингибиторы (например, ROCK ингибитор Y-27632 и JAK ингибитора 1), которые улучшают выживаемость одноклеточные проложить путь к диссоциирован-HPSC культуры 14,15. С использованием этих малых молекул, мы недавно разработали метод культуры, основанной на не-колонии типа (NCM) рост диссоциированных-hPSCs 9. Этот новый метод культура сочетает в себе пассирование одноклеточные и высокой плотностиПокрытие методы, что позволяет нам производить большое количество однородных hPSCs под последовательных циклов роста без серьезных хромосомных аномалий 9. Кроме того, NCM культура может быть реализована с различными малых молекул и определенных матриц (например, ламининами), чтобы оптимизировать способ культивирования для широкого применения. Здесь мы представляем несколько подробных протоколов на основе NCM культуры и разграничить подробные процедуры для генной инженерии. Чтобы продемонстрировать универсальность протоколов NCM, мы также протестировали NCM культуру с разнообразными ингибиторов ROCK и с одной ламинином изоформы 521 (то есть, LN-521).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Одноклеточный основе не-колония Тип монослой (NCM) культура hPSCs.

1. Подготовка

  1. Сделать 500 мл среды для культуры мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs): DMEM среде, содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина и 0,1 мМ заменимых аминокислот (NEAA).
  2. Изолировать мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) клетки, полученные из штамма CF1 после обычного протокола 16 и культуры MEFs на 0,1% желатин покрытием клеточной культуральной пластины 6-луночный в DMEM среде. Кроме того, приобрести акции MEF при прохождении 3 из коммерческих ресурсов.
  3. Подготовка Матригель пластины.
    1. Развести 5 мл чЭСК квалифицированных Матригель складе с 5 мл среды DMEM/F12 (охлажденный при ~ 4 ° С) и хранить в виде 50% в аликвотах -20 ° C морозильник. Разморозить замороженный Matrigel запас в холодильнике (~ 4 ° С) O / N и далее разбавить Матригель в холодной среде DMEM/F12 (рождать рабочей концентрации 2,5%).
      2. Пальто 6-луночные планшеты для культивирования клеток с 1,5 мл 2,5% Матригель на лунку, хранить покрытых пластин в холодильник O / N (Примечание: используйте пластину на Матригель покрытием в течение 2 недель).
    2. Снимите Matrigel тарелку из холодильника, дайте пластины, чтобы нагреть при комнатной температуре в капот культуре клеток для 10 до 30 мин (Примечание: не согреть пластину в инкубаторе для клеточных культур) и аспирации DMEM среде перед покрытием hPSCs.
  4. Сделать 500 мл чЭСК среды: 80% среде DMEM/F12, 20% КСР, 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, и 4 нг / мл FGF-2.
  5. Подготовка 10 мл 2X HPSC морозильной среды: 60% FBS, 20% DMSO, 20 мкМ и Y-27632 в mTeSR1 среды, стерилизуют фильтрацией и используют среду в течение 1 недели.

. 2 Протокол 1 (Начальный): Расти HPSC колонии на Кормушки

  1. Используйте MEF номера проход с 5 или 6 (обозначен p5 и p6) для HPSC культуры для того, чтобы получить последовательную РЕЗУЛЬТАТОВц. Митотически инактивировать MEFs обработкой клеток с 10 мкг / мл митомицина С в течение 3 часов при 37 ° С, промыть клетки 3x с 1X Дульбекко забуференном фосфатом физиологическом растворе (D-PBS), а затем отделить MEFs с 0,05% трипсина в 0,53 мМ EDTA. С другой стороны, облучать MEFs в дозе 8000 рад с рентгеновской излучателем.
  2. Количество чисел клеток с помощью метода Трипановый синевы исключения под микроскопом. Кроме того, использование автоматического счетчика клеток.
  3. Пластинчатые облученные MEFs на полистироловых планшетах 6-луночные покрытые с 0,1% желатина при плотности 1,88 × 10 5 клеток на лунку (т.е. 1,96 × 10 4 клеток / см 2). Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 часов.
  4. Снимите MEF культуральной среды путем аспирации с помощью пипетки Пастера (Примечание: никаких шагов мытья необходимые в это время).
  5. Triturate HPSC колонии от предыдущей культуры в небольшие пряди, изучить глыбы под микроскопом, чтобы обеспечить их размеры, начиная фром 50 до 100 мкм в диаметрах, и пластины HPSC глыбы на верхней части MEF фидерных слоев в один хорошо, содержащих 2 мл HPSC среды.
  6. Изменение чЭСК среднего ежедневно в течение 3 до 5 дней, роста колоний записи на фотографии и не отмечают никаких морфологически измененных или дифференцированные колонии (~ 5%), так и вручную удалить отмеченные колонии, осторожно стремление с помощью пипетки Пастера.
  7. Промойте оставшиеся колонии на MEFs два раза (2 мин каждый с D-PBS), и инкубировать колонии с 2 мл 1 мг / мл коллагеназы IV в HPSC среды для 10 до 30 мин), и изучить отряд HPSC колоний от поверхность MEF покрытием (Примечание: используйте скребок, чтобы помочь отряд процесс, только если колонии плотно прикреплена к пластине).
  8. Добавить 5 мл HPSC среды в каждую лунку, чтобы минимизировать ферментативных реакций, колонии перевода к 15 мл трубки, позволяют HPSC колонии для осаждения для 3 до 5 минут при комнатной температуре, а также обеспечить осаждение колоний прямой визуализации слоктей в нижней части трубки (примечание: не центрифуге трубки на этом этапе).
  9. Удалить надосадочную жидкость, содержащую остаточные MEFs и диссоциированных отдельные клетки, ресуспендируйте колонии 5 мл чЭСК среды, и повторите шаг оседания дважды.
  10. Удалить среды, растирают колонии HPSC на мелкие сгустки, магазин в 1X HPSC замерзания среды (или CryoStore CS10 замерзания среды) для криоконсервации (1 сливная хорошо за замороженной флакона) или пластины на 6-луночный планшет для сотового пассажей.

3 Протокол 2:. Преобразование HPSC колонии от Кормушки для NCM

  1. Промыть HPSC гранул в D-PBS один раз, инкубировать гранул с 1 мл 1X Accutase в течение 10 мин, и изучить ферментативную реакцию под микроскопом, чтобы обеспечить одно-клеточной диссоциации.
  2. Прекратить ферментативных реакций, осторожно ресуспендирования клеток в 5 мл mTeSR1 среде, содержащей 10 мкМ Y-27632 с последующим центрифугированием при 200 х г при комнатной температуре в течение 5 мин(Примечание, не используйте слишком центрифугирования силы, которые вызывают повреждения клеток).
  3. Добавить 5 мл mTeSR1 среды к осадку, ресуспендируют осадок в виде отдельных клеток, и фильтр в отрыве клеток через клеточный фильтр (для удаления любых остаточных агрегаты клеток) 40 мкм.
  4. Семенной 1.3-2 х 10 6 hPSCs в одну лунку (1,4-2,1 х 10 5 клеток / см 2) 6-луночный планшет, покрытый 2,5% чЭСК квалифицированных Матригель, добавить mTeSR1 среды до 2,5 мл, и включают в себя 10 мкм Y-27632 в среде (для облегчения начального 24 часами покрытие с одной ячейкой). Кроме того, использовать следующие малые молекулы, чтобы заменить 10 мкм Y-27632 для повышения обшивки одноклеточных: 1 мкм Y-39983 (РОК я ингибитора), 1 мкМ phenylbenzodioxane (ингибитор ROCK II), 1 мкМ thiazovivin (новый ингибитор ROCK) , и ЯК ингибитор 2 мкМ 1.
  5. Замените среду с без наркотиков mTeSR1 среды на следующий день (в течение 24 часов), отделить клетки от одного дополнительногону, и считать количество клеток для определения эффективности посева с одной ячейкой (Примечание: примерно, от 50 до 90% от одноклеточного эффективности нанесения покрытия, что может быть достигнуто на данном этапе).
  6. Разрешить клетки расти как одноклеточные сформированный монослой в течение нескольких дней с 3 мл mTeSR1 среды. Изменение средней ежедневно.
  7. Эмпирически определить график пассажей, выполненный с NCM в зависимости от плотности клеток. Прохождение когда рост клеток достигает слияния в день 3 или 4 дня, или в момент времени 4 часа после исчезновения клетки к клетке границ. Диссоциируют клеток в 1 мл Accutase, использовать от 1 до 3 соотношение расщепления (т.е. 1 Конфлюэнтные хорошо клеток высевали в 3 лунки 6-луночный планшет) для клеток пассажей, и стабилизировать адаптированный NCM на 5 проходов.
  8. Сотовый замерзания
    1. Используйте один сливающийся хорошо (~ 5-6 x10 6 клеток) в течение одного замороженного флаконе: отделить клетки от одной сливной хорошо с 1 мл Accutase в течение 10 мин.
    2. Развести жIth 5 мл mTeSR1 средних и центрифуги клеток, как описано выше.
    3. Ресуспендируют осадок в 500 мкл среды mTeSR1, а затем медленно добавить 500 мкл 2X HPSC морозильной среде (содержащей 20 мкм Y-27632) в криоконсервации флаконе. Кроме того, ресуспендирования клеток в 1X HPSC морозильной среде, содержащей 2 мкМ ингибитор JAK 1 или 1x CryoStor CS10 среды в присутствии либо 10 мкМ Y-27632 или 2 мкМ ингибитор JAK 1.
    4. Поместите замороженные флаконы в охлажденного льдом Криорезервуар (снизу заполнены isopranol) и немедленно передать Криорезервуар к -80 ° C морозильник.
    5. Передача клетки из -80 ° C морозильник в баке жидкого азота (на следующий день) для долгосрочного криоконсервации.
  9. Сотовый оттаивания
    1. Используйте один криоконсервации флакон для посева 1 колодец 6-луночный планшет.
    2. Предварительно тепло mTeSR1 среда в ванну с водой 37 ° C в течение 10 мин оттаивания клеток в той же водяной бане в течение 2 мин,каплям добавляют клетки в 5 мл подогретого mTeSR1 среде, содержащей 10 мкМ Y-27632, и центрифуга как описано выше.
    3. Аккуратно ресуспендирования осадка клеток с 2 мл mTeSR1 среде, содержащей 10 мкМ Y-27632 и медленно передавать клетки хорошо предварительно покрывают Матригель (Примечание: избежать получения пузырьков воздуха).
    4. Изменение средней ежедневно и ожидаем, что рост HPSC достичь слияния в день 3 или 4.

4 Протокол 3:. Преобразование HPSC колонии на Матригель к NCM культуры

  1. Удалить пластину с Матригель покрытием из холодильника, поместите пластину в капот культуры ткани от 10 до 30 мин, удалить среды из каждой лунки пластины, и добавить 2 мл подогретого mTeSR1 среды в каждую лунку.
  2. Передача растирают HPSC комки из питателя культуры (этап 2.10 базового протокола) к вышеуказанному Matrigel пластины. Добавить mTeSR1 среды до 2,5 мл конечного объема в каждую лунку.
  3. Изменение средней в день в течение 3 до 4 дняс до колоний достичь от 80 до 90% слияния.
  4. Для клеток пассажей: промыть колонии с D-PBS в два раза, лечить клетки с 1 мл 2 мг / мл диспаза при 37 ° С в течение от 15 до 20 мин, и донного осадка и прохождение клетки как сгустки.
  5. Для NCM культуры: повторите шаги 3,1 до 3,9 описано в Протоколе 2.

5 Протокол 4:. NCM Культура hPSCs на LN-521

  1. Разморозить рекомбинантный LN-521 раствор при 4 ° С до дня применения и сделать раствор ламинин покрытия (ЖК) путем разбавления талой ламинин с 1X D-PBS (содержащий Ca 2 + / Mg 2 +) в конечной концентрации 10 мкг / мл.
  2. Добавьте 1 мл ЛСК в одной скважины в 6-луночный планшет (примечание: избежать сухого во время процесса нанесения покрытия).
  3. Закройте покрытием тарелку с парафильмом для предотвращения испарения и хранить пластинку в холодильнике (4 ° С) O / N (примечание: использовать пластину в течение 1 недели).
  4. Аккуратно удалите LCS с пипетки Пастера без чтобыuching поверхность, покрытую и добавить 2 мл mTeSR1 среде одной яме.
  5. Теплый все культуры растворы (в том числе D-PBS) в ванну с водой 37 ° C в течение 25 мин.
  6. Преобразование HPSC колонии в NCM
    1. Диссоциируют клеточных агрегатов в одиночных камерах с Accutase, как описано в Протоколе 2.
    2. Семенной 1.3-2 х 10 6 hPSCs в один LN-521-лунке (1,4-2,1 х 10 5 клеток / см 2), не присутствии ингибиторов ROCK.
    3. Изменение средней в день в течение 3-х до 4 дней.
    4. Диссоциации клеток в 1 мл Accutase в день 3 или 4 для следующего пассирования клеток с соотношением сторон 1 до 3 расщепления.

. 6 Протокол 5: NCM Культура для плазмиды ДНК трансфекции

  1. Адаптация HPSC колонии NCM культуры, как описано в Протоколах 2 до 4.
  2. Тарелка диссоциирован hPSCs в 12-луночный планшет с клеточной плотности 7,5 х 10 5 клеток / лунку в mTeSR1 среде в присутствии 10 мкМ Y-27632.
  3. Заменить mTeSR1 среду с без наркотиков mTeSR1 среды между 4-8 ч после посева клеток.
  4. Для каждой трансфекции, развести 2,5 мкг плазмид экспрессии (например, pmaxGFP) и 5 мкл Lipofectamine 2000 в отдельных пробирки Эппендорф в 125 мкл каждого из Opti-MEM Снижение сыворотки Средний.
  5. Через 5 мин, смешать разбавленных реагентов и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре (для формирования трансфекции комплексов).
  6. Добавьте 250 мкл трансфекции комплексов в каждую лунку, содержащую hPSCs в 1 мл mTeSR1 среды и инкубируют клетки при 37 ° С в СО 2-инкубаторе в течение 24 часов.
  7. Изучите эффективность трансфекции под флуоресцентным микроскопом и фотографии случайно для расчета фактической эффективности трансфекции.

. 7 Протокол 6: NCM Культура для трансфекции микроРНК

  1. Диссоциируют полуконфлюентного hPSCs на 2-й день в условиях NCM добавлением 1 мл Accutase на лунку в 6 Лунками.
  2. Добавьте 10 мл mTeSR1 среды, чтобы разбавить ферментативных реакций и центрифуги при 200 х г в течение 5 мин.
  3. Ресуспендируют клеточный осадок с mTeSR1 среды, семян клетки при плотности 7,5 х 10 5 клеток на лунку в 12-луночный планшет в mTeSR1 среде, содержащей 10 мкм Y-27632, и пусть клетки приложить в течение 4 часов.
  4. Замените среду с Y27632 без mTeSR1 среды.
  5. Используйте имеющийся в продаже микроРНК (например, не-таргетинга miRIDIAN микроРНК трансфекции управления меченного Dy547). Titrate концентрациях от 0-160 нМ, используя предоставленные реагенты и следуйте инструкциям производителя.
  6. Оптимизация эффективность трансфекции для каждой концентрации в HPSC линий на визуализации флуоресценции Dy547 живых клеток под микроскопом через 24 часа после трансфекции.
  7. Вычислить эффективности трансфекции на основе процента положительных клеток Dy547 над всеми отображаемого клеток.
. TLE "> 8 Протокол 7: NCM Культура для трансдукции лентивирусным вектором

  1. Повторите шаги 7,1 до 7,4 Протокола 6.
  2. Рассчитайте количество вирусных частиц, которые будут использоваться для трансдукции: Используйте следующую формулу: ТУ = (МВД х CN) / VT, а ТУ обозначает общее количество преобразования единиц, МВД равна заданной множественности заражения в скважине (МВД или ТУ / элемент), CN определяет количество клеток в каждой лунке, и VT указывает на акции вирусные титры (ТУ / мл). Например, учитывая, что фондовые вирусные титры для SMART-shRNA вектора равна 1 х 10 9 ТУ / мл (трансформирующие единиц на мл), 7,5 х 10 5 клеток на лунку в момент трансдукции и ожидаемый МВД от 20: использовать 15 мкл из вирусных частиц фондовых для каждой скважины (обратите внимание: это условие рекомендуется для переходного индукции лентивирусным).
  3. Предварительно теплые 300 мкл mTeSR1 среде с 10 мг / мл полибрена течение 30 мин.
  4. Добавить 15 мкл фондовых вирусных частиц вподогретого mTeSR1 среду, содержащую полибрен и аккуратно перемешать раствор.
  5. Заменить клеточную культуральную среду 300 мкл предварительно нагретой среде, содержащей вирусные частицы.
  6. После 4 часов инкубации, изучить TurboGFP флуоресценции (производитель для выражения shRNA), чтобы определить эффективность трансдукции.
  7. Добавить 300 мкл дополнительной mTeSR1 среды в преобразовательного хорошо, когда клетки начинают выражать TurboGFP.
  8. После 12-16 часов инкубирования пересмотреть выражение турбо-GFP.
  9. Выполните необходимые эксперименты последующие с этих трансдуцированных клеток в течение 72 часов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общая схема NCM культуры

Рисунок 1 представляет собой типичный NCM культуры схему, показывающую динамических изменений hPSCs после высокой плотности посева одноклеточных в присутствии ингибитора ROCK Y-27632. Эти морфологические изменения включают межклеточные связи после посева, образование сотовой кластеров, и экспоненциальный рост клеток с последующей конденсацией клеток (рис. 1А). Представитель эксперимент показывает, WA01 (H1) ЭСК, высе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Есть два основных пути к культуре hPSCs в пробирке: обычные колонии типа культуры (ячеек на фидерах или внеклеточных матриц) и подвеска культура hPSCs как агрегатов без фидеров 6. Ограничения и колонии типа подвески и методами культивирования включают накопленный неоднородность и наследуемые эпигенетические изменения. NCM культура, на основе как пассажей одноклеточных и обшивки высокой плотности клеток, представляет собой новый метод культуры для HPSC роста 6,18. Хотя различные методы одно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой внутренних исследований Национальных институтов здравоохранения (NIH) в Национальном институте неврологических расстройств и инсульта. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Рональда Д. Маккея за его обсуждение и комментарии по этому проекту.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Графиня автоматизированный счетчик клетокInvitrogen Inc.C10227Автоматический подсчет ячеек
Факситронный шкаф Рентгеновская системаФакситронная рентгеновская корпорация, Уилинг, Иллинойс;Модель RX-650Рентгеновское облучение MEFs
MULTIWELL 6-луночные планшетыBecton Dickinson Labware353046полистирольные пластины
DMEMInvitrogen Inc.11965– 092Для среды MEF
Mitomycin CRoche107409ингибитор митоза
TrypsinInvitrogen Inc.25300-054Для диссоциации MEF
DMEM/F12Invitrogen Inc.11330– 032Для hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Инвитроген Инк.31985-062Для трансфекции hPSC
термоинактивированный FBSInvitrogen Inc.16000– 044Компонент MEF medium
Knockout Serum ReplacementInvitrogen Inc.10828– 028KSR, Компонент hPSC среды
Dulbecco' s Фосфатно-буферный физиологический растворInvitrogen Inc.14190-144D-PBS, без Ca2+/Mg2+
Заменимые аминокислотыInvitrogen11140– 050NEAA, компонент среды hPSC
L-глутаминInvitrogen 25030– 081Компонент среды hPSC
mTeSR1 & ДобавкиStemCell Technologies5850Animal protein-free
TeSR2 & Добавки StemCellTechnologies5860Среда без ксено-бета
;-меркаптоэтанолаSigma M7522Компонент hPSC средний

MEF (CF-1) ATCC		Американская коллекция типовых культур (ATCC) SCRC-1040Для фидерной культуры hPSCs сертифицированный
hESC-сертифицированный MatrigelBD Bioscience354277Для фидерной культуры hPSCs
Laminin-521BioLaminaLN521-02Человеческий рекомбинантный белок
FGF-2 (рекомбинантный FGF, базовый)R& D Systems, MN223-FBФактор роста в среде hPSC
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-1041X Смешанный ферментативный раствор
Ингибитор JAK IEMD4 Biosciences420099Ингибитор янус-киназы
Y-27632EMD4 Biosciences688000Ингибитор ROCK
Y-27632Stemgent04-0012Ингибитор ROCK
Y-39983Stemgent04-0029Ингибитор ROCK I
ФенилбензодиоксанStemgent04-0030Ингибитор ROCK II
ТиазовивинStemgent04-0017Новый ингибитор ROCK
BD Falcon Cell StrainerBD Bioscience35234040 &; m клеточный фильтр
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 ° CThermo Scientific C6516F-1"Мистер Фрости" Контейнер для заморозки
Липофектамин 2000Invitrogen Inc.11668-027Реагенты для трансфекции
DharmaFECT DuoThermo ScientificT-2010-02Реагент для трансфекции
Нецелевые miRIDIAN miRNA Transfection ControlThermo ScientificIP-004500-01-05Меченый Dy547, для контроля доставки микроРНК 
SMART-shRNAThermo Scientific Для определениялентивирусного вектора
pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)Входит в каждый набор для трансфекцииЭкспрессия плазмиды для контроля трансфекции
Oct-4Santa Cruz Biotechnologysc-5279Мышь IgG2b, плюрипотентный маркер
SSEA-1Santa Cruz Biotechnologysc-21702Мышь IgM, маркер дифференцировки
SSEA-4Santa Cruz Биотехнологияsc-21704Мышь IgG3, плюрипотентный маркер
Tra-1-60Santa CruzБиотехнология sc-21705 Мышиный IgM, плюрипотентный маркер
Tra-1-81Santa Cruz Biotechnologysc-21706Мышь IgM, плюрипотентный маркер
CK8 (C51)Santa Cruz Biotechnologysc-8020Мышь IgG1, против цитокератина 8
&альфа;-фетопротеинаSanta Cruz Biotechnologysc-8399AFP, мышь IgG2a
HNF-3β (-19)Santa Cruz Biotechnologysc-9187FOXA2, козье поликлональное антитело
тропонин T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0мышиное IgG1
DesminThermo ScientificRB-9014-P1Rabbit IgG
Anti-NANOGReproCELL Inc, ЯпонияRCAB0004P-FПоликлональное антитело 
Крысиный анти-GFAPZymed13-0300Глиальный фибриллярный кислый белок
альбумин (клон HSA1/25.1.3)Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513AМышь IgG1
Гладкомышечный актин (клон 1A4)DakoCytomation IncIR611/IS611Мышь IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326Кролик поликлональное антитело
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1, мышь IgG2a
HNF4&альфа; (С11Ф12)Cell Signaling Technologies3113Моноклональное антитело
Параформальдегид (раствор)Электронная микроскопия наук15710PFA, фиксатор, разведенный в D-PBS
кролика

Ссылки

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167(2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ROCK Y 27632521
Альтернативные Культуры для человека плюрипотентных стволовых клеток производство, техобслуживание, и генетический анализ
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.