Методическая статья

Двухфотонное В естественных условиях Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка

DOI:

10.3791/51520

⸱

12 мая 2014 г.

 , 
1Department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Покадровая визуализация у живого животного предоставляет ценную информацию о структурной реорганизации в интактном мозге. В данной работе мы представляем препарат для истонченного черепа, который позволяет транскраниально визуализировать флуоресцентно меченные синаптические структуры в коре головного мозга живой мыши с помощью двухфотонной микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В коре млекопитающих, нейроны образуют чрезвычайно сложных сетей и обмен информацией на синапсах. Изменения в синаптической силы, а также добавления / удаления синапсов, возникают в опыте-зависимым образом, обеспечивая структурную основу нейрональной пластичности. Как постсинаптических компонентов самых возбуждающих синапсов в коре головного мозга, дендритные шипы считается хорошим заменителем синапсов. Принимая преимущества генетики мыши и флуоресцентных методов маркировки, отдельных нейронов и их синаптических структур могут быть помечены в неповрежденном мозге. Здесь мы вводим протокол транскраниальной визуализации с использованием двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии следовать флуоресцентно меченных постсинаптические дендритных шипиков с течением времени в естественных условиях. Этот протокол использует препарат разреженных черепа, который держит череп нетронутыми и позволяет избежать воспалительных эффектов, вызванных воздействием мозговых оболочек и мозга. Таким образом, изображения могут быть получены сразу после суrgery выполняется. Экспериментальная процедура может быть выполнена повторно через различные промежутки времени от нескольких часов до нескольких лет. Применение этого препарата также может быть расширена, чтобы исследовать различные области коры и слоев, а также другие типы клеток, в физиологических и патологических состояниях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коре млекопитающих участвует во многих функциях мозга, от чувственного восприятия и движения управления для абстрактного обработки информации и познания. Различные корковые функции построить на различных нейронных цепей, которые состоят из различных типов нейронов передачи и обмена информацией в отдельных синапсов. Структура и функции синапсов последовательно вносятся изменения в ответ на опыте и патологий. В зрелом мозге, синаптической пластичности принимает форму обеих изменений прочностных и добавления / удаления обслуживаемых синапсов, играют важную роль в формировании и поддержании функциональной нервной схемы. Дендритные шипы постсинаптические компоненты большинства возбуждающих синапсов в мозге млекопитающих. Постоянная оборот и морфологические изменения шипами, как полагают, служат хорошим индикатором изменений в синаптических связей 1-7.

Двухфотонное лазерного сканирования микроспектроскопии предлагает глубокое проникновение через толстые, непрозрачные препаратов и низкой фототоксичности, что делает его пригодным для живого изображения в интактном мозге 8. В сочетании с флуоресцентной маркировки, изображений двухфотонного представляет собой мощный инструмент заглянуть в живого мозга и следовать структурную реорганизацию в отдельных синапсов с высоким пространственным и временным разрешением. Различные методы были использованы для получения мышей в течение 9-13 живого изображения. Здесь мы описываем препарат разреженных черепа в естественных условиях двухфотонного визуализации исследовать структурную пластичность постсинаптических дендритных шипиков в коре мыши. Используя этот подход, наши недавние исследования изображен динамичную картину дендритных изменений позвоночника в ответ на двигательного навыка обучения с ростом доступности трансгенных животных с флуоресцентной меченых нейронов подмножеств и быстрого развития в естественных условиях методов маркировки, подобные процедуры, описанные здесь, могут быть применены чтобы Investigaтэ другие типы клеток и области коры, в сочетании с другими манипуляциями, а также используется в моделях болезни 16-23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Утверждение должно быть получено от домашних учреждений до начала операции и исследования изображений. Эксперименты, описанные в этой рукописи были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами из Университета Калифорнии, Санта-Крус Уходу за животными и использованию комитета.

1. Хирургии

  1. Автоклав все хирургические инструменты и стерилизовать рабочее пространство с 70% спиртом тщательно перед операцией.
  2. Обезболить мышь внутрибрюшинной (IP) инъекции KX анестезией (200 мг / кг кетамина и 20 мг / кг ксилазина) в зависимости от веса тела мыши. Примечание: KX доза может быть скорректирована в зависимости от штамма, возраста и состояния здоровья из мышей. Ветеринарная консультация для определения оптимальной дозы также рекомендуется.
  3. Периодически Выполните проверку схождение щепотку нажатием пальцев мыши и проверка рефлексивного реагирования для контроля состояния наркоза.Убедитесь в том, что мышь полностью под наркозом, прежде чем начать операцию. Примечание: Во время длительных сеансов визуализации, периодически проверять состояние наркоза мышки, управлять дополнительную KX если это необходимо.
  4. Наведите мышь на грелку, чтобы поддерживать температуру тела во время операции.
  5. Бритье головы мыши, используя лезвие, чтобы разоблачить кожу головы.
  6. Стерилизовать бритая область, протирая кожу переменного алкоголя колодки и бетадин. Удалите все остаточные вырезки волосы.
  7. Осторожно применять глазную мазь для смазки оба глаза, поэтому предотвращая необратимые повреждения, вызванные обезвоживанием во время эксперимента.
  8. Сделайте прямой разрез по средней линии головы, и двигаться кожу с боков к краям черепа.
  9. Снимите соединительную ткань, прикрепленный к черепу.

2. Растворено-череп Подготовка

  1. Определить области формирования изображения на основе стер. eotaxic координаты Примечание: Старайтесь избегать больших кровеносных сосудов, что проникновение блок света и размыть вошедшие в образ структуры. Сосудистой лучше всего наблюдать, когда череп влажная стерильным физиологическим раствором.
  2. Используйте высокоскоростной микро сверла для тонкой круговой области черепа (диаметр 0,5-1,0 мм). Перемещение буровой параллельно поверхности черепа, а не держа его против черепа и нажав. Дрель, пока как внешней плотным слоем костной ткани и среднего губчатый слой кости не будут удалены. Примечание: Чтобы избежать повреждения, вызванное перегревом, избегать длительного контакта между буровым долотом и черепа.
  3. Продолжить истончение внутреннюю компактную слой кости с микрохирургической лезвия в центре региона детализации поредели. Держите микрохирургической лезвие под углом примерно 45 °, чтобы очистить череп не нажимая упал против черепа до равномерно разбавить небольшую область (диаметр 200-300 мкм) с толщиной приблизительнаялы 20-30 мкм получается. В связи с автофлуоресценции черепа, толщина может быть измерена путем сканирования расстояние между верхней и нижней поверхности черепа под двухфотонного микроскопа. Примечание: хотя толщина череп менее 20 мкм обеспечивает хорошее качество изображений, это не рекомендуется, потому что это делает процесс истончение в последующих сессиях на изменение образа трудно. Чтобы избежать чрезмерной истончение, толщина черепа необходимо периодически проверять во время операции (см. Обсуждение).

3. Иммобилизация

  1. Осторожно снимите костной стружки.
  2. Поместите небольшую каплю цианакрилатного клея на каждом краю центральное отверстие стерильной траверсой, которая была автоклавного (см. рисунок 1). Держите голову пластину плотно к черепа с утонченной области, расположенной в центре отверстие. Примечание: Если клей загрязняет утонченную гEgion случайно, удалите его тщательно с микрохирургической лезвия.
  3. Аккуратно вытащить кожу от сторон черепа к краям центральное отверстие головной пластине.
  4. Подождите примерно 10 минут, пока пластина еще правильно приложен к черепу.
  5. Поместите голову пластину на двух боковых блоков на пластине-держателе, а затем затянуть винты по краям головной пластины для иммобилизации мышь на пластине держателя (см. рисунок 1). Примечание: Убедитесь, что нет кожи или усы между глава пластины и блоки, прежде чем затягивать винты. Хороший иммобилизованным подготовка не должны иметь заметного движения черепа под микроскопом рассекает когда задняя часть животного аккуратно похлопал.
  6. . Промойте подвергается череп с физиологическим раствором, чтобы удалить Неполимеризованные клей Примечание: Важно, чтобы удалить оставшиеся клей, как Неполимеризованные клей размывает изображения и убытки микрообъективов <./ Li>

4. Изображений

  1. Сфотографируйте сосудистой открытой черепа с утоненной региона в карты 1, который используется переехать изображаемого регион в последующих сессиях изображений (см. рисунок 2).
  2. Наведите мышь под микроскопом изображений. Найдите утонченную площади под воздуха цели 10X с использованием эпифлуоресцентной и переместите тонкий область в центре поля зрения.
  3. Добавить каплю физиологического раствора на верхней части черепа и перейти к цели 60X, который был промыть стерильной водой. Выберите регион, в котором отдельные дендритных шипиков четко визуализировать вместе дендритов. Определить и разметить соответствующий регион на карте 1, сравнивая сосудистую между зрения epifluorescent и сосудистой фото.
  4. Настройтесь двухфотонного длины волны лазерного излучения в соответствии с флуорофорами. Например, 920 нм для YFP; 890 нм для GFP; 1000 нм для DsRed и tdTomato 24.
  5. Приобретать стеки с 2мкм шаги по оси с помощью цели 60X. Этот стек изображение занимает площадь около 200 мкм х 200 мкм (512 х 512 пикселей) и используется в качестве карты 2 для переселения во время последующих сессий визуализации (см. рисунок 2).
  6. Приобретать девять стеки пределах Карта 2 с использованием 3-кратный цифровой зум. Каждый стек изображение охватывает площадью около 70 мкм х 70 мкм (512 х 512 пикселей), с 0,7 мкм шагов по оси. Примечание: Интенсивность лазера должна быть ниже 40 мВт при измерении на образцах, чтобы минимизировать фототоксичность.

5. Восстановление

  1. После обработки изображений, мягко отделить голову пластину из черепа.
  2. Тщательно очистите череп и кожу, чтобы удалить все оставшиеся клея. Примечание: Любые оставшиеся клей на кожу вызывает раздражение и замедлить заживление кожи в то время как оставшаяся клей на черепе вызовет эрозию черепа иngiogenesis в недавно выращенной кости слоя, что делает последующее перемещение и изменение образа трудно.
  3. Промыть череп и кожу физиологическим раствором несколько раз.
  4. Шовный кожу головы стерильной хирургической нити.
  5. Держите животное на грелку в отдельной клетке. Администрирование бупренорфин анальгетик (0,1 мг / кг) подкожно для смягчения послеоперационную боль. Вернуться животное в доме клетку после полного выздоровления. Мониторинг животного тесно (проверить по крайней мере, один раз в день), пока разрез не зажила и швы снимаются. Администрирование последующие инъекции бупренорфин анальгетик при необходимости.

6. Reimaging

  1. Повторите шаги 1.1-1.8.
  2. Повторите шаги 3.1-3.6
  3. Найдите ранее изображенную область, сравнивая сосудистой шаблон для карт 1 и дендритных филиальную модель для сопоставления 2.
  4. Если reimaging осуществляется в течение 1 недели, повторите шаг 2,3 удалить тонкий слой вновь выросли кости на вершине утонченной реГион помощью микрохирургической лезвие. Если reimaging выполняется после более 1 недели, повторите шаги как 2.2 и 2.3 Примечание:. Вновь выросли кости слой состоит из менее конденсированных структуры по сравнению с оригинальной компактной слоя кости, что приводит к снижению качества изображения. Поэтому, чтобы приобрести такое же качество, надо тонкой черепа чуть больше, чем на предыдущей сессии визуализации.
  5. Отрегулируйте положение и ориентацию на получение стеки, которые соответствуют ранее принятые стеки под двухфотонного микроскопа.
  6. Получение изображений, как в шаге 4.6.
  7. Повторите шаги 5.1-5.5 после съемки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В YFP-H линии мышей 25, желтый флуоресцентный белок выражает в подгруппе пирамидальных нейронов слоя V, которые проецируют свои дендритов в поверхностных слоях в коре. Благодаря подготовке в разреженных черепа, флуоресцентно меченных дендритные сегменты могут быть повторно отображены под двухфотонного микроскопа над различными интервалами изображений, начиная от часов до нескольких месяцев. Здесь мы показываем пример четыре времени изображения одних и тех же дендритов более 8 дней в моторной коры 1-месячным м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для получения успешной подготовки разреженных черепа, несколько шагов в этом протоколе имеют решающее значение. 1) Толщина черепа. Черепная кость имеет многослойную структуру, с двумя слоями высокой плотности компактной кости и средний слой низкой плотности губчатой ​​кости. В то время как высокоскоростной микро дрель подходит для удаления наружных слоев компактной кости и губчатой ​​кости, микрохирургической лезвие идеально подходит для разбавления внутренний слой компактной кости. По мере увеличения толщины и жесткост...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Джеймса Перна для графического иллюстрации. Эта работа была поддержана грантами от Национального института психического здоровья в YZ

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КетаминBioniche Pharma67457-034-10Смешанный с ксилазином для анестезии
XylazineLloyd laboratories139-236Смешанный с кетамином для анестезии
Физиологический растворHospira0409-7983-090,9% NaCl для инъекций и визуализации
Бритвенные лезвияЭлектронная микроскопия науки72000Двухлезвийные бритвенные лезвия из нержавеющей стали
Спиртовые салфеткиFisher Scientific06-669-62Стерильные спиртовые подушечки для приготовления
Глазная мазьHenry Schein102-9470Петролатум офтальмологическая мазь стерильная глазная смазка
Высокоскоростная микродрельFine Science Tools18000-17Высокоскоростная микродрель подходит для истончения внешнего слоя компактной кости и нацеливания на небольшую площадь
Микродрель стальные заусенцыFine Science Tools19007-14диаметром 1,4 мм
Surgistar6961Микрохирургическое лезвие подходит для истончения внутреннего слоя компактной кости и среднего слоя губчатой кости
Цианоакрилатный клейFisher ScientificNC9062131Закрепите головную пластину на черепе
Шовный материалHavard Apparatus510461Неабсорбирующий, стерильный шелковый шовный материал, 6-0 мононить
Препарирующий микроскопOlympusSZ61
ПЗС камераInfinity
Двухфотонный микроскопPrairie TechnologiesUltima IV
10X объективOlympusNA 0.30, воздушный
объектив 60XOlympusNA 1.1, ИК проницаемый, водный иммерсионный
Ti-сапфировый лазерСпектра-ФизикаМай Тай Х..
глаз Микрохирургическое лезвие

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  2. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
  3. Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
  4. Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
  5. Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
  6. Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
  7. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
  8. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  9. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
  10. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
  11. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
  12. Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. , (2012).
  13. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , (2008).
  14. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
  15. Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
  16. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
  17. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
  18. Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
  19. Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
  20. Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
  21. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
  22. Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. , (2010).
  23. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. , (2010).
  24. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  25. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  26. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
  27. Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. , (2012).
  28. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. , (2012).
  29. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
  30. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. , (2010).
  31. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  32. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
  33. Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Two Photon ImagingDendritic SpinesMouse CortexThinned Skull PreparationIn Vivo ImagingFluorescent LabelingHead ImmobilizationImage Stack AcquisitionVasculature MappingSynaptic Plasticity

Похожие статьи