Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В пробирке клеточных культур модели для токсичных ингаляционной химической тестирования

10.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51539

⸱

8 мая 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Airway Research Center, Department of Pediatrics, University of Colorado, 2Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предназначен для демонстрации метода экспозиции клеточных культур в ингаляционных токсичных химических веществ. Выдержка из дифференцированной воздуха и жидкой фаз (ALI) культур эпителиальных клеток дыхательных путей предоставляет уникальную модель воздействия дыхательных путей токсичных газов, таких как хлор. В этой рукописи мы опишем эффект воздействия хлора на воздух-жидкость культур эпителиальных клеток и глубинной культуре кардиомиоцитов. В пробирке системы воздействия позволяют важные механистические исследования для оценки пути, которые могли бы быть использованы для разработки новых терапевтических агентов.

Аннотация

Клеточные культуры необходимы для развития и изучения эффективности терапевтических агентов, до их использования в животных моделях. У нас есть уникальная возможность моделировать хорошо дифференцированных человеческих эпителия дыхательных путей и клетки мышцы сердца. Это может быть бесценным инструментом для изучения вредных эффектов токсичных ингаляционных химических веществ, таких как хлор, которые могут нормально взаимодействовать с поверхности клеток, и образуют различные побочные продукты при взаимодействии с водой, а также ограничение их последствий в затопленных культур. Наша модель, используя хорошо дифференцированных культур человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток на радиоинтерфейса-liqiuid обходит это ограничение, а также предоставляет возможность оценить критические механизмы токсичности потенциальных ядовитых ингаляционных химических веществ. Мы описываем повышенную потерю целостности мембраны, каспазы-релиз и смерть токсичных вдыхаемого химических например воздействия хлора. В этой статье мы предлагаем методы для моделирования воздействия хлора в сердце млекопитающих и дыхательных путей эпителиальных слоктей в культуре и простых тестов, чтобы оценить его влияние на этих типов клеток.

Введение

Воздействие токсичных химических веществ, вдыхаемых (тики) / газы, такие как хлор (Cl 2) остается постоянной проблемой здравоохранения в случайных воздействий, а также в их потенциальное использование в качестве химического агента угрозы. Хотя легкие являются первичной мишенью, органы, такие как сердце и мозг, также страдают 1-3. IN VIVO модели, как правило, используется для тестирования токсичности от ТЭП, но в пробирке тесты для оценки токсичности проще, быстрее и более экономически эффективным. В модели пробирке также предусмотреть возможность широкого исследования агент-клеточных взаимодействий, которые могут быть трудно оценить в естественных условиях. Такие пробирке системы, связанный с воздействием редки и, более того, в некоторых обычных моделей, где токсичные вещества добавляются к культуральной среде, в которой клетки погруженной, свойства агентов могут изменяться в связи с взаимодействиями и связывание с компонентами в среде. В таких случаях клеточных систем культуры, таких как воздух-жидкость (ALI) культур первичных человеческих эпителиальных клеток дыхательных путей, предлагаемых здесь, которые могут быть непосредственно подвергающихся газообразных агентов может быть перспективным.

Эпителиальные клетки, выстилающие дыхательные пути являются первыми линии обороны против ингаляционных токсичных химических веществ. Человеческий эпителий дыхательных путей образует физический барьер между просветом и нижележащих клеток в легких и участвует в реакции легких. Она производит ряд цитокинов и других про-и противовоспалительных средств, а также выделяет поверхностную слизь / дыхательных путей жидкостью (ASL), покрывающую эпителий. Одним из ограничений в обычных погружен в культурах клеток также, что ASL и слизи, которые покрывают поверхности эпителиальных удалена или разбавленный. Это не отражает физиологическое состояние легких эпителиальных клеток, которые подвергаются воздействию воздуха. Таким образом, идеал в системе экстракорпорального для испытаний на токсичность TIC должны повторить эту архитектуру. Существует большой интерес к разработке быстрого скрининга мethods которые предсказывают в естественных условиях токсичности. Эпителиальные клетки, выращенные на ALI дифференцировать и имеют хорошо дифференцированные структуры и функции по сравнению с клетками, выращенных затопленных и служить превосходной модель дыхательных путей.

В этом исследовании, мы описываем использование воздушно-жидкостным интерфейса культуры человеческого дыхательных путей (трахеобронхиального) эпителиальных клеток для тестирования ядовитый вдыхаемый газ токсичность и сравнить его с глубинной культуре клеток кардиомиоцитов, следовательно, изучая еще один важный цель токсичности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Крыса кардиомиоцитов Культуры

  1. Все эксперименты проводились под протоколами, утвержденными институциональной уходу и использованию животных комитета, IACUC.
  2. Получить кардиомиоцитов крыс из сердец (желудочков) самцов крыс (240-260 г), используя методы, описанные ранее 4. Вкратце, обезболить животных с помощью внутрибрюшинного введения пентобарбитала (100 мг / кг; подтвердить анестезию ног метода пинч), а затем удалить сердца в 10,0 мл, 1 мМ Ca 2 +, содержащей Кребс звонка буфер, рН 7,4.
  3. Промыть сердцах 5-6х для удаления крови, а затем переключиться на Ca 2 + свободного буфера Кребса Рингера, содержащего 0,02% протеазы и 0,06% коллагеназы А (5,0 мл / сердце). Инкубируйте сердца в этом растворе в течение 10-15 мин при 37 ° С с периодическим встряхиванием.
  4. После 10-15 мин, смыть ферментативную решение с Ca 2 + свободного буфера Кребса Рингера для еще 5 мин. Отпустите клетки от вялого ткани намиING 25 мл пипетки с помощью пипетки подвески вверх и вниз несколько раз.
  5. Отделите клетки от ткани путем фильтрации через нейлоновую сетку 70 мкм и позволить им поселиться в Кребса Рингера буфере, содержащем 0,1 мМ Ca 2 +. Приостановить осадок клеток в 1,0 мл Кребс Ringer буфере, содержащем 0,2 мМ Ca 2 +.
  6. Осторожно слой над 5,0 мл 60 мкг / мл бычьего сывороточного альбумина, BSA, в 15 мл центрифужные пробирки, чтобы отделить кардиомиоцитов из nonmyocytes и дать им возможность поселиться в течение 30 мин. Кардиомиоциты тяжелее и перейти к нижней части трубы. Удалить тщательно супернатант клеток и средств массовой информации. Повторите этот шаг один раз для дальнейшей очистки клеток.
  7. Постепенно переход промывкой (с шагом использованием 0,25, 0.5 мм, 0,75 мм, и 1,0 мМ Ca 2 +, содержащий буфер) желудочковой миоциты / кардиомиоцитов до 1,0 мм Ca 2 +, содержащий буфер и ресуспендировали в ACCT среде, состоящей из Игла в модификации Дульбекко , DMEM containiнг 2 мг / мл BSA, 2 мМ L-карнитин, 5 мМ креатин, 5 мМ таурина, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
  8. Plate кардиомиоцитов в ACCT среде при плотности от 100 до 150 клеток / мм 2 на 100 мм или 35 мм ламинином покрытием пластмассовые чашки для культивирования или 40 х 22 мм покровные стекла, предварительно покрытых ламинином (1 мкг / см 2). Через 1 ч мыть посуду с 2,0 мл АККТ для удаления клеток, которые не прикреплены. Добавить 10,0 мл свежей средой и инкубировать клетки.

2. Дифференцированный воздуха и жидкости интерфейс (ALI) Культура человека эпителия дыхательных путей базальных клеток

  1. Закупка трахеобронхиального тканей человека от Национального заболеваний Научно-исследовательского обмена под Institutional Review Board одобрил протоколы. Урожай сотовый и выполнять культуру, используя процедуры, опубликованной 5,6. Эта процедура использует клеточные культуры, поскольку они являются точным модель для человеческого ингаляционных воздействиях ТЭП, однако, при необходимости можно изолировать и вырастить на Али М.О.использовать и / или крыса эпителиальных клеток дыхательных путей 7,8.
  2. Вкратце, сделать небольшие кусочки (~ ¼ дюйма) на ткани после удаления всех соединительной ткани и лимфатические узлы. Вымойте ткань несколько раз в растворе Рингер-лактата. Добавить тканей к 50 мл коническую трубку и добавить протеазы решение (1% Protease/0.01% ДНКазную в минимальной необходимой информации, сувениры, ткани соотношения жидкости (1:10)).
  3. Rock ткани при 4 ° С в течение ночи. Конец диссоциации ткани добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Царапать поверхность эпителиального с хирургическим скальпелем и сбора клеток путем центрифугирования (2000 оборотов в минуту в течение 10 мин).
  4. Пластина клеток при прохождении один на покрытые коллагеном snapwells в специальной ALI среде, приготовленной, как описано подробно Фулчер и др. 9. Культура в течение 5 дней до перехода на воздух и жидкой фаз (ALI), удаляя верхушечные СМИ.
  5. Поток клеток с использованием ALI СМИ каждый дополнительный день и позволяют клеткам дифференцироваться в дополнительных 2-3 недели (наблюдать многочисленные избиения реснички и секрецию слизи) перед выполнением воздействия. Вымойте апикальной поверхности теплой PBS наряду с изменениями СМИ.

3. Хлор экспозиции

  1. Содержат систему экспозиции хлора (ЕЭП) внутри квалифицированным химической капот с оперативной скоростью лица 100 футов в минуту, что обеспечивает необходимую вторичную защитную оболочку, чтобы предотвратить облучение персонала в случае аварийных утечек хлора.
  2. Функционирование системы при небольшом избыточном давлении (0,5 дюйма воды). Сухой воздух подается в 15 л / мин и соответствующий уровень хлора подается для достижения желаемой конечной концентрации хлора. Камеры имеют фиксирующий крышку с 4 мини-BCU замков и низкой твердомера силиконовой прокладкой, чтобы обеспечить герметичное уплотнение.
  3. Доставьте Cl 2 смесь через регулятор массового расхода. CES использует газовый баллон сжатого, содержащего 1,0% Cl 2 в атмосфере сухого азота.
  4. Регулировать разрежающего воздуха с помощьюспециально созданных панель управления и так же регулировать концентрацию Cl 2 доставлены в камеры облучения. Низкий объем насос отбора проб тянет выхлопных газов от камеры в анализатор хлора для мониторинга концентраций, которые затем записанные на регистратор данных, подключенный к анализатору.
  5. Измерение скорости потоков в камерах перед воздействием использованием расходомера, чтобы обеспечить равные скорости доставки и выхлопных газов.
  6. Подготовьте клеточных культур для воздействия удалением надосадочной СМИ и добавления свежей среды (базолатеральных СМИ в ALI культур). Любые виды предварительной обработки с агентами могут быть выполнены в это время.
  7. Expose культур Али эпителиальных клеток дыхательных путей, чтобы Cl 2 газа (50, 100 или 300 частей на миллион в течение 30 мин) в двух запечатанных полисульфоновую биоизоляции камер. Кардиомиоциты (погруженный или Конфлюэнтные культуры на мембранах) подвергаются 50 или 100 частей на миллион Cl 2 в течение 15 мин.
  8. После воздействия не промойте камеры с воздухом до Cл 2 уровень падает ниже 1 промилле и может быть безопасно открыт для удаления клеток (в течение 5 мин).

4. Трансэпителиального электрического сопротивления (TER) Измерение

  1. Измерьте TER воздушно-жидкостной-интерфейс, АЛИ, культуры, используя эпителиальный voltohmmeter с парой хлорид серебра "палочку" электродами.
  2. Равновесие палочку электрод в АЛИ СМИ 15 мин перед использованием.
  3. Добавить теплую СМИ, чтобы верхушечная (1,0 мл) и базолатеральная (2,0 мл) поверхность и измерьте TER с помощью палочки для еды электроды voltohmmeter.
  4. Dip более короткий рычаг электрода в апикальных сред и чем дольше руку в базолатеральной массовой информации. Нажмите кнопку "мера" на voltohmmeter оценить электрическое сопротивление.
  5. Voltohmmeter имеет опцию для измерения Ом или кОм. Вычтите сопротивление через поддержку культуры бесклеточной от сопротивления, измеренного на каждом клеточном слое с получением трансэпителиальных сопротивление (TER).

Каспазы измерения 5.

  1. Добавить свежий ALI носитель (2,0 мл) в базолатеральной поверхности после облучения и инкубировать в клетку при комнатной температуре. Сбор супернатант СМИ на 4 и 24 часов.
  2. Измерьте каспазы 3/7 деятельность в средствах массовой информации супернатантов с использованием коммерческого каспазы 3/7 набора для анализа.

6. Вестерн-блот и Иммуноцитохимия

  1. Выполните вестерн-блоттинга с использованием клеточных лизатов, как описано выше 10. Приостановить лизат белков (20 мкг) в 5-кратным сниженной буфера для образцов и кипятить в течение 5 мин. Тема белка лизата в ДСН-ПААГ (4-15%) и передать выделенные белки на нитроцеллюлозную мембрану посредством электрофореза блоттинга.
  2. Блок неспецифическое связывание путем инкубации мембрану с 5% молоке в промывочном буфере (PBS + 0,1% моющего средства) и зонда мембраны с первичными антителами против SERCA2 или саркомера актина в разведении 1:1000, в течение ночи при 4 ° С. Затем промыть и выдержать в мембраны с соответствующими пероксидаза-конъюгированными вторичными антителами и развивать для обнаружения, как описано выше 10 с использованием коммерческого набора обнаружения пероксидазы.
  3. Для лечения иммуноцитохимии живые клетки, выращенные на вставками или покровные стекла в 6-луночные планшеты с 0,4% Triton-X-100 в 10 мМ буфере цитрата натрия в течение 20 мин после промывки PBS.
  4. Блок неспецифического связывания обработкой клеток с 5% сыворотки осла в течение 20 мин, а затем инкубируют клетки с неспецифическим IgG или отдельных первичных антител, специфичных к саркомера актина или Ki-67.
  5. Промывают клетки с PBS и инкубировали с флуоресцентными-конъюгированные вторичные антитела для выявления первичного антитела и окрашивающим ядра (1 мкг / мл DAPI).
  6. Промыть PBS и смонтировать покровные с использованием коммерческих монтажные СМИ.
  7. Визуализируйте окрашивание с помощью флуоресцентного микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Первичная стержневых кардиомиоциты установка на ламинином матриц и распространения и дифференцироваться в сливающихся культур (рис. 1А и его вставку). Эти клетки были дополнительно характеризуется на основе саркомера актина и выражения SERCA2 (фиг. 1В и 1С). Крыса кардиомиоциты сильно подвержены хлора токсичности как 15 мин воздействия 100 частей на миллион хлора причинили значительный округление клеток и смерть в затопленных культур и нарушению сливающихся слоев на кле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее распространенным типом острых токсичных веществ происходит, когда один дышит ядовитый химикат в легкие. Эти химические вещества могут также быстро переносят в кровоток и может повлиять на другие органы, такие как мозг и сердце. Ингаляционная токсичность различных агентов, использующих животных моделей изучаются и сообщил широко, однако механизмы менее понятны. Это главным препятствием в разработке эффективных методов лечения. Отсутствие пробирке систем воздействия в является основной причиной ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование проводится при поддержке Программы противодействия, Национального института здоровья (NIH), Канцелярии Директора и Национального института гигиены окружающей среды наук (NIEHS) номер гранта U54 ES015678 (CWW). SA также поддерживается Детской больнице Колорадо / Colorado School шахт Сотрудничество Пилот премии # G0100394 и Детская больница Колорадо Исследования Institue Пилот премии # G0100471.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Крысы Harlan LaboratoriesSprague-Dawley 
ПентобарбиталSigma-AldrichP3761
ChlorineAirGas, IncX02NI99CP163LS1
Каспазы 3/7 kit PromegaG8091
Эпителиальный вольтомметр и электрод для едыWorld Precision InstrumentsEVOM и STX2
Snapwell вставкиCorning07-200-708
70 микрон нейлоновый сетчатый фильтрCorning#352360
Полисульфоновые камеры биосдерживания BCU, Allentown Cage EquipmentBCU
DMEMLife technologies12491-015
Антитело к саркомерному актинуAbcam Cambridge, MAab28052
Антитело SERCA2Affinity Bioreagents, Golden, COMA3-9191
антитело Ki-67Dako, Carpinteria, CAM7248
Alexa 488-конъюгированное вторичное антителоInvitrogen, Гранд-Айленд, Нью-ЙоркA11029
BSASigma-AldrichA9418
КарнитинSigma-AldrichC0283
ТауринSigma-AldrichT8691
КреатининSigma-AldrichC6257
Krebs Ringer BufferSigma-AldrichK4002
ProteaseSigma-AldrichP5147
КоллагеназаSigma-AldrichC6885
ДНКазаSigma-AldrichDN-25
Lactated Ringer solutionAbott Laboratories7953
Сыворотка ослаFisher Scientific017-000-001
PBS, фосфатно-солевой буферSigma-AldrichD1408
4-15% гели SDS-PAGEBio-Rad456-1083
Нитроцеллюлозная мембранаBio-Rad162-0115
Dergent, Tween Sigma-AldrichP1379
Набор для обнаружения пероксидазыPierce3402
DAPISigma-AldrichD9542
Монтажный материал, Fluormount GeBiosciences00-4958-02
Цитрат натрияSigma-Aldrich71497
КоллагенSigma-AldrichC7521
MEMSigma-AldrichM8028
LamininBD biosciences354259
пенициллин/стрептомицинLife Technologies15070063
FBSGibco200-6140AJ

Ссылки

  1. Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
  2. Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
  3. Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
  4. Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
  5. Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
  6. Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
  7. Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
  8. Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
  9. Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
  10. Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10(2011).
  11. Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
  12. Evans, R. B. Chlorine: state of the art. Lung. 183, 151-167 (2005).
  13. Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
  14. Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
  15. Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Воздействие хлораэпителий дыхательных путей человекакардиомиоциты крысытрансэпителиальное электрическое сопротивлениевысвобождение каспаз 3 и 7потеря целостности мембранвытяжной шкафизмерение расходомеромапоптотическая гибель клеток
В пробирке клеточных культур модели для токсичных ингаляционной химической тестирования
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.