Двухфотонное В естественных условиях Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка

Summary

Покадровая визуализация у живого животного предоставляет ценную информацию о структурной реорганизации в интактном мозге. В данной работе мы представляем препарат для истонченного черепа, который позволяет транскраниально визуализировать флуоресцентно меченные синаптические структуры в коре головного мозга живой мыши с помощью двухфотонной микроскопии.

Abstract

В коре млекопитающих, нейроны образуют чрезвычайно сложных сетей и обмен информацией на синапсах. Изменения в синаптической силы, а также добавления / удаления синапсов, возникают в опыте-зависимым образом, обеспечивая структурную основу нейрональной пластичности. Как постсинаптических компонентов самых возбуждающих синапсов в коре головного мозга, дендритные шипы считается хорошим заменителем синапсов. Принимая преимущества генетики мыши и флуоресцентных методов маркировки, отдельных нейронов и их синаптических структур могут быть помечены в неповрежденном мозге. Здесь мы вводим протокол транскраниальной визуализации с использованием двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии следовать флуоресцентно меченных постсинаптические дендритных шипиков с течением времени в естественных условиях. Этот протокол использует препарат разреженных черепа, который держит череп нетронутыми и позволяет избежать воспалительных эффектов, вызванных воздействием мозговых оболочек и мозга. Таким образом, изображения могут быть получены сразу после суrgery выполняется. Экспериментальная процедура может быть выполнена повторно через различные промежутки времени от нескольких часов до нескольких лет. Применение этого препарата также может быть расширена, чтобы исследовать различные области коры и слоев, а также другие типы клеток, в физиологических и патологических состояниях.

Introduction

Коре млекопитающих участвует во многих функциях мозга, от чувственного восприятия и движения управления для абстрактного обработки информации и познания. Различные корковые функции построить на различных нейронных цепей, которые состоят из различных типов нейронов передачи и обмена информацией в отдельных синапсов. Структура и функции синапсов последовательно вносятся изменения в ответ на опыте и патологий. В зрелом мозге, синаптической пластичности принимает форму обеих изменений прочностных и добавления / удаления обслуживаемых синапсов, играют важную роль в формировании и поддержании функциональной нервной схемы. Дендритные шипы постсинаптические компоненты больши....

Protocol

Утверждение должно быть получено от домашних учреждений до начала операции и исследования изображений. Эксперименты, описанные в этой рукописи были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами из Университета Калифорнии, Санта-Крус Уходу за животными и использованию комитета.

1. Хирургии

1. Автоклав все хирургические инструменты и стерилизовать рабочее пространство с 70% спиртом тщательно перед операцией.
2. Обезболить мышь внутрибрюшинной (IP) инъекции KX анестезией (200 мг / кг кетамина и 20 мг / кг ксилазина) в зависимости от веса тела мыши. Примечание: KX доза может быть скорректирована в зависи....

Results

В YFP-H линии мышей ^25, желтый флуоресцентный белок выражает в подгруппе пирамидальных нейронов слоя V, которые проецируют свои дендритов в поверхностных слоях в коре. Благодаря подготовке в разреженных черепа, флуоресцентно меченных дендритные сегменты могут быть повторно отображены под двухфотонного микроскопа над различными интервалами изображений, начиная от часов до нескольких месяцев. Здесь мы показываем пример четыре времени изображения одних и тех же дендритов более 8 дней в моторной коры 1-месячным м.......

Discussion

Для получения успешной подготовки разреженных черепа, несколько шагов в этом протоколе имеют решающее значение. 1) Толщина черепа. Черепная кость имеет многослойную структуру, с двумя слоями высокой плотности компактной кости и средний слой низкой плотности губчатой ​​кости. В то время как высокоскоростной микро дрель подходит для удаления наружных слоев компактной кости и губчатой ​​кости, микрохирургической лезвие идеально подходит для разбавления внутренний слой компактной кости. По мере увеличения толщины и жесткост.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Кетамин	Bioniche Pharma	67457-034-10	Смешанный с ксилазином для анестезии
Xylazine	Lloyd laboratories	139-236	Смешанный с кетамином для анестезии
Физиологический раствор	Hospira	0409-7983-09	0,9% NaCl для инъекций и визуализации
Бритвенные лезвия	Электронная микроскопия науки	72000	Двухлезвийные бритвенные лезвия из нержавеющей стали
Спиртовые салфетки	Fisher Scientific	06-669-62	Стерильные спиртовые подушечки для приготовления
Глазная мазь	Henry Schein	102-9470	Петролатум офтальмологическая мазь стерильная глазная смазка
Высокоскоростная микродрель	Fine Science Tools	18000-17	Высокоскоростная микродрель подходит для истончения внешнего слоя компактной кости и нацеливания на небольшую площадь
Микродрель стальные заусенцы	Fine Science Tools	19007-14	диаметром 1,4 мм
Surgistar	6961	Микрохирургическое лезвие подходит для истончения внутреннего слоя компактной кости и среднего слоя губчатой кости
Цианоакрилатный клей	Fisher Scientific	NC9062131	Закрепите головную пластину на черепе
Шовный материал	Havard Apparatus	510461	Неабсорбирующий, стерильный шелковый шовный материал, 6-0 мононить
Препарирующий микроскоп	Olympus		SZ61
ПЗС камера	Infinity
Двухфотонный микроскоп	Prairie Technologies		Ultima IV
10X объектив	Olympus		NA 0.30, воздушный
объектив 60X	Olympus		NA 1.1, ИК проницаемый, водный иммерсионный
Ti-сапфировый лазер	Спектра-Физика		Май Тай Х..