Method Article

Линейного усиления опосредованного ПЦР - Локализация генетических элементов и характеристика Неизвестного фланговые ДНК

DOI:

10.3791/51543

⸱

June 25th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Oncology, National Center for Tumor Diseases (NCT) and German Cancer Research Center (DKFZ)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Линейно-амплификации опосредованной (ЛАМ)-ПЦР является метод, разработанный для определения точных координат интеграции вирусных векторов в геноме. Техника развивались, чтобы быть лучшим методом для изучения клоновых динамику у пациентов генной терапии, биобезопасности новых векторных технологий, Т-клеточного разнообразия, моделей стволовых раковых клеток, и т.д.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Линейная амплификация-опосредованная ПЦР (LAM-ПЦР) была разработана для изучения гемопоэза в генно-скорректированных клетках пациентов, получавших генную терапию с интегрирующими векторными системами. Благодаря стабильной интеграции ретровирусных векторов, сайты интеграции могут быть использованы для изучения клональной судьбы отдельных клеток и их потомства. LAM-ПЦР впервые предоставила доказательства того, что лейкемия у пациентов, получавших лечение генной терапией, произошла от вызванной провирусом гиперэкспрессии соседнего протоонкогена. Высокая чувствительность и специфичность LAM-ПЦР по сравнению с существующими методами, такими как обратная ПЦР и лигионно-опосредованная (LM)-ПЦР, достигается за счет начального этапа предварительной амплификации (линейная ПЦР из 100 циклов) с использованием биотинилированных векторных специфичных праймеров, которые позволяют проводить последующие этапы реакции на твердой фазе (магнитные шарики). ЛАМ-ПЦР в настоящее время является наиболее чувствительным методом идентификации неизвестной ДНК, которая находится в непосредственной близости от известной ДНК. Недавно был разработан вариант ЛАМ-ПЦР, который обходит рестрикционный дайджест, тем самым устраняя смещение поиска сайтов интеграции и позволяя проводить комплексный анализ расположения провирусов в геномах хозяина. В следующем протоколе шаг за шагом объясняется амплификация как 3'-, так и 5'-последовательностей, прилегающих к интегрированному лентивирусному вектору.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Линейно-амплификации опосредованной ПЦР (LAM-ПЦР) позволяет идентификации и характеристике неизвестный фланговый ДНК, прилегающей к известной ДНК любого происхождения. Более конкретно, LAM-ПЦР был разработан, чтобы локализовать вирусный вектор сайтов интеграции (IS) в геном хозяина 1,2. Генетические элементы, такие как ретровирусов или транспозонов интегрировать их геном в геном хозяина в (полу-) случайным образом 3-6. Во многих случаях это является решающим точно знать позицию, где интегрированную эти векторы. LAM-ПЦР было доказано, что превосходит альтернативных методов, таких как перевязки опосредованного ПЦР 7 и его вариантов или обратной ПЦР 8. Чувствительность и надежность этого метода возникает в результате первоначального предварительного усиления вектора-генома развязок и магнитного выбора усиленных продуктов ПЦР. Как и альтернативных методов, указанных, LAM-ПЦР основан на использовании ферментов рестрикции, введение ошибку в поисковой мощностью 9-11. Таким образом,только подмножество репертуара (integrome) могут быть обнаружены в одной реакции. Это смещение минимизируется параллельного анализа данного образца, используя оптимальные комбинации ферментов рестрикции 9. Недавно вариант технологии называют не ограничивающими LAM-ПЦР (nrLAM-PCR) была разработана, что обходит использование ферментов рестрикции и позволяет объективную генома анализ образца в одной реакции 9,12.

В прошлом LAM-ПЦР был использован для идентификации причинным ретровирусная порождает лейкемии у нескольких пациентов в клинических испытаниях генной терапии 13-15. С тех пор, LAM-ПЦР была адаптирована для выявления IS от других интегрирующих векторов (лентивирусные векторы, транспозонов), а также для выявления интеграционных моделей пассивно интеграции векторы, как аденоассоциированные векторов (AAV) или интегразы исправный лентивирусов (IDLV) 16 -21. Применение LAM-ПЦР широкое распространение: традиционнаялы, этот метод широко используется для изучения клональную состав генов изменение клеток у пациентов, которые подверглись генной терапии или для оценки биобезопасности новых векторных систем на распутывание их поведение интеграции 15,16,22-24. Недавно LAM-ПЦР позволили установить специфику и мимо ворот деятельность дизайнера нуклеаз путем IDLV захвата анализа 25.

Кроме того, LAM-ПЦР позволяет легко следить за судьбу трансдуцированной клетки с течением времени в организме. Это позволяет определить протоонкогенами а также гены-супрессоры опухолей, а также для изучения гемопоэза или раковых стволовых клеточной биологии 26-28. Не в последнюю очередь, LAM-ПЦР была адаптирована для изучения разнообразия Т-клеточный рецептор у человека 29 (и неопубликованные данные).

Внутренняя сила технологии подкрепляется связывая метод для глубоких технологий секвенирования, которые позволяют характеризующие миллионы неизвестного фланговые ДНК с одной нуклеотидной гesolution в целых геномов. В следующем протокола, мы опишем шаг за шагом усиление и определение сопутствующих неизвестный ДНК образцово определить лентивирусный вектор. Олигонуклеотиды, используемые в протоколе приведены в таблице 1. Экстрагированной ДНК или кДНК из любого источника может быть использован в качестве ДНК-матрицы для LAM-ПЦР и nrLAM-PCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение Linker кассет (LC)

  1. Смешать 40 мкл олигонуклеотида LC1 (табл. 1), 40 мкл олигонуклеотида LC2 (табл. 1, с надлежащей рестрикционного фермента свеса), 110 мкл Трис-HCl (100 мМ, рН 7,5) и 10 мкл 250 мМ MgCl 2.
  2. Инкубировать при 95 ° С в течение 5 мин, и пусть реакции медленно остыть до комнатной температуры. Добавьте 300 мкл H 2 O и сосредоточиться dsLinker-ДНК на центрифугирования фильтра. Добавить 80 мкл H 2 O в элюата и аликвотные 10 мкл подготовленной линкерным кассеты в 0,2 ПЦР пробирок.

2. Предусиление векторных Геном переходов

  1. Для каждого образца для анализа подготовить ПЦР 50 мкл.
    1. Определить концентрацию образцов ДНК. Внесите х мкл (1-1000 нг для LAM/100-1, 000 нг для nrLAM) из ДНК в 0,2 мл ПЦР-пробирку. Объем ДНК должна быть равна в каждой пробе и в RANGE от 0,5 до 25 мкл.
    2. Подготовка ПЦР основной смеси, как описано в таблице 2 Mix (50 - х). Мкл мастер-смеси с каждого образца ДНК в 0,2 мл ПЦР пробирок.
  2. Preamplify векторные генома переходов с использованием ПЦР условий, примеры которых приведены в таблице 2. После завершения ПЦР добавить 0,5 мкл Taq-полимеразы в каждую ПЦР-пробирку и запускать программу ПЦР. ПЦР-продукты могут храниться при температуре 4 ° С в течение до 4 дней или долгосрочной перспективе при температуре -20 ° С.

3. Магнитной сепарации продукта ПЦР

  1. Подготовка магнитных шариков
    1. Пипетка 20 мкл (200 мкг), покрытых стрептавидином магнитных шариков в 1,5 мл трубки и подвергать в течение 1 мин на магнитный сепаратор частиц (MPS) при комнатной температуре. Удалите супернатант.
    2. Удаление трубки из МПС и ресуспендируют магнитных шариков в 40 мкл PSB / 0,1% БСА (рН 7,5). Expose для MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант. Повторите этот шаг один раз.
    3. Вымойте бисером Wiй 20 мкл 3 М раствора LiCl (3 M LiCl, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА) подвергать MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют бусины в 50 мкл 6 М раствора LiCl (6 М LiCl, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА).
  2. Смешать все ПЦР со стадии 2.2 с 50 мкл приготовленных магнитных шариков. Инкубировать в горизонтальном шейкере (300 оборотов в минуту) по крайней мере в течение 2 ч при комнатной температуре. Этот шаг позволяет связывания биотинилированного продукта ПЦР в стрептавидина шарики (ДНК-бисера сложные). ДНК шарик комплекс можно инкубировать на шейкере в течение ночи или хранили при 4 ° С в течение 4 суток.
  3. Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин при комнатной температуре, удалить супернатант, и ресуспендируют ДНК-бисера комплекс в 100 мкл H 2 O. Сразу переходите к шагу 4 для LAM или в шаге 5 для nrLAM.

4. LAM-процессуальный

  1. Двухместный нити ДНК (дц) Синтез (только ЛАМ)
    1. Expose ДНК-бисера комплекс с шага 3.3 в MPS в течение 1 мин и раскарта супернатант. Добавить 8,25 мкл H 2 O, 1 мкл 10x гексануклеотида буфер, 0,25 мкл дНТФ (10 мм) и 0,5 мкл (2 U) полимеразы Кленова. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
    2. Добавить 90 мкл H 2 O и подвергать MPS в течение 1 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют комплекс ДНК-бисера в 100 мкл H 2 O.
  2. Ограничение Дайджест
    1. Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант. Добавить 8,5 мкл H 2 O, 1 мкл 10х буфера рестрикционного фермента и 0,5 мкл рестриктазы и инкубировать реакцию в течение 1 часа. Повторите шаг 4.1.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выдержите реакцию при температуре, рекомендованной производителем ферментом рестрикции. Убедитесь, что нет сайт рестрикции присутствует в или ниже по течению от сайта связывания праймера, используемого для предварительного усиления в ДНК интерес. Для выбора подходящих комбинаций ферментов рестрикции / рестриктаз см. 9.
  3. Лигирование DS компоновщика (ЛК)
    1. Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант. Добавьте 5 мкл H 2 O, 1 мкл 10x FASTLINK буфер, 1 мкл АТФ (10 мм), 2 мкл Linker кассету со стадии 1.2, и 1 мкл Быстрый-Link ДНК лигазы (2 ед / мкл). Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Повторите шаг 4.1.2.
  4. Денатурацию синтезированной двухцепочечной ДНК
    1. Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют ДНК-бисера комплекс в 5 мкл 0,1 N NaOH. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре на горизонтальном шейкере.
    2. Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин и собирать предварительно усиленный вектор-генома переход, содержащий супернатант в новую пробирку 1,5 мл. Сразу переходите к шагу 6 или магазине супернатанта при температуре -20 ° С.

5. NrLAM-процессуальный

  1. Лигирование одноцепочечной линкера (SSLC) (nrLAM только)
    1. Expose ДНК-бисера комплекс с шага 3.3 в MPSв течение 1 мин и отбросить супернатант. Добавить 6,5 мкл H 2 O, 1 мкл CircLigase 10x реакционного буфера, 0,5 мкл MnCl 2 (50 ммоль), 0,5 мкл АТФ (1 мм), 1 мкл ssLinker олигонуклеотида и 0,5 мкл CircLigase (100 ед / мкл). Инкубировать при 60 ° С в течение 1 часа.
    2. Добавить 90 мкл H 2 O и подвергать MPS в течение 1 мин. Удалите супернатант и мыть ДНК-бисера комплекс в 100 мкл H 2 O. Опять подвергать MPS в течение 1 мин, отбросить супернатант и ресуспендируют ДНК-Bead комплекса в 10 мкл H 2 O.

6. Экспоненциальная Усиление Я

  1. Для каждого образца для анализа подготовить ПЦР 50 мкл.
    1. Внесите 2 шаблона мкл ДНК (со стадии 4.4.2 (LAM) или 5.1.2 (nrLAM)) в 0,2 мл ПЦР-пробирку.
    2. Подготовка ПЦР основной смеси, как описано в таблице 3. Добавить 48 мкл мастер-микс для каждого образца, начиная с шага 6.1.1 и усиливать вектор генома переходы с помощью ПЦР-кондинс качестве примеров в таблице 3. ПЦР-продукты могут храниться при температуре 4 ° С в течение до 4 дней или долгосрочной перспективе при температуре -20 ° С.

7. Магнитной сепарации продукта ПЦР

  1. Подготовка магнитных шариков на примере с шагом 3.1.1 - 3.1.3. Ресуспендируют бусины в 20 мкл (для LAM) или 50 мкл (для nrLAM) от 6 М раствора LiCl (6 М LiCl, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА). Смешать 20 мкл (LAM) или 50 мкл (nrLAM) реакции ПЦР со стадии 6.1.2 с подготовленных магнитных шариков (этап 7.1) и инкубировали на горизонтальном шейкере (300 оборотов в минуту) в течение 2 часов при комнатной температуре. ДНК шарик комплекс можно инкубировать на шейкере в течение ночи или хранили при 4 ° С в течение 4 суток.
  2. Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин, удалить супернатант и ресуспендируют ДНК-бисера комплекс в 100 мкл H 2 O. Expose ДНК-бисера комплекс для MPS в течение 1 мин и отбросить супернатант.
  3. Ресуспендируют ДНК-бисера комплекс в 20 мкл (LAM) или 5 мкл (nrLAM) 0.1 N NaOH. INCUБАТЭ течение 10 мин при комнатной температуре на горизонтальном шейкере, подвергать его воздействию MPS в течение 1 мин и собирают амплифицированной ДНК, содержащий супернатант в новую пробирку 1,5 мл. Сразу переходите к шагу 8.1 или магазина супернатанта при температуре -20 ° С.

8. Экспоненциальная Усиление II

  1. Для каждого образца для анализа подготовить ПЦР 50 мкл.
    1. Внесите 2 шаблона мкл ДНК (с шага 7.3) в 0,2 мл ПЦР-пробирку.
    2. Подготовка ПЦР основной смеси, как описано в таблице 4. Добавить 48 мкл мастер-микс для каждого образца, начиная с шага 8.1.1 и усиливать вектор генома переходы по ПЦР условиях, примеры которых приведены в таблице 4. Продукты ПЦР можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 4 дней или долгосрочная при -20 ° С
  2. Для визуализации (NR) продукты LAM-ПЦР, нагрузка 10 мкл ПЦР-продукта из стадии 8.1.2 на 2% агарозном геле. Если видны полосы, анализа 10 мкл продукта ПЦР LAM-на высокого разрешения геле. ВНИМАНИЕ: Ethidium бромид является мутагенным. Работа очень тщательно и всегда носить защитные перчатки.

9. Подготовка к высокой пропускной последовательности

  1. Очистка (NR) продуктов LAM-ПЦР
    1. Смешайте 40 мкл ПЦР-продукта со стадии 8.1.2 с 44 мкл комнатной температуре AMPure XP магнитных шариков. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре и не подвергайте воздействию MPS в течение еще 2 мин.
    2. Удалите супернатант и мыть два раза 200 мкл 70% этанола на MPS.
    3. Удалите супернатант и ресуспендируют комплекс ДНК-бисера в 30 мкл H 2 O. Выдержите 1 мин и передачи супернатант в новую пробирку 0,2 мл. Определить концентрацию очищенного ДНК.
  2. Fusionprimer ПЦР добавить секвенирования конкретных адаптеров.
    1. Для каждого образца для анализа подготовить ПЦР 50 мкл.
    2. Пипетка х мкл (40 нг) ДНК в 0,2 мл ПЦР-пробирку. Объем ДНК должна быть равна в каждой пробе, а в диапазоне от 0,5 до 25 мкл.
    3. Подготовка ПЦР основной смеси, как описано в таблице 5 (50 - х). Мкл мастер-микс на каждого образца со стадии 9.2.2 и ввести секвенирования адаптеры для (NR) продуктов LAM-ПЦР с помощью ПЦР условиях, примеры которых приведены в таблице 5 продуктов ПЦР. можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 4 дней или долгосрочной перспективе при температуре -20 ° С.
    4. Для визуализации Fusionprimer-ПЦР-продукты нагрузка 10 мкл ПЦР-продукта с этапа 9.2.3 на 2% агарозном геле. Очищают оставшийся продукт ПЦР, как описано в шагах 9.1.1 - 9.1.3. Анализ 1 мкл очищенного продукта ПЦР с шага 9,4 на автоматизированной электрофореза устройства с высоким разрешением, чтобы точно определить количество концентрации и фрагмент размер продуктов Fusionprimer-PCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LAM-PCR приводит к амплификации генома векторных переходов с определенного размера фрагмента для каждого перехода. Размер отдельных ПЦР-фрагментов зависит от расстояния между местом известного ДНК в геноме и ближайшим сайта рестрикции фермента распознавания. Это позволяет визуализировать разнообразие амплифицированных переходов в анализируемых пробах помощью гель-электрофореза, например., Если только один (моноклональные), несколько (олигоклональные) или несколько (поликлональные) присутствуют полосы на геле. Р...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Техника LAM-ПЦР позволяет выявить неизвестные последовательности ДНК, которые фланкируют известный участок ДНК. Из-за высокой чувствительности в результате предварительного усиления из переходов с использованием специфических праймеров гибридизации в известной последовательности ДНК, можно усилить и обнаруживать даже редкие переходы вплоть до уровне одной клетки. Напротив, в поликлональной ситуации LAM-PCR способен усиливать тысячи различных узлов в одной реакции.

Однако в связи с использова...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование предоставлено Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, грант Онкологического центра Гейдельберга/Мангейма), Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), VIth + VIIth Рамочные программы Европейской комиссии (CONSERT, CLINIGENE и PERSIST). Благодарим Инну Кучера за демонстрацию протокольной техники в видео.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Taq DNA PolymeraseGenaxxon Bioscience GmbHM3001.5000Альтернативные Taq-полимеразы могут быть использованы
ПЦР-буферQiagen201203Использование этого буфера рекомендуется
dNTP-MixtureGenaxxon Bioscience GmbHM3015.4020или любых других dNTP
Олигонуклеотиды (Праймеры)MWG BiotechHPLC очищенные
Dynabeads М-280 «Стрептавидин»Invitrogen11206D
PBSGibco14190-0860,1% масс./об. BSA
6 M LiClRoth3739.110 мМ Tris-HCl (pH 7,5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7,5USB Corporation 22637или любой другой поставщик
EDTAApplichemA1103,0250или любой другой поставщик
Klenow PolymeraseRoche Diagnostics10104523001
смесь гексануклеотидовRoche Diagnostics11277081001
эндонуклеазой рестрикцииNEBили любой другой поставщик
Fast-Link DNA ligation kitEpicentre BiotechnologiesLK11025
CircLigase, ssDNA Ligase KitEpicentre BiotechnologiesCL4111K
NaOH, Sigma-Aldrich72068или любого другого поставщика
Agarose LERoche Diagnostics11685660001или любого другого поставщика
TBE bufferAmresco0658или любого другого поставщика
бромида этидияApplichemA2273,0005Ethidium bromide является мутагенным
100.н. DNA LadderInvitrogen15628-050или любым другим поставщиком DNA ladder
20 mM NaClSigma-Aldrich71393-1Lили любым другим поставщиком
Magna-Sep Magnetic Particle Separator Life TechnologiesK158501для использования с пробирками объемом 1,5 мл
Magna-Sep Magnetic Particle SeparatorLife TechnologiesK158696для использования с 96-луночными планшетами
Amicon Ultra-0,5, мембраной Ultracel-30MilliporeUFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi SPeqLab40-1515или другими системами электрофореза;
TProfessional 96Biometra050-551или другой Термоамплификатор для 96-луночных планшетов
Орбитальный шейкер KS 260 базовыйIKA2980200или другой горизонтальный шейкер
ПЦР софтпробирки 0,2 млBiozym Scientific GmbH711082или другие 0,2 мл ПЦР пробирки
1,5 млEppendorf12682или другие 1,5 мл пробирки
Система документирования геляPeqLabили любая другая система документирования геля
Nanodrop ND-1000 спектрофотометрThermo ScientificND-1000
Spreadex EL1200 сборный гельElchrom Scientific3497
Погружной гель электрофорез SEA 2000 Elchrom Scientific2001E
2100 Биоанализатор для электрофорезаAgilent TechnologiesG2939AA
, , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
  2. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
  3. Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  4. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
  5. Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
  6. Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
  7. Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
  8. Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
  9. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
  10. Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
  11. Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
  12. Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
  13. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
  14. Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
  15. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
  16. Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
  17. Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
  18. Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
  19. Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
  20. Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
  21. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
  22. Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
  23. Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
  24. Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
  25. Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
  26. Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
  27. Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
  28. Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
  29. Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
  30. Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Linear Amplification Mediated PCRVector Genome JunctionsBiotinylated PrimersMagnetic BeadsSolid Phase AmplificationExponential AmplificationRestriction EnzymeLigation ReactionGel ElectrophoresisDeep Sequencing

Related Articles