Методическая статья

Понимание начале Органогенез, используя упрощенную

38.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51526

⸱

12 января 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, 2Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 4Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 5Department of Paediatrics, University of Western Ontario

В этой статье

Краткое содержание

Эмбрион Xenopus laevis продолжает оставаться исключительно полезным при изучении раннего развития из-за его большого размера и простоты манипуляций. Предусмотрен упрощенный протокол для гибридизации in situ в целом, который может быть использован для идентификации конкретных органов в данной модельной системе.

Аннотация

Органогенез — это изучение того, как органы определяются, а затем приобретают свою специфическую форму и функции во время развития. Эмбрион Xenopuslaevis очень полезен для изучения органогенеза, поскольку его большой размер делает его очень подходящим для идентификации органов на самых ранних этапах органогенеза. В настоящее время основным методом, используемым для идентификации конкретного органа или зачатка, является цельная гибридизация in situ с мечеными антисмысловыми РНК-зондами, специфичными для гена, который экспрессируется в представляющем интерес органе. Кроме того, относительно легко манипулировать генами или сигнальными путями у Xenopus, а гибридизация in situ позволяет затем анализировать изменения в присутствии или морфологии органа-мишени. Гибридизация in situ представляет собой многодневный протокол, состоящий из множества этапов. Здесь мы предоставляем упрощенный протокол с уменьшенным количеством этапов и используемых реагентов, который хорошо подходит для рутинных анализов. Роботы для гибридизации in situ значительно упростили этот процесс, и мы подробно описываем, как и когда мы используем эту технологию в процессе. После завершения гибридизации in situ получение наилучшего изображения результата может быть разочаровывающим. Мы предоставляем консультации по оптимизации визуализации результатов гибридизации in situ. Хотя протокол описывает оценку органогенеза у Xenopus laevis, тот же базовый протокол почти наверняка может быть адаптирован к Xenopus tropicalis и другим модельным системам.

Введение

Паттерн экспрессии конкретного гена является важной частью информации для определения потенциальной роли этого гена в развитии конкретного органа или типа клеток. Проще говоря, если она не выражена в нужное время и в нужном месте, она вряд ли сыграет ключевую роль. У Xenopus, как и у большинства ранних эмбрионов, наиболее часто используемым анализом для определения экспрессии гена является полная гибридизация in situ с использованием меченых зондов антисмысловой РНК. Использование окрашивания антител для оценки экспрессии гена в Xenopus становится все более распространенным, поскольку исследователи обнаруживают антитела, обычно выращиваемые против белков млекопитающих, которые перекрестно реагируют на гомолог Xenopus или генерируют свои собственные 1-3. Тем не менее, в подавляющем большинстве исследований органогенеза Xenopus до сих пор используются зонды антисмысловой РНК. При использовании антител каждое отдельное антитело часто требует оптимизации для первичной концентрации антитела или протоколов фиксации. В отличие от этого, протокол для гибридизаций in situ по существу инвариантен для различных зондов. Основная концепция относительно проста, и отличный стандартный протокол хорошо зарекомендовал себя 4. Наш протокол представляет собой усовершенствованную версию оригинального протокола 4, который по-прежнему обеспечивает превосходное обнаружение паттернов экспрессии генов на ранних стадиях развития эмбриона. Эмбрионы фиксируют, а затем подготавливают к гибридизации путем изменения растворов и температур таким образом, чтобы обеспечить высокую жесткость связывания меченого зонда антисмысловой РНК с его целевой мРНК. Несвязанный зонд промывается, и эмбрионы затем подготавливаются к связыванию антитела с меткой на РНК-зондах. Затем избыток антител смывается, и с помощью ферментативной цветной реакции локализуется место связывания РНК-зонда в эмбрионе. В настоящее время существует ряд трансгенных линий Xenopus, которые стимулируют экспрессию флуоресцентных белков в определенных тканях, и они доступны в центрах хранения Xenopus, таких как Национальный ресурс Xenopus в Вудс-Хоул. Несмотря на то, что этот вариант очень полезен для многих экспериментов, требующих изучения органогенеза у живых эмбрионов, он требует отдельного жилья для трансгенных линий.

Гибридизация in situ может четко определить, где будут формироваться конкретные органы или типы клеток на ранних стадиях развития эмбриона (Рисунок 1). Метод удивительно чувствителен, учитывая, что можно обнаружить экспрессию генов в небольшом числе клеток в одном эмбрионе. Однако гибридизация in situ с использованием интенсивности колориметрического окрашивания не считается количественно поддающейся количественной оценке, поскольку цветовая реакция не является линейной. Несмотря на трудности количественной оценки интенсивности окрашивания, изменения в выражении часто весьма заметны; В частности, когда гибридизация in situ показывает количественное увеличение или уменьшение размера доменов экспрессии 6,7.

Явные преимущества гибридизации in situ делают ее критически важным анализом при изучении раннего развития. Тем не менее, это трудоемкий процесс, требующий множества шагов в течение нескольких дней. Этот протокол представляет собой упрощенную версию стандартного протокола, которая исключает несколько этапов без снижения качества результата in situ. Упрощение также устраняет источники изменчивости, облегчая устранение неполадок, если гибридизация in situ не является оптимальной. В частности, мы исключили использование протеиназы К и РНКазы лечения эмбриона, двух этапов, которые могут зависеть от качества реагента, а также могут снизить интенсивность сигнала при чрезмерном усердии. Протокол также обеспечивает некоторую экономию средств за счет отказа от использования нескольких реагентов. Наконец, этот протокол также предоставляет некоторые простые рекомендации для улучшения получения изображений результатов гибридизации in situ. Хотя этот протокол оптимизирован для работы в эмбрионах Xenopus, вполне вероятно, что по крайней мере некоторые упрощения будут применимы к работе по гибридизации in situ в других эмбриональных системах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Эмбрион Подготовка

  1. Если это не сделано регулярно как часть эмбриона культуры, де-желе эмбрионов с использованием 2,5% цистеин, pH 8,0 до фиксации 8. Хотя это не является абсолютно необходимым, полезно затем вручную удалить оплодотворения конверт до фиксации с использованием тонких щипцов.
    1. Используйте стекло пипетки Пастера перенести эмбрионы. Пипетки не достаточно широким, чтобы передать эмбрионы, так что используйте с бриллиантом перо, чтобы сократить стеклянную пипетку в точке достаточно широким, чтобы забрать эмбрион. Исключите острые края пипетки после резать, быстро передавая вырезать наконечник через пламя горелки Бунзена, чтобы расплавить острые края.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уход должны быть приняты, как стекло может все еще быть достаточно горячей, чтобы вызвать ожоги, хотя это, кажется, охлаждается визуального осмотра.
  2. Выполните фиксацию эмбриона в несколько этапов. Во-первых, подготовить стеклянные флаконы для использования в зародыше фиксации. Используйте эти пузырьки на всех этапах, включая финалхранение. Использование флаконов, которые понятны с хорошей уплотнения тефлоновой в крышке, что позволяет для мониторинга эмбрионов во всех этапах процесса. Добавьте флаконы с соответствующей экспериментальной информации с использованием постоянного маркера, а затем покрывают этикетку с четким ленты, так как даже маркером будут потеряны в течение процедуры за счет использования спиртов и других растворителей.
    1. Используйте Mempfa исправить эмбрионов. Сделать запас 8% параформальдегидом в партиях 50-100 мл за один раз. Использование примерно 75% от необходимого H 2 O и нагревают до 50-60 ° С, что необходимо, чтобы получить параформальдегид в раствор.
      Примечание: данное решение немного отличается от Memfa используется в старых версиях опубликованных протоколов в том, что он использует параформальдегида, а не формальдегида.
    2. Добавьте 2-3 капель 10N NaOH или до тех пор, пока рН не составляет примерно 7,5 (использование лакмусовой бумажки для проверки рН). Параформальдегид очень токсичен, поэтому генерировать исходный раствор в вытяжном шкафу. После того, как параформальдегида в растворе, фильтруют раствор через ватмана в свежем контейнера и добавить H 2 O до конечного объема. При необходимости хранить параформальдегида раствора при 4 ° С в течение 1-2 недель.
    3. Сборка остальные компоненты раствора фиксации Mempfa (Таблица 1). Убедитесь, что заключительная рабочая концентрация параформальдегида 4%. Хранить все компоненты фиксирующего раствора при 4 ° С в запасах.
    4. Используя стеклянную пипетку вырезать, исправить эмбрионов путем добавления эмбрионов с меченым стеклянные флаконы, которые были заполнены с приблизительно 3-4 мл раствора Mempfa (Таблица 1). Избегайте крепления более 20-30 эмбрионов в пузырек. Добавить эмбрионов с минимумом жидкости передачи из эмбриона среды. Исправить эмбрионов в растворе Mempfa в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
    5. За несвоевременное энтодермы структур выполнять в Situs вручную изолированных кишечных и энтодермы производных 9,10, Который позволяет для хорошего проникновения зонда, а также предотвращает окрашивание полости.
    6. Хранить раствор 100% метанолом при -20 ° С. После фиксации параформальдегидом, замените решение Mempfa приблизительно с 4 мл -20 ° C, 100% метанола для хранения эмбрионов.
    7. Вихревой флаконов после добавления метанола, чтобы предотвратить эмбрионов от прилипания к стеклу или других эмбрионов. Кроме того, убедитесь, что флаконы плотно закрытыми, потому что метанол может испариться в морозильной камере в течение долгого времени, если свободно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы могут храниться в течение по крайней мере года, и, вероятно, больше, в метаноле перед окрашиванием без потери качества гибридизация.

2. Зонд Подготовка

  1. Использование 1-2 мкг матричной ДНК, чтобы сделать дигоксигенином-меченых зондов. Сокращение плазмиду, содержащую ДНК-последовательность, соответствующую по 5'-концу гена интереса рестриктазой подходит для Тат вектор для создания антисмысловых зондов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: плазмиды должны иметь соответствующий РНК-полимеразы сайт связывания (например, T7, T3 или SP6).
  2. Разрешить ДНК, вода, NTP смешивать и полимеразной буфера нагреться до комнатной температуры перед сборкой реакции синтеза зонда. Добавить компоненты реакции синтеза РНК в 1,5 мл микроцентрифужных трубки в порядке, как указано в таблице 2. Настройка громкости добавленной воды, чтобы довести общий объем реакции синтеза зонд 20 мкл. Сборка реакцию при комнатной температуре, потому что компоненты буфера полимеразы может осадить ДНК шаблона, когда в высоких концентрациях и холода.
  3. Инкубируйте реакции транскрипции в течение 2 ч при 37 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубации чуть больше чем за два часа не приводит к неблагоприятным последствиям, но и показать несколько увеличился урожай. Если инкубировали в течение одного часа, выход будет снижена, но все еще достаточно, чтобы сделать хорошее зонд.
    1. В ожидании реакции транскрипции до конца, сделать агарозном геле, который будет использоваться для проверки качества зонда. Melt 1 мкг агарозы в 100 мл 1x TAE буфер (таблица 1) при нагревании раствора до температуры кипения. Удалить решение от тепла, когда агарозном порошок полностью не растворится.
    2. Добавить 2 мкл этидий бромида исходного раствора (10 мг / мл) до приблизительно 100 мл агарозном геле агарозы при остынет до около 60 ° С, чтобы позволить визуализацию РНК под действием ультрафиолетового (УФ) света.
      Примечание: Этот раствор агарозном геле можно хранить в 60 ° C инкубаторе с тем, что будущие гели можно вылить без повторного плавления. Будьте осторожны при обращении с бромид этидия из-за потенциальной токсичности.
  4. Добавить 1 мкл (DNAseI РНКазы сорт) к реакции транскрипции после 2 ч инкубации и инкубировать еще в течение 10 мин при 37 ° С, чтобы исключить матричной ДНК.
  5. Удалить 1 мкл реакционной смеси, чтобыпроверить на 1% агарозном TAE геле-и остальной (20 мкл) добавляют 80 мкл 1% SDS в ТЕ буфере (10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), 10 мкл 5 М NH 4 ацетат и 220 мкл холодного этанола. Vortex смесь энергично и отложите в сторону на льду, пока результаты проверки качества РНК не известны.
    1. Запустите 1 мкл РНК удалены перед осаждением на 1% агарозном TAE геле. Чтобы облегчить нагрузку на геле, добавить 4-5 мкл воды и 1 мкл стандартного загрузочного красителя к РНК. Просмотр РНК на геле с использованием УФ-света просвечивания для проверки качества зонда (см обсуждение).
  6. Осадок оставшуюся РНК, которая была установлена ​​в сторону на льду в шаге 2,5 спиннинг в микроцентрифуге при полной скорости в течение от 10 до 15 мин. Откачать супернатант с вытянутой стеклянной пипетки и позволяют немного высохнуть.
    1. Ресуспендируют зонд 1 мл РНК гибридизации буфера (таблица 1) в пробирку Эппендорфа. Vortex и шiefly нагрева трубки до 37 ° С и снова вихрь. Перенесите раствор зонда для 15 мл завинчивающейся полистирола трубку и заполнить до 7-10 мл с РНК-гибридизации буфера. Примечание: датчик может быть разбавлен дальше (10 раза дополнительное разбавление все еще может работать) часто приводит к низким уровнем фона, но реакции окрашивания также занять больше времени.

3. В гибридизация

  1. Возьмем эмбрионов, которые были сохранены в -20 ° C метанола и дают нагреться до комнатной температуры. Выполните всю процедуру в стеклянных флаконах. Если разные эмбрионы из одной группы будет посмотрел на различных зондов, не храните их в одном флаконе только перед зонды добавил, чтобы уменьшить изменчивость и труда в первый день.
    1. Увлажняет эмбрионов через ряд метанола, как описано в таблице 3 (см таблицу 1 для стирки рецептов) в рамках подготовки к добавлением зонда. Аккуратно вихревой ЭмбриОС после каждого изменения, чтобы гарантировать, что они не выступает в стороны или друг с другом, и рок эмбрионов путем установки флаконов на nutator. При передаче жидкости, проверьте внутреннюю часть крышки, чтобы убедиться, что эмбрионы не были в ловушке там.
    2. После того как в растворе зонда, гибридизацию в течение ночи эмбрионов, как описано в таблице 3.
  2. Удалить раствор зонда. Сохранить используемого зонда при хранении в 15 мл завинчивающейся полистирола трубки, отмеченные даты и количество раз зонд была использована, при -20 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: же зонд может быть использован повторно много раз для последующего в точке гибридизации до колориметрические реакции не начать принимать аномально много времени, чтобы достичь желаемой интенсивности.
    1. После того, как зонд удален, подготовки эмбрионов для окрашивания антител против зонда через серии промывок, описанных в таблице 4. Изменение температуры по мере необходимости (таблица 4), перемещая тон nutator, с пузырьками эмбрионов, прикрепленных непосредственно в гибридизации печи, которые установлены до соответствующей температуры.
    2. Составляют соответствующий объем MAB + HTSS + BR + анти-Dig антитела (таблица 4) в то время, что эмбрионы инкубируют в МАВ + HTSS + BR блокирующего раствора таким образом, что антитело до их добавлением к эмбрионов. Сделать блокирующие растворы свежего в день использования.
  3. Удалить раствор антител и начинают моет, как показано в таблице 5 следующей инкубации в течение ночи с антителом. Выполнение по крайней мере, двенадцать 30 мин промывки с целью подготовки для окрашивания с щелочной фосфатазы подложки и уменьшить фон в максимально возможной степени. Используйте либо буфер МАБ или раствор ТБТ (таблица 1) на стадии отмывки.
    Примечание: раствор ТБТ является TTW, который имеет 2 мг / мл BSA добавляли.
    1. Заменить последнее промывочного раствора с БМ Фиолетовый щелочной фосфатазы подложки. Выполните окрашивание Reacции на любом комнатной температуре или 37 & deg; С.
      Примечание: Окрашивание более быстро при 37 ° C, но если оставить на ночь, неприемлемы фоновое окрашивание часто может быть результатом. Реакции окрашивания будет часто требуют окрашивания в течение ночи и при комнатной температуре является самым безопасным выбором.
    2. Если в дальнейшем окрашивание не требуется, и пурпурный раствор BM берет на себя синим цветом, замените окрашивания раствора с пресной BM Фиолетовый и поставить пробирки в 37 ° C. Если целевой мРНК очень обильным, поместить эмбрионов в окрашивающего раствора при 4 ° С в течение ночи, а затем перейти эмбрионов до комнатной температуры или 37 ° С для улучшения мониторинга реакции окрашивания.
    3. Тщательно отслеживать новые реакции, как время окончательного результата значительно варьируется между различными целевыми РНК. Для согласованности, остановить реакцию окрашивания (см 3.4), когда нет никаких новых сайтов выражения, возникающие с более инкубации. Важно отметить, что, если в гибридизация используется в качестве тестадля экспериментов, глядя на различных группах лечения, использовать то же самое время для цветных реакций между опытной и контрольной эмбрионов.
  4. Остановить реакцию окрашивания и подготовки эмбрионов для хранения и записи изображения путем изменения жидкости, как указано в таблице 6. Не раскачивайте эмбрионов на этой стадии, потому что удаление пятна можно представить в виде пурпурная окраска метанола вокруг эмбрионов.
    Примечание: Часто эмбрионы имеют светло-голубой окраски с раствором окрашивающего и холодным метанолом может, по меньшей мере, частично удалить, что, хотя это и не является достаточным, чтобы удалить тяжелую фона или окрашивание полости. Холодным метанолом относится к метанола, который поддерживается в -20 ° C морозильнике.
    1. Увлажняет эмбрионов и исправить пятно Mempfa (таблица 6). После того, как фиксированной, удалите Mempfa и мыть эмбрионов с 25% метанола.
    2. Снимите 25% метанола и добавляют отбеливающий раствор, если удаление эндогенного пигментанеобходимо. Будьте осторожны при обращении с отбеливающий раствор, как это может привести к ожогам. Обратите внимание на отбеливание тесно, как это происходит относительно быстро и степень отбеливания может варьироваться для разных эффектов (рисунок 2).
    3. Дегидрировать эмбрионов через метанол серии до 100% метанола для длительного хранения следующих отбеливания, или передать PBS для кратковременного хранения и последующей обработки изображений (табл 6).

4. визуализации Эмбрионы

  1. После того, как эмбрион завершила процесс окрашивания, изображение эмбриона, так что информация о том, где интерес ген экспрессируется в плен для более широкой аудитории. Используйте 1% агарозном в качестве фона, чтобы посмотреть непогашенные эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: агарозы дает синий / серый фон, который хорошо контрастирует с эмбриона и синего цвета реакции окрашивания. Это также помогает диффузного отвлекающие тени и отражения, которые отвлекают внимание от эмбриона.
    1. Добавить в агарозном в воду и затем довести до кипения, пока агарозном находится в растворе, а затем дайте остыть до 50 перед заливкой в ​​чашке Петри. Как и в раствор геля TAE, хранения раствора агарозы в 55 ° C инкубаторе в течение нескольких целей. Налейте агарозы на глубину около 2 мм в чашках Петри. При необходимости, регулировать глубину агарозы с получением слегка иначе оттенок фоне.
    2. После регидратации из хранилища в метаноле с водным раствором (PBS) или TTW, используя ряд метанол, поместить эмбрионов в чашке Петри с агарозном базы (табл 6). Держите решение чистым и если необходимо, использовать простой фильтрации для устранения мелких частиц вещества, которые могут нарушить чистый фон хороших изображений.
    3. Для изображения эмбрионы из альтернативных взглядов, например, от вентральной стороне, нарезать тонкими каналами в агарозы, чтобы соответствовать эмбриона с использованием тонких щипцов и поместите эмбрионы в этих каналов для ориентации (рис 3 ). Будьте внимательны, манипулируя эмбрионов, поскольку они легко повреждаются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство ступени имеют характерный позицию, что они берут на себя, когда помещали в раствор. Например, зародыши бластула-стадии, как правило, сидят на животных стороной вверх. После того, как эмбрионы начинают удлиняться, они лежали на их стороне.
  2. Используйте волоконно источник оптического света, чтобы осветить эмбрион из малым углом, создавая тени на эмбрион, которые обеспечивают глубину изображению и помочь распознать поверхностные структуры. Потому что отбеливание может устранить пигмент, который содержит полезные ориентиры, использовать теневое копирование для сильно обесцвеченных эмбрионов.
  3. Снимите эмбрионов окрашивания образа, который глубоко внутри эмбриона, например, в хорде, легких, или областей мозга, (рисунок 4). Чтобы достичь этого, не поставить эмбрионов через серию метанола до 100% в метаноле.
    1. После полного погружения в метаноле, передачи эмбрионов к раствору одной части бензилового спирта и две части бензил бытьnzoate (Бабб). Эмбрионы первоначально будет плавать на поверхности, но, как метанол смешивается с Babb, они будут погружаться в Babb. Выполните каждый шаг, касающийся Бабб в стеклянных флаконах или блюд; Бабб растает любого пластика или краски.
    2. После очистки, просматривать эмбрионов в проходящем свете, идущим снизу эмбриона. Регулировка интенсивность света, а также угол снизу, чтобы улучшить контраст и обеспечивают лучший цвет.
    3. При просмотре очищенные зародыши повысить стеклянную чашку Петри от основания. Сделайте это, просто используя два других чашке Петри крышки, чтобы поднять его так, что область блюдо с эмбрионами повышен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это имеет преимущество в том, базу в фокусе и ликвидации отвлекающие эффекты от несовершенства или пятна на микроскопе базы, которые могут помешать изображения.

5. Дважды в гибридизация

  1. Для того, чтобы одновременно видеть паттерн экспрессии TWO различных генов в одной эмбриона, синтезируют два зонда, по одному для каждого из различных генов. Синтезируют один зонд с использованием набора DIG-11-UTP в качестве метки, как описано выше. Развести продукт реакции транскрипции в РНК гибридизации буфера с получением 3-кратным более концентрированный, чем зонд для одного в точке гибридизации.
    1. Обобщить другой зонд интереса используя тот же протокол, для DIG меченых исследовали исключением того, что флуоресцеина-12-UTP должны быть заменены DIG-11-UTP. Развести продукт реакции транскрипции в РНК гибридизации буфера с получением 3-кратным более концентрированный, чем зонд для одного в точке гибридизации.
    2. Смешайте два концентрированных проб в соотношении 1: 1. Для достижения наилучших результатов используйте флуоресцеина-меченным зондом для гена, который показывает сильное выражение в один протокол гибридизация в.
  2. Используйте тот же протокол гибридизация в описанной для одного в месте </ EM> гибридизации, за исключением того, использовать двойной зонд (зонд, содержащий концентрированную смесь 1.5x дигоксигенином меченных и меченных флуоресцеином зонды) в конце первого дня вместо одного в гибридизация зонда.
    1. Следуйте один протокол гибридизации на второй день дважды протокола гибридизация в, за исключением использования антифлуоресцеин-AP Fab фрагментов в разведении 1: 4000 в месте анти-DIG-AP Fab фрагментов. Промыть избытка антитела из эмбриона, как в один протокол полевых наблюдений и провести первый цветной реакции с помощью BM-фиолетовый AP субстрата.
  3. После первого цветной реакции, инактивируют flourescein антитела в 0,1 М глицина, рН 2,0 в течение 40 мин, а затем на пять десять мин промывок в МАБ. Блок эмбрионов в МАБ + HTSS + BR в течение 90 мин. Добавить антитела анти-DIG при разведении 1: 2000 в MAB + HTSS + BR и инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
    1. На следующий день, мыть эмбрионов йoroughly в МАВ (12 промывок 30 мин), чтобы удалить избыток антитела.
    2. Вымойте эмбрионов в течение 10 мин в ЗС буфера (таблица 1), а затем окрашиваются БХИФ (0,5 мг / мл в АР буфера).
      ПРИМЕЧАНИЕ: в сочетании месте должен дать темно синего-фиолетового пятна на первый цветной реакции и светло-голубой цветовой реакции на второй (рис 5).
    3. Остановка окончательного цветной реакции путем удаления буфера AP и промыть три раза МАВ. Fix эмбрионов с Mempfa в течение 10 мин. Вымойте эмбрионов с 5 быстрых промывок в МАБ или ТБТ.
    4. С этой цветовой комбинации, использование метанола в пост окрашивания лечения уже не возможно, так как это позволит устранить одиночку цвет BCIP. Храните эмбрионов после окрашивания и фиксации в PBS с 0,02% азида натрия. Окрашивание интенсивность, может быть слабым с двойным в места нахождения имущества. Если это является проблемой, уменьшить до четырех промывок, каждое из 2 ч длительности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование тканей специфических зондов может обеспечить недостающей информации в отношении состояния развития конкретных органов. В следующих примерах, стадия эмбриона на основе промежуточной таблицы Nieuwkoop и Faber 11. Если использовать гены зонды формы, выраженные после дифференцирования, кардиального тропонина I в стадии 28-30, например (рис 1в), наличие или размер дифференцированной органа может быть оценена на любом этапе после дифференцировки. Много лет назад, эмбриологи с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Возможность использования в гибридизация для визуализации характер экспрессии специфических генов остается наиболее широко используемый метод для определения конкретных органов или типов клеток в эмбрионе Xenopus. Это из-за нескольких преимуществ этого метода. Экспрессия гена может определить конкретные структуры и перед любой гистологической знак дифференциации например, в случае для Nkx2.5 экспрессии в сердце предшественников до любого четкое разграничение этих клеток 18. После то...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов, которые они могли бы раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают благодарность CIHR за стипендию Стива Деймлинга и кафедре педиатрии Университета Западного Онтарио за поддержку Стива Деймбинга, Рами Халаби и Стефани Гровер. Эта работа была поддержана грантом NSERC R2654A11 и дополнением NSERC Discovery Accelerator

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Labguake Tube ShakersVWR17-08-2011
Флаконы VWRVWR10-07-2012
L-CysteineBioShopCYS342.500
Набор рибонуклеозидтрифосфата, 100 мМRoche11277057001
Digoxigenin-11-UTPRoche11209256910
ингибатор рназы (Rnase OUT)Инвитроген 10777-019
Т7 РНК-полимеразаферментасEPO111
Т3 РНК-полимеразаферментасEPO101
SP6 РНК-полимеразаферментасEPO131
ДНКаза 1инвитроген 18047-019
Сыворотка для овец  Wisent31150
Блокирующий реагентRoche11096176001
BM фиолетовый Ap СубстратRoche11442094001
Анти-дигоксигенин-Ap Февральные фрагментыRoche11093274910
метанолVWRCAMX0485-7
NaClBioShopSOD002.10
SDSEM 7910
EDTABioShopEDT001.500
TrisBioShopTRS003.5
Tween-20EM 9480
MgSO4SigmaM-2643
ШвабраBioShopMOP001.250
EGTASigmaE-3889-25G
ПараформальдегидBioShopPAR070.500 
Формамид  VWR       CAFX0420-4 
РНКRoche10109223001
малеиновая кислота  VWR       CAMX0100-3
три-цитрат натрия BioShopCIT001
Перекись водорода (30% раствор)EM HX0635-2
BSABioShopALB001.100
PVP-40ICN195451
Ficoll 400GE Healthcare17-0300-10
Бензиловый спиртSigmaB-1042
БензилбензоатSigmaB-6630
UltraPure Agarose Инвитроген 16500-500

Ссылки

  1. Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
  2. Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
  3. Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
  4. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  5. Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
  6. Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
  7. Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
  8. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
  10. Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
  11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
  12. Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
  13. Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
  14. Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
  15. Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
  16. Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
  17. Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
  18. Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
  19. Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
  20. Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

XenopusARO

Похожие статьи