Методическая статья

Полуавтоматическая изображений тканеспецифических флуоресценции у эмбрионов данио рерио

DOI:

10.3791/51533

⸱

17 мая 2014 г.

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь это протокол для полу-автоматизированной визуализации тканеспецифической флуоресценции у эмбрионов рыбок данио.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбрионы рыбок данио являются мощным инструментом для крупномасштабного скрининга малых молекул. Трансгенные данио, которые выражают флуоресцентные репортер белки часто используются для выявления химических веществ, которые модулируют экспрессию генов. Химические экраны, которые анализа флуоресценции в живом рыбок данио часто полагаются на дорогой, специализированного оборудования для скрининга высокое содержание. Мы описываем процедуру с использованием стандартного эпифлюорисцентной микроскоп с моторизованным этапе для автоматической изображения эмбрионов данио рерио и выявления тканеспецифической флуоресценции. Использование трансгенных данио, что отчет о деятельности рецептора эстрогена через выражение GFP, мы разработали процедуру полуавтоматического для выявления рецептора эстрогена лигандов, активирующих репортеру в тканеспецифического образом. В этом видео мы описываем процедуры выстроив эмбрионов данио рерио в 24-48 часов после оплодотворения (ФВЧ) в 96-луночный планшет и добавляя небольшие молекулы, которые связывают рецепторы эстрогена. В 72-96 часов после оплодотворения, образы каждую лунку отвся пластина автоматически собираются и вручную проверять на тканеспецифической флуоресценции. Этот протокол демонстрирует способность обнаруживать эстрогены, которые активируют рецепторы в сердечных клапанов, но не в печени.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансгенные данио были разработаны, которые позволяют прямой визуализации активности в пути, такие как роста фибробластов факторы 1, ретиноевой кислоты 2 и эстрогены 3, в живых эмбрионов сигнализации. Такие инструменты позволяют скрининг для химических веществ, которые возмущают сигнальных путей (анализировали, как изменение интенсивности флуоресценции) или химических веществ, которые модулируют сигнализации в ткане-специфическим образом (изменение локализации флуоресценции) 4. Автоматизированный ввод изображений увеличивает пропускную способность химических экранов резко 5,6. Экраны, которые автоматически анализа флуоресценции в живом рыбок данио часто полагаются на дорогой, специализированного оборудования. Так называемый скрининг высокого содержания обеспечивает преимущества высокого разрешения, количественного изображений, но за счет использования специализированных читателей пластины оборудованные для конфокальной микроскопии 7,8. Цель этого метода состоит в автоматическом анализе тканеспецифичным флуоресценции у эмбрионов данио рериов 96-луночный планшет с использованием стандартного эпифлюорисцентной микроскопа. Тканеспецифическая флуоресценции можно отличить с помощью этой техники и может быть разумным подходом для лабораторий, которые не имеют доступа к специализированным читателей пластины или высокой-контент оборудования для досмотра.

В этом протоколе, мы используем автоматизированную изображений для обнаружения тканеспецифической рецептора эстрогена (ER) агонисты в живом рыбок данио в 3 дней после оплодотворения (DPF). Трансгенной линии Tg (5xERE: GFP) c262/c262 содержит 5 тандем реагирования эстрогена элементов последовательности ДНК (ЭРД) вверх по течению от зеленого флуоресцентного белка (GFP) 3. В отсутствие лиганда, ERS обычно неактивны. Связывание лиганда вызывает конформационные изменения, что позволяет рецепторы для связывания ERE ДНК и регулируют транскрипцию 9. 5xERE: GFP рыба может быть использован для скрининга химических библиотек для ER модуляторов и может быть использован для скрининга образцов окружающей воды для эстрогенных загрязнений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был одобрен Университета Алабамы в Бирмингеме институционального комитета уходу и использованию животных.

1. Данио рерио Разведение и яичные Коллекции

  1. За три дня до начала воздействия химикатов, собрать размножения танки с разделителями в отдельных мужчин и женщин. Заполните каждый танк наполовину с системой аквакультуры воды. Использование сети, передавать Tg ​​(5xERE: GFP) c262/c262 рыбу рыборазводных аквариумах, размещение 2 мальчика и 3 девочки в каждом баке с перегородкой. Поместите крышку на каждом баке и этикетка с указанием даты и штаммов, которые будут скрещенными.
  2. На следующее утро, снять все барьеры и наклона перегородки для создания мелководье на одном конце разведении танк. Разрешить данио к спариванию, сбора эмбрионов на 10-минутные интервалы для обеспечения точного постановку развития. Чистые яйца по полоскания через ситечко с помощью E3B среднего и осторожно промойте эмбрионов в чашки Петри. Вернуться взрослых рыб в постоянноетанки.
  3. Использование рассекает микроскопом, сортировать, рассчитывать, и удалите все неоплодотворенные, аномальные или поврежденные эмбрионы. Место эмбрионов в чашках Петри в E3B средних и дома в 28,5 ° C с 14:10 свете: темно-цикла. Плотность эмбрионов может повлиять на развитие. Поместите не более 100 эмбрионов в мм блюдо 100 х 35 и не более 50 эмбрионов в мм блюдо 60 х 15.
  4. К 24 часов после оплодотворения, замените носитель с E3B содержащей 200 мкм 1-фенил 2-тиомочевины (ПТУ). ПТУ предотвращает образование пигмента и держит эмбрионов данио и личинок прозрачную для улучшения четкости изображения. ВНИМАНИЕ: концентрированный ПТУ акции опасными; носить перчатки при принятии решения E3B + ПТУ.
  5. В 1 день после оплодотворения (DPF), вручную удалить хориона от каждого эмбриона с использованием тонких щипцов. Хорион, кажется, не влияет проникновение эстрогенов, однако удаление увеличивает четкость изображения. Там нет необходимости, чтобы удалить хорионов из средств массовой информации. ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы ручной dechorionation, партии эмбрионов может быть чечески dechorionated с использованием 1 мг / мл проназы обработку, как описано выше 11.

2. Химическая обработка эмбрионов

  1. За день до лечения, подготовить исходные растворы каждого химического вещества в концентрации 1,000 раза в ДМСО (или соответствующем растворителе). Например, чтобы выставить эмбрионов до 10 мкм бисфенола А (BPA), подготовить исходный раствор 10 мМ BPA в 100% ДМСО. Это обеспечивает однородную концентрацию ДМСО в каждой обработки и позволяет нетоксичный 1:1000 разбавление ДМСО в качестве контроля транспортного средства. Магазин растворы при температуре -20 ° С. Для этого протокола, эмбрионы будут подвергаться воздействию 1 мкМ и 10 мкМ БФА, 18,5 нМ и 1,85 мкМ генистеина, 367 нМ эстрадиола (положительный контроль) и транспортного средства (0,1% ДМСО, отрицательный контроль).
    ВНИМАНИЕ: Химические вещества, такие как BPA и эстрадиола являются опасными и могут иметь негативное влияние на плода человека. Ручка эндокринные расстройства с осторожностью и всегда использовать средства личной защиты.
  2. В день лечения, оттепель подготовлен фондовые химические растворы. Развести 1:1000 с помощью пипетки 1 мл E3B + ПТУ в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и добавляя 1 мкл складе химического раствора. Vortex энергично. Развести ДМСО 1:1000 в E3B + ПТУ в качестве контроля транспортного средства. С помощью 1 мл E3b + PTU в 1,5 мл микроцентрифужных трубки в качестве необработанного контроля.
  3. Использование большого отверстие пластик передачи пипетки, эмбрионы передачи из чашек Петри в каждую лунку 96-луночного планшета, 3 эмбрионов на лунку, 3 скважины в состоянии. Для предотвращения испарения в течение длительного лечения, опустить эмбрионов из внешних строк и столбцов пластины (строки А и Е, колонн 1 и 12). Внешние скважины могут быть заполнены 300 мкл E3B + ПТУ. Этикетка крышку пластины соответствующим образом.
  4. Удалить вложение из каждой лунки с тонкой наконечником пластиковые пипетки. Работают быстро, чтобы избежать высыхания эмбрионов.
  5. Добавить 200 мкл раствора для обработки в соответствующую лунку. Поместите крышку недеформированнойrneath пластину в качестве руководства для обеспечения добавление лечения в соответствующие лунки. Vortex каждая трубка до пипетки, чтобы распределить химического вещества в растворе. Визуально подтверждают друг эмбрион в обрабатывающем растворе. Если эмбрионы на стороне колодца, используйте чистую передачи пипетки, чтобы вымыть их в колодец с решением лечения.
  6. Место пластины в инкубатор на 28,5 ° С. Эмбрионы будут проанализированы для флуоресценции при 72 часов после оплодотворения.

3. Автоматизированная изображений эмбрионов в 96-луночных

  1. Обезболить эмбрионов путем добавления 10 мкл 4 мг / мл Tricaine в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболить эмбрионов до визуализации. В 24-96 часов после оплодотворения, данио демонстрируют самопроизвольное движение и ответ испуга к меняющейся источника света во время захвата изображения. Обезболивающий эмбрионов уменьшает движение во время съемки.
  2. Место пластины 96-а в моторизованной стадии и калибровки на сцену. Использование Zeiss Zen синий 2011 программного обеспечения для микроскопии автоматизацна и контроль, выберите опцию образец носителя и выберите многоямного 96. Выберите калибровку. Следуйте пошаговой направления для калибровки на сцену.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимите кнопку плитки после этого шага. Если кнопка плитка не установлен, настройки калибровки могут быть потеряны и 96-луночный планшет необходимо будет калибровать.
  3. Использование 10x объективом и светлого (BF) установки, определить положительное управления эмбриона и установить настройки экспозиции соответственно для BF и GFP каналов, убедившись, что сигнал флуоресценции не насыщая камеру. Сосредоточьтесь на одном эмбриона и запрограммировать микроскоп, чтобы приобрести 3 всего Z-секций, одно изображение 50 мкм выше и один 50 мкм ниже текущей фокальной плоскости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку различные ткани занимают разные фокальных плоскостей, это гарантирует, что для каждого данио изображения будут захвачены с сердца и печени в центре внимания.
  4. Установите параметры программных приобрести выложены изображения с помощью GFP и BF каналлевая сторона На вкладке приобретения, выберите дополнительные настройки. Выбор регионов плитка, то плитка. Выберите опцию круг хорошо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Черепица используется для создания изображения каждой лунки. Одно поле-обзора захватывает только небольшую часть каждую лунку. Функция плитка может автоматически захватить несколько соседних полей-обзора из каждой лунки, создавая составное изображение всего скважины. Таким образом, можно автоматически захвата 96 составных изображений на тарелку, где каждый составное изображение содержит несколько десятков отдельных изображений из одной скважины.
  5. Выберите носитель и коэффициент заполнения 90%. Выбор коэффициент заполнения 90% будет захватить несколько изображений выбранных скважин таких, что 90% площади каждой лунки будут видны в комбинированном изображении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе коэффициента заполнения, диаграмма будет отображаться представляющий область для включения в образ. Выберите процент, который будет включать в себя зону скважины, который подходит для эксперимента.
  6. В разделе Параметры выберите величину перекрытия лучшего.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При сшивая плитки для одного представительного изображения, перекрытие 5-10% обеспечивает плавный шов между изображениями. Однако, если изображение шить не является необходимым, используя 0% перекрытие сократит время обработки изображений. Использование 90% коэффициент заполнения и 5% перекрытие, составное изображение из одной скважины состоит из 59 отдельных изображений.
  7. Начните изображений. Микроскоп автоматически получать изображения.
  8. Вручную проверять составные изображения каждой лунки для тканеспецифической флуоресценции (рис. 1).
  9. ПРИМЕЧАНИЕ: Это лучше всего начать с положительного контроля, чтобы убедиться, что химическое воздействие работал до наблюдения экспериментальных скважин лечения.

4. Руководство Image Capture эмбрионов в 96-луночный планшет

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения результатов следует использовать 20x длиннее расстояние цели в переменныйдесть более детальные изображения вручную (рис. 2).

  1. Использование 20x объективом и светлого (BF) установки, определить положительное управления эмбриона и установить настройки экспозиции для BF и GFP каналов соответственно, убедившись, что сигнал флуоресценции не насыщая камеру.
  2. Определить индивидуальные эмбрионов и снимать вручную.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как параметры экспозиции были отобраны, положительного контроля эмбриона, не изменить настройки. Это позволяет сравнение интенсивности флуоресценции как каждом снимке на единообразных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показана составных изображений из отдельных скважин 96-луночный планшет с. Каждый составное изображение состоит из 59 отдельных изображений с 5%-ым перекрытием изображения. Обратите внимание, что в прямом эфире данио ориентированы случайным образом в каждой лунке, но мы в состоянии отличить флуоресценцию в сердце из печени. Светлопольные изображения могут использоваться в качестве ссылок для оценки данио ориентацию и визуализировать морфологические аномалии (рис. 1А и 1С). ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает прямой метод, автоматически изображений тканеспецифичным флуоресценции у эмбрионов данио рерио. Протокол был разработан с использованием Zeiss Axio Observer. Z1 с дзен Синий 2011 программного обеспечения, однако методика может быть адаптирована с помощью любого инвертированного микроскопа с моторизованным стадии и программного обеспечения управления микроскопом, который может выполнять плитки для создания составных изображений. Оснащение инвертированного микроскопа с моторизованным этапе может об...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Сьюзен Фармер и коллектив ЗАО данио научно-исследовательский центр для рыбок данио помощи. Финансовые средства, предоставленные пуско-наладочные средств с кафедрой фармакологии и токсикологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пластиковые переводные пипетки; широкопроходные Fisher13-711-23
Пластиковые трансферные пипетки; тонкие наконечникиFisher13-711-26
96-луночные, круглые, плоские донные пластиныFisher21-377-203
100 x 35 мм пластиныFisher08-757-100D
35 x 60 мм пластиныFisher08-757-100B
Тонкие щипцы Dumont #5Fine Science Tools11254-20размеры наконечника 0,05 x 0,01 мм, для ручного удаления хорионов из эмбрионов
Трикаин метансульфонатSigma AldrichA5040-25Gсм. Книга данио-рерио для рецепта (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) 
1-фенил2-тиомочевина (ПТУ)Sigma AldrichP7629-10GПриготовьте запас 20 мМ (100x) и используйте при 200 мкм; M в E3B 
Zeiss Axio Observer Z1Carl ZeissProtocol требует инвертированного флуоресцентного микроскопа с моторизованным предметным столиком
с 20-кратным рабочим расстояниемобъектив Carl ZeissМы используем объектив с 0,4 NA и рабочим расстоянием 8,4
мм Axiocam HRm цифровая камераCarl Zeiss
ZenBlue 2011 программное обеспечение для управления микроскопомCarl ZeissПротокол требует программного обеспечения для автоматизации и управления микроскопией для получения мозаичных изображений с использованием моторизованного столика
Methylene BlueSigma AldrichMB-1; 25 граммсоставляют 2% раствор в воде обратного осмоса для использования в E3B (ниже)
E3B60X E3 SOLUTION:
NaCl                                      - 17,2 грамма<бр/> KCl                                            - 0,76 г<бр/> CaCl<суб>2-2H<суб>2O        - 2,9 г<бр/> MgSO<суб>4-7H<суб>2O  - 4,9 грамма или MgSO4 - 2,39 грамма
Растворите в 1 литре воды Milli-Q; хранить в стерильной бутылке объемом 1 литр.

1X E3B РАСТВОР ДЛЯ РЫБОК ДАНИО:
60X E3          150 мл<бр/> 2% метиленовый синий        100 μ l  <чел/> Доведите до 9 литров с помощью Milli-Q вода<бр/>  

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).
  2. Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
  3. Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
  4. Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
  5. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
  6. Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
  7. Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
  8. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
  9. Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
  10. Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
  11. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

96GFPZ

Похожие статьи