Описанный здесь это протокол для полу-автоматизированной визуализации тканеспецифической флуоресценции у эмбрионов рыбок данио.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Полуавтоматическая изображений тканеспецифических флуоресценции у эмбрионов данио рерио
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эмбрионы рыбок данио являются мощным инструментом для крупномасштабного скрининга малых молекул. Трансгенные данио, которые выражают флуоресцентные репортер белки часто используются для выявления химических веществ, которые модулируют экспрессию генов. Химические экраны, которые анализа флуоресценции в живом рыбок данио часто полагаются на дорогой, специализированного оборудования для скрининга высокое содержание. Мы описываем процедуру с использованием стандартного эпифлюорисцентной микроскоп с моторизованным этапе для автоматической изображения эмбрионов данио рерио и выявления тканеспецифической флуоресценции. Использование трансгенных данио, что отчет о деятельности рецептора эстрогена через выражение GFP, мы разработали процедуру полуавтоматического для выявления рецептора эстрогена лигандов, активирующих репортеру в тканеспецифического образом. В этом видео мы описываем процедуры выстроив эмбрионов данио рерио в 24-48 часов после оплодотворения (ФВЧ) в 96-луночный планшет и добавляя небольшие молекулы, которые связывают рецепторы эстрогена. В 72-96 часов после оплодотворения, образы каждую лунку отвся пластина автоматически собираются и вручную проверять на тканеспецифической флуоресценции. Этот протокол демонстрирует способность обнаруживать эстрогены, которые активируют рецепторы в сердечных клапанов, но не в печени.
Введение
Трансгенные данио были разработаны, которые позволяют прямой визуализации активности в пути, такие как роста фибробластов факторы 1, ретиноевой кислоты 2 и эстрогены 3, в живых эмбрионов сигнализации. Такие инструменты позволяют скрининг для химических веществ, которые возмущают сигнальных путей (анализировали, как изменение интенсивности флуоресценции) или химических веществ, которые модулируют сигнализации в ткане-специфическим образом (изменение локализации флуоресценции) 4. Автоматизированный ввод изображений увеличивает пропускную способность химических экранов резко 5,6. Экраны, которые автоматически анализ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был одобрен Университета Алабамы в Бирмингеме институционального комитета уходу и использованию животных.
1. Данио рерио Разведение и яичные Коллекции
- За три дня до начала воздействия химикатов, собрать размножения танки с разделителями в отдельных мужчин и женщин. Заполните каждый танк наполовину с системой аквакультуры воды. Использование сети, передавать Tg (5xERE: GFP) c262/c262 рыбу рыборазводных аквариумах, размещение 2 мальчика и 3 девочки в каждом баке с перегородкой. Поместите крышку на каждом баке и этикетка с указанием даты и штаммов, которые будут скрещенными.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1 показана составных изображений из отдельных скважин 96-луночный планшет с. Каждый составное изображение состоит из 59 отдельных изображений с 5%-ым перекрытием изображения. Обратите внимание, что в прямом эфире данио ориентированы случайным образом в каждой лунке, но мы в состоянии отличить флуоресценцию в сердце из печени. Светлопольные изображения могут использоваться в качестве ссылок для оценки данио ориентацию и визуализировать морфологические аномалии (рис. 1А и 1С). .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает прямой метод, автоматически изображений тканеспецифичным флуоресценции у эмбрионов данио рерио. Протокол был разработан с использованием Zeiss Axio Observer. Z1 с дзен Синий 2011 программного обеспечения, однако методика может быть адаптирована с помощью любого инвертированного микроскопа с моторизованным стадии и программного обеспечения управления микроскопом, который может выполнять плитки для создания составных изображений. Оснащение инвертированного микроскопа с моторизованным этапе может об.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Мы благодарим Сьюзен Фармер и коллектив ЗАО данио научно-исследовательский центр для рыбок данио помощи. Финансовые средства, предоставленные пуско-наладочные средств с кафедрой фармакологии и токсикологии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пластиковые переводные пипетки; широкопроходные Fisher | 13-711-23 | ||
| Пластиковые трансферные пипетки; тонкие наконечники | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-луночные, круглые, плоские донные пластины | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35 мм пластины | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60 мм пластины | Fisher | 08-757-100B | |
| Тонкие щипцы Dumont #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | размеры наконечника 0,05 x 0,01 мм, для ручного удаления хорионов из эмбрионов |
| Трикаин метансульфонат | Sigma Aldrich | A5040-25G | см. Книга данио-рерио для рецепта (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-фенил2-тиомочевина (ПТУ) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Приготовьте запас 20 мМ (100x) и используйте при 200 мкм; M в E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol требует инвертированного флуоресцентного микроскопа с моторизованным предметным столиком | |
| с 20-кратным рабочим расстоянием | объектив Carl Zeiss | Мы используем объектив с 0,4 NA и рабочим расстоянием 8,4 | |
| мм Axiocam HRm цифровая камера | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 программное обеспечение для управления микроскопом | Carl Zeiss | Протокол требует программного обеспечения для автоматизации и управления микроскопией для получения мозаичных изображений с использованием моторизованного столика | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 грамм | составляют 2% раствор в воде обратного осмоса для использования в E3B (ниже) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl - 17,2 грамма<бр/> KCl - 0,76 г<бр/> CaCl<суб>2-2H<суб>2O - 2,9 г<бр/> MgSO<суб>4-7H<суб>2O - 4,9 грамма или MgSO4 - 2,39 грамма Растворите в 1 литре воды Milli-Q; хранить в стерильной бутылке объемом 1 литр. 1X E3B РАСТВОР ДЛЯ РЫБОК ДАНИО: 60X E3 150 мл<бр/> 2% метиленовый синий 100 μ l <чел/> Доведите до 9 литров с помощью Milli-Q вода<бр/> |
Ссылки
- Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).
- Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene exp....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
