Методическая статья

Step Beyond BRET: флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (ТОПЛИВО)

12.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51549

⸱

23 мая 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur

В этой статье

Краткое содержание

Расширение основу и применимость флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (топлива) по межеванию соответствующие принципы и демонстрирует свою совместимость с множеством флуорофорами и условий антител целевых.

Аннотация

Флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (топлива) является радиационного процесс возбуждения излучения, которая производит повышенную сигнал и повышение контрастности в пробирке и в естественных условиях. ТОПЛИВО разделяет многие из тех же основных принципах, что Биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET), еще сильно отличается в приемлемых рабочих расстояний между источником люминесцентного и флуоресцентного лица. В то время как BRET эффективно ограничивается максимум 2 раза радиуса Ферстер, обычно менее 14 нм, ТОПЛИВО может произойти на расстояниях до мкм или даже см при отсутствии оптического поглотителя. Здесь мы расширяем на фундаменте и применимости ТОПЛИВА, просмотрев соответствующие принципы, лежащие в основе явления и продемонстрировать свою совместимость с широким спектром флуорофорами и флуоресцентных наночастиц. Кроме того, утилита антител, ориентированных на топливо изучены. В примерах, приведенных здесь свидетельствуют, что топливо может быть использован для заявлications где BRET не возможно, наполняя пространственную пустоту, которая существует между BRET и традиционной целого изображения животных.

Введение

Генетическая модификация организмов, таких как вирусы 1, 2, бактерий 3 или мелких млекопитающих 4 либо вызвать или конструктивно экспресс биолюминесценции, была весьма успешной и широко продемонстрировали 5-7. Биолюминесценция, хемилюминесцентный реакции в естественных условиях с участием реагентов в природе, имеет то преимущество, производя свет без необходимости внешнего источника света. Таким образом, биолюминесцентное изображений не страдает от общих недостатков авто-и неспецифической сигнала найденных из флуоресцентного изображения 8. Следовательно, биолюминесценции имеет значительное отношение сигнал-шум, так как любое обнаруженное сигнал исходит исключительно от предполагаемого источника. В то время как многие модели эксплуатировали лк оперона от Photorhabdus luminescens (максимум выбросов по центру между 480 и 490 нм) для в пробирке и в естественных приложений 9, его использование в небольшом Mammлов был проблематичным из-за самой природы условиях визуализации; пронизывает существование оптических абсорбентов, таких как гемоглобин, рассеяния агентов, таких как ткани и кости, сильно влияют синего цвета на желтый длин волн 3. Выражение сконструированного люциферазы светляков (максимум излучения на 617nm) недавно был разработан и включен, обеспечивая инструмент, который значительно преодолевает оптического поглощения 10, но все еще ​​является предметом эффекты рассеяния.

В ответ, их было несколько попыток красное смещение излучаемого сигнала в нужную оптического окна 650-900 нм, область свернутом поглощения и рассеяния, используя биолюминесценции резонансный перенос энергии (Bret) 11-13. В качестве инструмента для улучшения обнаружения сигнала, Брет, которая использует биолюминесцентного источник в качестве донора и дополнительного флуорофором как акцептора, нашел ограниченный успех. Как семенной пример этого явления, "самоизлучающие квантовые точки4; (SIQDs) 14 состоят из модифицированного Renilla reniformis люциферазы, связанных с внешним слоем полимера-лизин коммерчески доступного квантовые точки (КТ). После подложки Кроме того, в результате реакции биолюминесцентного вызывает флуоресцентное излучение от КТ, генерируя значительную выработку красных фотонов. Однако эти SIQDs ограничили применимость в естественных условиях визуализации физиологически соответствующих мероприятий. Эта ограниченная применимость, вероятно, из-за трудности увязывания двойной зонд к органа, клетки или интересующего гена, так как SIQDs не может быть генетически закодированы, а потому потребует вторичного модификацию полимерной оболочки. Для улучшения их применимости, альтернативные SIQDs, где люцифераз которые связаны непосредственно с ядром люминесцентного, недавно были заняты 15. Строительство от концепции SIQD, более применимо система BRET было достигнуто путем присоединения Cypridina люциферазу к инdocyanine краситель 16, который был способен специально нацеленные опухолей у мышей при производстве существенную красное смещение от 460 нм до 675 нм. Чтобы пройти безызлучательной передачи энергии, BRET следует тем же первичных связей, как его флуоресцентного коллегой: там должна быть сильная спектральная перекрытие между испусканием доноров и спектров возбуждения акцептора и рабочего расстояния между двумя фрагментами должна быть порядка радиус Ферстер (5-14 нм в зависимости от пары донор-акцепторного, с эффективным расстоянии не более удвоенным радиусом Ферстер 17). Это расстояние зависимость существенно ограничивает типы событий, которые можно наблюдать с помощью Брет в качестве средства для улучшения обнаружения.

Недавно новый подход был идентифицирован и продемонстрировал в как в пробирке и в условиях естественных условиях. Строительство от фундамента Брет, флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (топливо) 18, 19 также требует сильного спектрального перекрытия между люминесцентных и флуоресцентных компонентов. Однако, в отличие BRET, топливо полностью радиационного процесс, при котором излучается фотон от источника люминесцентного поглощается оптически доступным флуорофора, который впоследствии испускает красное смещение фотона в соответствии с квантовым выходом флуорофора. Родственный BRET, этот подход также может быть использован для преодоления ограничений изображений в присутствии оптических абсорбентов. Полученный красный сдвиг обеспечивает общее увеличение и специфичность обнаруженного сигнала из-за уменьшения затухания и сокращению воздействия оптических рассеяния. ТОПЛИВО, как сообщается, происходят между биолюминесцентных кишечной палочки, выражающих лк оперона и КТ 18, 19. В то время как экспериментально похожи на SIQDs, существует фундаментальное различие: в топливном, это не является необходимым для источника люминесцентного быть физически связанный с флуорофора, что позволяет FOг генетическую кодировку люминесцентного зонда. Благодаря успешному обнаружению ТОПЛИВА между светящихся бактерий и КТ, не исключено, что этот метод может быть применен как к поверхностным (кожи) и внутренних органах (легких, печени) инфекций, таких как золотистый стафилококк и Klebsiellia пневмонии.

Поскольку доклад его экспериментального значения, ТОПЛИВО стали включать надежную математическую модель 20, которая может использоваться для прогнозирования приемлемый люминесцентные и флуоресцентные пары, и ее приложения были распространены на использование в идентификации фотофизических характеристик, таких как квантовый выход. Ниже мы описываем некоторые из основных методов топлива. Во-первых, мы показываем доказательства этого явления более короткий и (мкм) и длинной (см) рабочие расстояния, которые принципиально отличает топливо из BRET. Во-вторых, мы расширяем на возможных пар ТОПЛИВА, исследуя разнообразные флуорофорами и флуоресцентных наночастиц. Thirд, ТОПЛИВО приложения исследованы путем сопоставления целевых и нецелевых пары топлива.

Протокол

1. Реагенты

  1. Покупка или разработать люминесцентные бактерии и соответствующие питательных сред, таких как модифицированный кишечной палочки, выражающей лк ABCDE 21, Vibrio ПзсЬеп, Photobacterium зр. Klebsiella пневмонии 22.
  2. Подготовка физиологический раствор (0,9% NaCl) и питательных сред решения в соответствии со стандартными рецептов. E. палочка и К. пневмонии были выращены в Luria Bertani (LB) при 37 ° С и V. ПзсЬеп и Photobacterium зр в LB с добавлением 0,5 М NaCl при 22 ° С.
  3. Покупка или приобрести флуоресцентных зондов, таких как Q-слежения 705 (диаметр 40 нм, называют QD705), Q-слежения 800 (диаметр 40 нм, называют QD800), флуоресцентный (диаметр 40 нм) и не-люминесцентные полистирольные микросферы ( 48 нм в диаметре), и обычные красители флуоресцентные.
  4. Подготовьте необходимые реагенты для бактериальной маркировки.
  5. Обеспечить доступ квсе животное биолюминесценции формирования изображения, такое как IVIS Spectrum, который способен обнаруживать сигнал в широком диапазоне длин волн излучения и времени экспозиции. Ридер способен измерений биолюминесценции хватит для большинства экспериментов, описанных здесь.

2. Основные Рекапитуляция топлива

  1. Начиная с отдельных колоний на стандартных планшетах для культивирования, начать Ночные культуры светящихся бактерий. Здесь В. были использованы ПзсЬеп.
  2. В день эксперимента, инициировать новые субкультуры и дать им возможность развиваться, пока OD 600 из 1-1,5 не будет достигнута. Для того чтобы получить сопоставимые результаты лучше использовать бактерии в подобных состояний роста, в которых они производят интенсивные сигналы. Это могут быть уверены, сохраняя OD 600 константу.
  3. Комбинат аликвоты 100 мкл из каждой или с 5 мкл QD705 или физиологического раствора (PS), а затем добавить в 895 мкл PS в Standaй спектроскопические кюветы. Поместите заполненные кювет в IVIS Spectrum и принять измерения в рамках соответствующих наборов фильтров. Здесь был использован фильтр излучение 710-730 нм.

3. ТОПЛИВО За различных расстояниях

  1. Заполните два уменьшенный объем (1 мл) пластиковые фотометрические кюветы с либо 50 мкл QD705 или 97,2 мкл нефлуоресцентных 48 нм полистирола микросфер в общем объеме 1 мл ПС. Это гарантирует аналогичную площадь с твердой поверхностью за общего объема между двумя структурами.
  2. Подготовка источника света кювету по тэгов третью кювету со стандартной черной лентой или какого-либо другого непрозрачного материала, способного блокировать свет. Тщательно подготовить две идентичные оптические окна на противоположных сторонах кюветы.
  3. Поместите предварительно заполненные кюветы непосредственно на обе стороны от источника света кюветы. Добавить 1 мл аликвоты V. ПзсЬеп или другой культуры (то есть люминесцентные кишечная палочка или Photobacterium ср) из свежего субкультуры в кювете источника света и покрыть ее непрозрачного материала, например, черную бумагу, чтобы уменьшить любое света загрязнения.
  4. Визуализация три кюветы при соответствующих фильтров выбросов, таких как общий свет и 710-730 нм фильтров выбросов, с временем экспозиции от 10, 30 и 30 с соответственно.
  5. Измените как внешние, так кювет в эквивалентных дальнейших расстояниях от центральной кювете, а затем визуализировать снова. Повторяйте, пока окончательное лицом к лицу (центральной к снижению объема кюветы) расстояние 3 см не будет достигнута. На каждом шаге приобрести флуоресценции изображение (450-480 нм возбуждения, 710-730 нм излучения) для проверки расположение QD705.

4. Исследование потенциальным топливом пар

  1. Заполните два снижение кювет громкости с 1 мл растворов, содержащих либо флуорофор или флуоресцентный наночастицы интереса к одной и PS или PS с нефлуоресцентных наночастиц в качестве отрицательного контроля в другой. В гоэ работа продемонстрировала здесь, разнообразие потенциальных коммерчески доступных ТОПЛИВА флуорофорами и флуоресцентных наночастиц были исследованы как указано в таблице 1.
  2. Добавить 1 мл аликвоты свежего V. ПзсЬеп или других светящихся бактерий к затемненным третьей кювету, содержащую два физически равные оптические окна, расположенные на противоположных сторонах. Крышка кювету с непрозрачным веществом, например на лист черной бумаги.
  3. В короткой, но равном расстоянии месте два снижение кюветы громкости на обе стороны от затемненной кюветы и визуализировать при соответствующих фильтров. Здесь была использована на расстоянии 0,7 см. Повторите с другой флуорофорами.

5. Целевые ТОПЛИВА

  1. Подготовка биотинилированных антител, специфичных к люминесцирующих бактерий. Например, здесь первичные антитела, специфичные к К. пневмонии (α-Кр) биотинилировали использованием раствора, содержащего EZ-Link сульфо-NHS-LC-биотина.
  2. Удалить избыток реагента от антител с использованием колонки обессоливания под центрифугирования (1500 мкг) в течение 2 мин.
  3. С помощью стандартного Бредфорда для определения концентрации белка и определить степень антител биотинилирования по HABA анализа.
  4. Получение α-KP-Био биотинилированного антитела (AB) порциями при смешивании 100 мкл (10 мМ, растворенного в 1 × PBS) с 40 мкл α-КП антитела, в результате чего в конечном степенью замещения остатков 16 биотина в АВ и окончательное Концентрацию белка 10 мг мл-1.
  5. Использование нескольких ночь повторить культур, нацелены на вымытые бактерии с вышеупомянутыми антител следующие соответствующего протокола.
    1. В частности, мыть К. пневмонии в 1х PBS и ресуспендируют в 1 × PBS до оптической плотности (около 4 4 х 10 8 КОЕ мл -1 OD -1).
    2. Для каждого из одинаковых, инкубировать 100 мкл PBS, α -Kp антитела (10 мкл α-Кр-biotB или 10 мкл PBS для контроля) и 100 мкл клеток в течение 90 мин при 30 ° C. Вымойте клетки три раза в 1x PBS, и ресуспендируют в 196 мкл PBS.
  6. Этикетка клетки с QD705 стрептавидин конъюгату и разделить их на две эквивалентных объемов.
  7. Вымойте одно решение в три раза, а затем ресуспендируйте его в соответствующем объеме.
  8. Распределить 100 мкл промытый и немытых решений на отдельные лунки черного 96-луночного планшета. Измерьте полученный свечение под общий свет, 490-510 нм, и 710-730 нм фильтров. Концентрация флуорофора можно определить, используя 450-480 нм возбуждение и 710-730 нм излучение.

Результаты

Резонансный перенос энергии (РЭТ) не является радиационное взаимодействие между люминесцентной донора и флуоресцентной акцептора, при котором энергия от возбужденного донора способен вызвать реакцию флуоресценции от акцептора через сильное диполь-13. РЭТ, который был описан с помощью флуоресцентного 23, хемилюминесцентную 24 и биолюминесцентных 13 доноров, в основном требуется: 1 Сильные спектральный перекрытие между испусканием доноров и спектров возбуждения приемщик;. 2 Соответствующие вращения выравнивание между двумя структурами.; и 3. рабочее расстояние не более 0,5-до 2-кратного радиус Ферстер, R 0, между донором и акцептором 17. Контрастные с RET, FUEL происходит, когда люминесцентный источник, такой как биолюминесцентного бактерий, испускает фотон, который поглощается и повторно излучаемый второго объекта, такого как флуорофора или флуоресцентным наночастицы, красно-смещение ОФЭКТ выбросовром оригинального источника люминесцентного. Таким образом, FUEL следует стандартный процесс возбуждения-излучения, похожее на стандартных условиях epifluorescent, но без использования сфокусированного возбуждения. Свидетельством этого может быть легко наблюдается по простым смешением светящихся бактерий и высоко-люминесцентных квантовых точек. В присутствии Vibrio SP, значительное увеличение красный сигнал наблюдается при QD705 также в растворе по сравнению с не-флуоресцентного контроля полистирольных микросфер (фиг. 1А). Компоненты, необходимые для создания биолюминесценции, по существу альдегидной подложку, люцифераза и АТФ, все произведены и содержится в цитоплазме. Кроме того, производство ферментативный люминофор происходит в цитоплазме бактериальной (рис. 1В). Как уже сообщалось в другом месте, расстояние между внутренней и наружной мембраны бактерий, как правило, больше, чем 30 нм 25-27, расстояние, которое не допускает значительного RETпроизойти. Кроме того, флуоресцентные наночастицы не пересекают в цитоплазме бактериальной с нет эндоцитоз или другие средства захвата. Вместе, эти ограничения показывают, что топливо является доминирующим явлением возбуждения излучения, которое возникает при люминесцентные бактерии смешиваются с люминесцентными наночастиц.

Как было показано ранее, ТОПЛИВО существует вне диапазона RET. Для исследования зависимости топлива на расстоянии, стандартные уменьшается объем спектрофотометрические кюветы можно использовать, с одной содержащую раствор флуорофора, секунды, содержащего соответствующий элемент управления, который может управлять для разброса, а третий, содержащей аликвоту свежим раствором люминесцентного. Очень важно, что центральный кювета быть охватило использованием черного ленту или другой непрозрачный материал, за исключением, по крайней мере двух идентичных оптических окон, расположенных на противоположных гранях, для уменьшения любого возможного загрязнения свет от источника люминесцентного. Кроме того, два оставшихся кюветы должныбыть размещены эквидистантно на обе стороны от центральной кюветы. Наконец, свежий раствор люминесцентный с использованием бактерии или хемилюминесценции, следует использовать с каждым экспериментом, чтобы обеспечить максимальную продукцию света. По соответствующей размещения, приобрести сигнала люминесценции под желаемых фильтров. Общее света и 710-730 нм фильтры были использованы в данном случае, хотя только данные из последнего показано. После каждого приобретения, постепенно расти расстояние лицом к лицу с 1,0 см до 3 см (рис. 2). Наконец, нормализуют все данные в самой яркой точке. В примерах, используемых здесь, это произошло в самое короткое расстояние (D = 1 см) между источником люминесцентного и кювету с QD705. Используя этот подход, жизнеспособным сигнал ТОПЛИВА можно наблюдать до окончательного приобретения предполагая, что, в отсутствие какого-либо оптического поглотителя, ТОПЛИВО может произойти в расстояниях, превышающих любой возможной передачи энергии резонанса и может быть объяснено только быть чисто радиационногоэффект. Установка данных показывает уменьшение сигнала в зависимости от расстояния D следующего за D -1 в зависимости D -2. В зависимости от геометрической конфигурации, бывшие соответствует расстоянию конденсатор зависимости и последний, чтобы закону обратных квадратов для точечных источников. Этот результат является поэтому согласуется с нашей общей установки приобретения, учитывая размер кюветы отверстия и расстояние между источником люминесцентного и флуорофором.

FUEL относится не только к квантовыми точками, но также можно наблюдать с помощью широкого спектра флуорофоров, начиная от серии Alexa флуоресцентных микросфер (табл. 2). Для того чтобы быть сравнимы с контролем, равные концентрации различных флуорофоров должны быть использованы, а общая площадь поверхности наночастиц неизменными (табл. 1). Сравнивая флуорофоры и наночастиц в соответствующие управления (PS или PS с нефлуоресцентногополистирольных микросфер), значительное увеличение сигнала наблюдается в максимуме излучения каждого флуоресцентного лица. Крупнейший относительное увеличение сигнала был обнаружен, когда люминесцентные максимум излучения был дальше всех от максимума излучения люминесцентных. Это, скорее всего, в связи с увеличением специфики флуоресцентного сигнала по сравнению с широким спектром излучения источника люминесцентного. Напротив, наименее надежный сигнал FUEL был найден, когда два максимума излучения не были хорошо разделены. Интересно, что заметной сигнал ТОПЛИВА был найден с Желтых микросфер хотя спектральная разница минимальна, в связи, скорее всего, существенного количества флуорофором настоящему за шарик (350 флуоресцеина эквивалента). Результаты, приведенные здесь показывают, что при соответствующих условиях топлива может быть достигнуто с различными флуорофоров, что позволяет адаптацию зондов, выбранных для более соответствующими приложениями в рамках как Iн пробирке и в условиях естественных условиях. Значимость наблюдаемого сигнала ТОПЛИВА определяли с помощью Т-теста стандартная двух-Стьюдента. Таким образом, только Alexa555 было установлено, что несовместимо с источником люминесцентного используется.

В целях изучения влияния ориентации на топливо, биотинилированные антитела были использованы для целевой люминесцентные бактерии и стрептавидином связаны КТ. Важно, что бактерии или источник люминесценции обеспечить слой достаточно толстым, чтобы свести к минимуму возможность RET между люминофора и соответствующей флуорофора. После инкубации и промывки для удаления несвязанного антитела, биотин-меченый бактерии затем подвергают воздействию либо стрептавидином, конъюгированным QD705 или не-функционализированного QD705 в качестве контроля, растворы разделены и один набор подвергается дальнейшей промывки, чтобы удалить любой не придерживались QD705. Здесь для всех четырех условий, в результате люминесценции наблюдалась под Total Света, 490-510 нм,д 710-730 нм фильтры, хотя только два последних фильтры, используемые для анализа данных. Наличие QD705 сравнивали с использованием 450-480 нм возбуждение и 710-730 нм фильтры выбросов. По результатам расследования мы обнаружили практически нет разницы в красное смещение сигнала, когда решения были оставлены в немытого состоянии (рис. 3). В результате сигнал флуоресценции при этом условии также установлено, что очень похоже, предполагая, что равное количество QD705 присутствовал при обоих целевых и нецелевых состояние. Однако, моя образцы для удаления несвязанного QD705 обеспечивает увеличение почти в два раза в относительной красный сигнал для целевых бактерий по сравнению с их нецелевого управления. Исследование по флуоресценции можно использовать для проверки наличия или отсутствия в QD705. Для сравнения, ориентированы промывали состояние привело к интенсивности флуоресценции, который был почти в три раза меньше, чем немытые состоянии, пока в результате красного смещения снизился на только30%, предполагая, что при чисто связанных условий нацеливание бактерий приведет к увеличению красное смещение излучения. Это сильно подразумевает полезность целевого топлива для будущих приложений.

figure-results-1
Рисунок 1. Взаимодействие между FUEL люминесцентных бактерий и коммерчески доступных квантовых точек приводит к увеличению производства в красном фотонов. Два спектрофотометрические кюветы были заполнены растворами, содержащими 100 мкл аликвоты свежего V. ПзсЬеп культуры с OD 600 1-1,5, 895 мкл ПС, и либо 5 мкл QD705 или физиологический раствор (PS), перед помещением в IVIS Spectrum и спектра излучения приобретенной. Значительное увеличение красный сигнал достигается за счет наличияQD705, как можно заметить по увеличению зарегистрированных фотонов • с -1 • см -2 (р • с -1 • см -2) по сравнению с контролем в соответствии с фильтром твердых 710-730 нм (А). Здесь двойной мембраны бактерий исключает взаимодействие люминесцентных частями (синие кружки) и QD705 (черные кружки). Бывший встречаются только в бактериальной цитоплазме, тогда как вторые свободно распространяться в объеме раствора (B). N = 3 для каждого бактериального раствора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Доказательства ТОПЛИВА происходит на расстояниях комплetely исключением резонансный перенос энергии. спектрофотометрические кюветы были заполнены растворами, содержащими либо 50 мкл QD705 и 950 мкл физиологического солевого раствора (PS) или 97,2 мкл нефлуоресцирующих 48 нм полистирольных микросфер и 902,8 мкл ПС и помещают эквидистантно на противоположных сторонах из центральной черной кювету, содержащую 1 мл свежей люминесцентные Photobacterium зр на OD 600 из 1-1,5. Центральный кювета было два идентичных оптические окна, позволяющие излучаемые фотоны свободно разойтись. Получение изображения на расстоянии (D) в диапазоне от 1,0 см до 3 см, наблюдаемое производство красного света уменьшилась в зависимости от расстояния отображаются доказательства того, что топливо может происходить на расстояниях не могут быть достигнуты на резонансный перенос энергии. Интенсивность, казалось, была зависимость D -2, похожий на закону обратных квадратов (слева). Следуют той же протокол для Е. палочка (справа). Полученные линии тренда держать форму в концепции тхат бактерии действуют как точечные источники света. В общей сложности три независимых измерения расстояния были приобретены друг с использованием уникального субкультуры. Столбики ошибок присутствуют в каждой точке. В некоторых случаях планки погрешностей были меньше, чем символов, используемых, которые указывают на нормированную интенсивность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Сравнение между мишенью (специфические) и нецелевой (объем раствора) ТОПЛИВА. К. пневмонии были функционализированных биотинилированных антител и затем подвергают воздействию либо стрептавидин-меченного (целевых) или не помечены (нецелевых) QD705. Полученные растворы были одинаково дивиДед и один набор промывали три раза ЗФР, прежде чем снова суспендируют в ее первоначального объема в PBS. Растворы затем разливали в отдельные лунки черного 96-луночного планшета и биолюминесценции наблюдается при 490-510 нм (500 нм) и 710-730 нм (720 нм) фильтров выбросов (указанных как синие барах). Р • с -1 • см -2 найти из 720 нм фильтра для каждой лунки нормализуется соответствующего р • с -1 • см -2 интенсивности биолюминесценции от 500 нм того же колодца. Интенсивность относительной флуоресценции в результате возбуждения epifluorescent определяли с помощью 450-480 нм возбуждение и 710-730 нм фильтры выбросов (обозначается как красные баров). Слабый или отсутствует разница в биолюминесцентной или флуоресцентного сигнала наблюдалось под немытыми условиях (нецелевой немытая и целевых немытая). Это говорит о том, что оценка и свободно плавающего QD705 были одинаково рады по биолюминесцентных фотонов. По стиральной, прано разница в два раза в относительном красный сигнал наблюдался для QD705-меченых бактерий (целевых промывали) по сравнению с контролем (нецелевой мытый). Отсутствие QD705 в нецелевой Омывается было подтверждено отсутствие флуоресцентного сигнала и проверки QD705 маркировку в адресной промывали государства. Данные из четырех независимых культур К. пневмонии. Для ясности, легенда указывает источник возбуждения QD705. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Флуорофора Концентрация мкл PS (мкл) λ макс экс / ет (нм) Эмиссия фильтр (п м)
Alexa 555 37,2 мкМ 4.77 995,23 555/565 570 - 590
Alexa 568 37,2 мкМ 4.77 995,23 578/603 590 - 610
Alexa 633 37,2 мкМ 4.77 995,23 632/637 650 - 670
37,2 мкМ 4.77 995,23 702/723 710 - 730
Нефлуоресцентный 2.62% твердых веществ 9.72 990,28
μSph Розовый 5% твердых веществ 4.77 995,23 580/605 610 - 630
μSph Желтый 5% твердых веществ 4.77 995,23 505/515 510 - 530
QD705 2 мкм 5 995 465/705 710 - 730
2 мкм 5 995 465/705 790 - 810
ширина: 108px; "> Alexa 700 высота: 22px; ширина: 108px; "> QD800

Таблица 1. Свойства флуорофорами, используемых в топливных демонстраций.

Контроль фильтр флуорофором Контроль Значение р
р · с -1 · см -2 Южная Дакота р · с -1 · см -2 Южная Дакота
A555 PS 580 1.08 х 10 7 3,31 х 10 6 9,09 х 10 6 1,75 х 10 6 0.233
A568 PS 600 8.47 × 10 6 4,23 х 10 6 4,49 х 10 6 9.71 × 10 5 0.094
A633 PS 660 2,40 х 10 6 1.25 × 10 6 7,85 × 10 5 2,39 х 10 5 0.046
A700 PS 720 5.53 × 10 5 2,46 х 10 5 1,54 × 10 5 6,05 х 10 4 0.026
MSPH Желтый не-люминесцентные μspheres 520 1.19 х 10 8 4,85 х 10 7 5,79 х 10 7 1.99 х 10 7 0.057
MSPH Розовый не-люминесцентные μspheres 620 2.37 х 10 7 1,36 х 10 7 2,16 х 10 6 8.00 × 10 5 0.026
QD705 не-люминесцентные μspheres 720 1.76 х 10 7 7.33 × 10 6 2,08 х 10 5 7.16 × 10 4 0.007
QD800 не-люминесцентные μspheres 800 7.79 × 10 6 4,72 х 10 6 3,60 х 10 4 1.52 × 10 4 0.023

Таблица 2. Идентификация флуорофорами и флуоресцентных наночастиц, совместимых с ТОПЛИВА.

Обсуждение

Фундаментальная демонстрация топлива может быть достигнуто лишь путем смешивания светящихся бактерий с люминесцентными наночастиц или КТ. Эти две организации будут физически отделены и остаются вне всякого эффективного расстояния RET. Более сложным является оптимизация сигнал ТОПЛИВА как в пробирке и в естественных условиях. В условиях ин витро, так и без оптической абсорбционной настоящее время обычно добавление избыточного флуорофора будет достаточно, чтобы максимизировать ответ топлива. Тем не менее, при высоких концентрациях явлений, например статическим или столкновительного тушения может привести к потере флуоресцентного сигнала. Выполнение серии разведений путем независимого изменения концентрации источника люминесцентного и флуорофора будет способствовать оптимизации желаемых концентраций. Создание и оптимизация ТОПЛИВА под концентраций естественных условиях гораздо сложнее и требует решения на индивидуальной основе к случаю. Это может быть трудно создать совместноеndition где флуоресцентный лицо может получить доступ оптически источником люминесцентного. Таким образом, начиная с прямого сотрудничества инъекций двух фрагментов может предоставить информацию относительно успеха ТОПЛИВА при оптимальных условиях.

Существуют стандартные методики для маркировки бактерий и эукариотических клеток с флуоресцентными лиц, таких как серии Alexa и КТ. Часто это требует поверхности функционализации или активации с антителами, что может привести к нежелательным эффектам, как снижение жизнеспособности клеток или измененного метаболической активности. Чтобы преодолеть это, важно определить оптимальное количество антител или агента активации необходимо, что сводит к минимуму сотовой возмущения, максимизируя флуоресцентных меток. Использование КТ выгодно из-за их характерно широком спектре возбуждения, узким и перестраиваемого эмиссионных спектров, а также возможность большого сдвига Стокса. Тем не менее, КТ может быть цитотоксическое и не может быть желательным в некоторых случаях.

ТОПЛИВА это явление, которое присутствует во многих экспериментах BRET 13 и применим к различным люминесцентных и флуоресцентных источников. До сих пор, фотоны в результате использования топлива считались продуктом неспецифических взаимодействий или несчастного фонового сигнала в результате плохо спланированных экспериментов BRET. Это только с виду эксперименты показали здесь, что мы были в состоянии идентифицировать полезность этого нежелательного сигнала. В показанных примерах, люминесцентные бактерии действуют как диффузный источник возбуждения способны вызывать стандартный флуоресцентный отклик от самых разнообразных флуоресцентных лиц. Кроме того, в связи с существенным рабочим расстоянием, можно с уверенностью сделать вывод, что в то время как топливо может быть построена без возникновения BRET, в общем BRET не могут наблюдаться без вклада ТОПЛИВА. Важно отметить, что из-за отсутствия ориентации требованию, топливо может использоваться для покрытия пространственное разрыв, который существует между BRET и сonventional методы визуализации целого животных.

Раскрытие информации

Авторы заявляют конкурирующих финансовых интересов. Доктор юридических наук, СО, KLR и SLS способствовали Европейского патентного EP10290158.4 и Всемирная организация интеллектуальной собственности заявки на патент WO/2011/117847.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить свою благодарность за финансовую поддержку от Пастера фонда Нью-Йорка (в JD, CS, CS), ЕС-FP7 Программа «Автоматизация" (для SLS), Программы Института Карно 11 (в JD, АГ , АР, РТ, SLS) и проекта IMNOS (до комнатной температуры, SLS), Конни-Мейв благотворительный фонд (SLS), европейские мастера в молекулярной визуализации (ИТ), программы Регион Иль-де-Франс MODEXA (SLS), СЕЗАМ (SLS) и DimMalInf (SLS, RT), ANR Программа Grandes Investissement де L'Avenir инфраструктуры Nationales ан Biologie-Santé: Франция LifebioImaging (FLI) Франция Жизнь томография (КТ, SLS), Франция Bioimaging (JD, SLS) и Институт Пастера, Париж. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить, Хосе Bengoechea и Герберт Швейцер для реагентов. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Синди Fevre которые сгенерированный антитела.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Escherichia coli выражая luxABCDE operon любезно предоставлено José A. Bengoechea с разрешения Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145 52145 является референсным штаммом серотипа K2
Luria Bertani (LB) стандартные питательные среды
Q-Tracker 705 Медико-биологические наукиQ21061MP
Q-Tracker 800Медико-биологическиеQ21071MP
Alexa 555Медико-биологические наукиS21381
Alexa 568Медико-биологические наукиS11226
Alexa 633Медико-биологические наукиS21375
Alexa 700Медико-биологические наукиS21383
Нефлуоресцентные микросферыPolysciences, Inc15913
Розовые микросферыМедико-биологические наукиF8887Диаметр 40 нм
Желтые микросферыМедико-биологические наукиF8888Диаметр 40 нм
Ivis SpectrumPerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific Pierce21425
Zeba Спиновые обессоливающие колонны 7K MWCOThermo Scientific Pierce21425
HABA  Thermo Scientific Pierce28005
Брадфордский анализBio-Rad500-0201
Набор для анализа

Ссылки

  1. Hu, K., et al. A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer. J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).
  2. Contag, C. H., et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
  3. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  4. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).
  5. Condeelis, J., Weissleder, R. In Vivo Imaging in Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).
  7. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. 10, (2010).
  8. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).
  9. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. Luminescent probes and visualization of bioluminescence. Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).
  10. Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light. Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).
  11. Saito, K., et al. Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging. Nat Commun. 3, 1262(2012).
  12. Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).
  13. Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. The BRET technology and its application to screening assays. Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).
  14. So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).
  15. Wu, Q., Chu, M. Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes. Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).
  16. Wu, C., et al. In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).
  17. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
  18. Dragavon, J., et al. in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. , 790210-790219 (2011).
  19. Dragavon, J., et al. In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).
  20. Holland, A. D., et al. In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer. Methods. , (2013).
  21. Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).
  22. Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect Immun. 31, 71-77 (1981).
  23. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247, 119-136 (2012).
  24. Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).
  25. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).
  26. Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles. Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).
  27. Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods. Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).

Перепечатки и разрешения

Теги

FUEL
Step Beyond BRET: флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (ТОПЛИВО)
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.