Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Aip1p Динамика изменяются по R256H мутация в актина

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51551

⸱

30 июля 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Department of Biochemistry, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, University of Iowa

В этой статье

Краткое содержание

Болезнетворных мутаций в актина может изменить цитоскелета функцию. Цитоскелета динамика количественно через визуализации флуоресцентно меченых белков с использованием полного внутреннего флуоресцентной микроскопии. Например, белок цитоскелета, Aip1p, изменила локализацию и движение в клетках, экспрессирующих мутантный актина изоформы, R256H.

Аннотация

Мутации в актина вызвать целый ряд заболеваний человека из-за специфических молекулярных изменений, которые часто изменяют цитоскелета функцию. В этом исследовании, визуализация флюоресцентно отмеченных белков с использованием полного внутреннего флуоресценции (TIRF) микроскопия используется для визуализации и количественной оценки изменений в динамике цитоскелета. TIRF микроскопии и использование флуоресцентных меток также позволяет для количественной оценки изменений в динамике цитоскелета, вызванных мутациями в актина. Используя эту технику, количественная оценка цитоскелета функции в живых клетках полноценно дополняет в пробирке исследования функции белка. В качестве примера, миссенс мутации, влияющие на актин остаток R256 были выявлены в трех человеческих актина изоформ предлагая эта аминокислота играет важную роль в регуляторных взаимодействий. Последствия актина мутаций R256H на цитоскелета движений изучались с использованием модели дрожжей. Белок, Aip1, который, как известно, чтобы помочь в кофилин актина деполимеризации, былотмеченных зеленым флуоресцентным белком (GFP) в N-конца и отслеживаются в естественных условиях с использованием TIRF микроскопии. Скорость движения Aip1p и в дикого типа и мутантных штаммов количественно. В клетках, экспрессирующих мутантный R256H актин, Aip1p движение ограничено и скорость движения составляет почти половину скорости измеряется в клетках дикого типа (0,88 ± 0,30 мкм / сек в R256H клеток по сравнению с 1,60 ± 0,42 мкм / сек в клеток дикого типа, стр. <0,005).

Введение

Актина является доминирующим белок, содержащий цитоскелета и участвует в важных клеточных процессов, включая деление клеток, движение органелл, подвижности клеток, сокращение, и сигнализации. За последние десять лет, болезнетворные мутации в актина были обнаружены в каждом из шести человеческих актина изоформ ведущих к целому ряду нарушений, от миопатиях ишемической болезни сердца 1-7. Процессы, с помощью которого актина мутации приводят к развитию заболеваний по-прежнему выяснены. Дрожжи модель остается золотым стандартом для изучения биохимических эффектов мутаций на функцию актина за счет преимуществ одной существенной актина изоформы, генной сговорчивости и высокой сохранения последовательности актина и функции. Исследования показывают, что отдельные мутации актина привести к молекулярным конкретных нарушений с доминирующими негативными последствиями 8. Например, глухота, вызывающих мутации в γ-не-мышечной актина, которые влияют на остаток Lys-118 изменить регулирование посвязывание актина белок Arp2 / 3 9. Исследования часто используют в лабораторных анализов белка: белковых взаимодействий. Исследования эффекта актина мутации в клеточной биологии и, в частности, актин связывающий белок локализации в клетке ограничены.

Исследования дрожжей цитоскелета в естественных условиях обычно полагаются на изображениях фиксированных клеток из перевернутой флуоресцентного микроскопа 10. Эти эксперименты поставляется основополагающие данные о морфологии цитоскелета. Исследования с включены трехмерную визуализацию конфокальной визуализировать сложную цитоскелета сеть 11, 12. Это томография позволяет количественно определить изобилия и относительного расположения актина и нитей. Тонкие разделе электронной томографии был использован для изображения морфология плотных нитевидных сетей относительно сохранившихся субклеточных структур 13. Переполненные сотовые сшагов с малым сечением могут быть рассмотрены в мелких деталях с этой техникой. Исследования по визуализации были распространены на живых клетках, используя промежуток времени флуоресцентной микроскопии. Когда фото отбеливание и фоновой флуоресценции можно модерируются, изображения промежуток времени позволяет исследования как с динамикой белков цитоскелета и ответ на условия окружающей среды 11, 14. Отдельно визуализация динамики актина в пробирке была выдвинута путем введения полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия. По сравнению с широким микроскопии, TIRF имеет преимущество уменьшилось фоновой флуоресценции и повышенную контрастность для мониторинга отдельных нитей 15, 16. С этими качествами TIRF микроскопии была адаптирована клеточных биологов контролировать клеточные структуры в мембране плазмы 17, 18. Сотовые события, включая изменения в цитоскелета, можетбыть визуализированы в реальном времени с низким фототоксичности, максимальной контрастности и минимальной фоне расцвета 19.

Чтобы лучше понять влияние актина мутаций на передвижение, локализации и оборота белков цитоскелета в клетке, TIRF микроскопии и белка пометки были использованы. При этом методы для изучения влияния клинически значимых мутаций в актина на цитоскелета динамики в Saccharomyces Cerevisiae описаны. Частности, локализация и движение актина связывающего белка, Aip1p, визуализировали и количественно в клетках, экспрессирующих мутацию R256H в актина. Эти методы дополняют в пробирке биохимических исследований и позволяют большему пониманию белковых взаимодействий и функций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Клонирование в PB1996 плазмиды

  1. Дизайн и заказать праймеры ДНК из олигонуклеотидным производства компании, которая фланг последовательность-мишень и содержат уникальные сайты рестрикции в выбранной родительской плазмиды. Примечание: В этом случае праймеры конструировали для амплификации 400 пар оснований на 5'-конце последовательности Aip1. Сайт ограничение XhoI была включена в состав грунтовки около 20 б.п. до окончания процедуры Aip1 и XmaI был включен около 20 б.п. после целевой Aip1 последовательности. Плазмида, которую используют для клонирования был PB1996, который содержит тег 3XGFP для флуоресценции, ген URA для выбора штамма дрожжей, и ген устойчивости к ампициллину для бактериальной селекции.
  2. Очищают геномной ДНК из Ура-дрожжевого гаплоидного штамма. Примечание: См. Рисунок 1 на диаграмме процесса клонирования.
  3. Запуск стандартной реакции ПЦР с использованием двух праймеров и дрожжевой геномной ДНК для амплификации гена Aip1p с рестрикционными сайтами по обеим ваннойг. Дайджест ПЦР-продукта и PB1996 плазмида с помощью рестрикционных ферментов в отдельных реакций в рекомендованы производителем протоколов. В этом случае XmaI и XhoI были использованы с сопровождающим буфере при 37 ° С в течение 1 часа.
  4. Запуск 0,8% агарозном гель-электрофорез, чтобы отделить переваренных фрагментов ДНК. В одну лунку, загрузить низкий ДНК массовой лестнице и, в отдельных скважинах, загрузить весь реакцию каждой варки. Запуск гель при 100 вольтах в течение приблизительно 1 ч, пока передний краситель не подходит к концу геля. Визуализация гель под УФ-светом и очистить из сегмент, соответствующий сегменту белка и сократить плазмиды.
  5. Лигируют усваивается сегмент Aip1 и PB1996 плазмиды. Преобразование продукта в DH5α клетках с использованием протоколов изготовитель (10 мкл ДНК с 100 мкл клеток в течение 30 мин на льду, теплового шока при 42 ° С в течение 2 мин, расти в средах SOC в течение 2 часов при 37 ° С) и пластины на культуральных планшетах которые включают антибиотик для выбора, в данном случае LB +Amp пластины. Выберите и расти один колонию в жидкой культуре. Очищают недавно разработанный плазмиды.

2. Мутант штамм дрожжей поколения

  1. Использование гаплоидный штамм дрожжей, в котором актин аллель была удалена, чтобы построить мутантного штамма дрожжей. Примечание: В этом случае родительский штамм был щедрым подарком от д-ра Питера Rubenstein (Университет штата Айова) и конструкция была описана Кук и др. 20 Этот штамм не имеет гена актина хромосомной и содержит плазмиду, кодирующую дикого типа дрожжей. актина и урацил.
  2. Используйте PRS кодирования плазмиды дикого типа дрожжей актин с Trp + выбора в качестве базовой плазмиды для мутагенеза 21.
  3. Выполните сайт-направленного мутагенеза на PRS плазмиды спроектировать миссенс мутации в актина.
    1. Для мутации R256H в актина, сделать грунтовку 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3', чтобы изменить Arg 256 Его 256. Запустите стандартный мутагенезаРеакцию ПЦР с плазмиды со стадии 2.2.
    2. Transform мутантный актина плазмиды из ПЦР в DH5α клетках. Изолировать плазмидной ДНК и секвенирования гена актина для проверки мутации.
  4. Transform плазмиды, кодирующей мутантный дрожжей актин в гаплоидный штамм дрожжей со стадии 2.1.
  5. Культура трансформированные клетки по TRP-пластин, чтобы выбрать для дрожжей, содержащей ГТО +, содержащий мутантный дрожжи актина плазмиды.
  6. Отбора клеток отсутствует исходный плазмиду, кодирующую дикого типа актина и урацил (описано в 2.1) суб-культивирования клеток из Trp-пластин на пластины, которые содержат 5-Fluoroorotic кислоты (5-FOA). 5-FOA превращают в токсичную форму, 5-flurouracil, в поименный штаммы экспрессирующих функциональный ген URA3. Клетки, которые растут после ступенчатого отбора будет содержать только мутантный актина плазмиды.
  7. Очищают плазмидной ДНК из нового штамма дрожжей. Последовательность плазмиды для обеспечения мутантный ген актина присутствует. Используйте это стренироваться в дальнейших исследованиях. Этот процесс схематически на рисунке 2.

3. Преобразование плазмиды в клетках дрожжей

  1. Плазмиду гидролизуют в Aip1p-GFP с ферментом рестрикции, чтобы позволить интеграции в хромосомы дрожжей. ПРИМЕЧАНИЕ: Сайт ограничение должно быть вне блока последовательности, содержащей флуоресцентной метки, представляющий интерес ген, и селективный маркер. В этом случае используют 1 мкл рестриктазы HpaI с 8 мкл ДНК и 1 мкл 10х сопровождающего буфере в течение 1 часа при 37 ° С.
  2. Культура С. CEREVISIAE клетки (от этапа 2.5), которые не способны синтезировать урацил (Ура-деформированного) в течение ночи в 5 мл в YPD СМИ (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% декстрозы) на руле при 30 ° С Спином вниз 1 мл клеток в течение 5 мин при 1000 х г.
  3. Сделать PLATE смесь. Сделать 10XTE добавлением 5 мл 1 М Трис, рН 7,5 и 2 мл 250 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в 43 мл DDH 2 O. Добавить 00,204 г ацетата лития в 20 мл 1XTE, то 8 г полиэтиленгликоля (ПЭГ) (МВт ~ 3300) и фильтра стерилизации.
  4. Слейте супернатант из клеток, выделенных вниз на шаге 3.2 и ресуспендирования клеток в оставшейся жидкости. Для взвешенных клеток, добавляют 2 мкл 10 мг / мл семенников лосося ДНК-носителя. Добавить 10 мкл расщепленной плазмидной ДНК из стадии 3.1 и вихря. Добавить 0,5 мл пластины и вихря. Добавить 20 мкл 1 М DTT и вихря.
  5. Выдержите смесь в течение 6-8 ч при 25 ° С. Теплового шока клетки в водяной бане при 42 ° С в течение 10 мин. Пластинчатые 100 мкл клеток из нижней части трубки микроцентрифужных, где они поселились выходят на-Ура пластины. Инкубируют при 30 ° С в течение 2-3 дней или до колоний форме.
  6. Выбор отдельных колоний и серию выходят на-Ура пластины. ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки содержат плазмиду с геном Aip1-GFP и Ура интегрированной в хромосому, что позволяет для роста. Эти клетки затем будут использованы в microscoру.

4. Визуализация белка Движение Aip1p Использование полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии

  1. Вырастить культуру дрожжевых клеток с объединенной Aip1p-GFP в YPD ночь на руле при 30 ° С Субкультура 1 мл ночной культуры в 9 мл Ura-носителей. Расти клетки для дополнительного 3-4 ч на качалке при 30 ° С для того, чтобы они находятся в фазе роста журнала.
  2. Добавить 3 мкл клеток предметное стекло микроскопа и добавить покровное. Разрешить клетки оседают на слайде в течение 5 мин. Поместите слайд в кронштейне стадии пластины.
  3. Соблюдайте белок Aip1p-GFP с полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопа (488 нм) с использованием масла погружение 100X TIRF объективную и цифровой камеры CCD. Использование Slidebook программного обеспечения 5.0, получать изображения в течение 20 сек в размере 5 кадров / сек (отдельных кадров, полученных изображений представлены на рисунке 2А).
    1. Чтобы сосредоточиться на слоктей, программное обеспечение с открытым Slidebook 5.0 и нажмите кнопку Фокус Window на панели инструментов для доступа к элементам управления фокус. Выберите вкладку Область и выберите цели 100X-TIRF. Включите лампу и сдвиньте блок лампы до 15%. Измените настройки Bin 2 х 2. Измените фильтр для светлого поля.
    2. На микроскопом, используйте тонкую фокусировки для приведения клеток в центре внимания, как видно на экране компьютера.
    3. С помощью элементов управления в окно фокус, выключите лампу, заменить фильтр, чтобы жить, и нажмите кнопку TIRFM.
    4. На TIRFM осветитель, прикрепленной к правой стороне порта микроскопом, включить лазерное излучение Вкл.
    5. Выберите вкладку поток в окне Фокус, установите флажок рядом, чтобы начать запись, а затем нажмите кнопку светлое поле.
    6. На TIRFM осветителя, поверните микрометр для регулировки угла падения лазерного. Это используется для оптимизации флуоресцентное излучение от фокусов Aip1-GFP и свести к минимуму фоновой флуоресценции отклетки и слайд.
    7. Когда появится нужное изображение, нажмите кнопку Старт. После 20 секунд, нажмите Стоп. Сохраните изображения. На вкладке Файл на панели главного меню выберите Сохранить слайд как и введите расположение и имя файла.
  4. Использование программного обеспечения ImageJ чтобы анализировать изображения. Используйте макро плагин "Руководство Tracker", чтобы отслеживать перемещение и скорость флуоресцентного Aip1p очагов. Изменение часового параметр интервала до 0,2 сек.
    1. Используя выбор добавить трек, выбрать и отслеживать индивидуальный флуоресцентный белок через 7:56 соединительной кадров. Используйте команду конец дорожки и скорость движения белка между кадрами будет отображаться в окне результатов.
    2. Определить среднюю скорость между каждого кадра с помощью электронных таблиц Microsoft Excel. Используйте значения для вычисления средней скорости движения Aip1p для каждого клеточного штамма интересов. Примечание: точечный график скорости движения Aip1p и средней нелинейной скорости показана на FIGUповторно 2В.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Способ по изображению динамика белков цитоскелета в клетке представлена. Актин-связывающий белок, Aip1p, был с меткой GFP. Конструкция для плазмидой, кодирующей меткой продукт показан на рисунке 1. Эту плазмиду трансформировали в клетках дрожжей. Экспрессия флуоресцентно меченый Aip1p разрешено визуализацию поведения белка в клетке. Aip1p обычно локализуется в актина в местах эндоцитоза 22. Для количественной оценки движения Aip1p, более 50 люминесцентных Aip1p очаги отслеживались более чем в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эффективная стратегия для визуализации динамики цитоскелета и утилиты в исследованиях по патогенных мутаций было описано здесь. Расширенный методами визуализации создали новые возможности для понимания внутриклеточное движение белков около клеточной мембраны. Полное внутреннее отражение флуоресценции микроскопии (TIRF) является чувствительным методом для функциональных исследований в живых клетках. TIRF использует лазер угловой возбуждения, который создает мимолетную поле из-за разницы в преломления покровного стекла и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Питер Рубинштейн за полезные обсуждения и технических консультаций и Дэвид Pellman для оригинального PB1996 клона. Эта работа была поддержана грантом Марша Dimes и финансирования от езды для детей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Агарозаrpi9012-36-6
Бромофенол БлюAmresco115-39-9
BSANEBB9001S
Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit USBCorporation4166059
CutSmart BufferNEBB7204S
ДНК, одноцепочечная из семенниковлососяSigma9007-49-2
EDTA pH 7.4Sigma93302
Бромид этидияInvitrogen15585-011Внимание! Набор для вредного раздражения
Fungal/Bacterial DNA KitSymo ResearchD6005
HpaINEBR0105S
Ацетат литияAlfaAesar6108-17-4
Лестница с низкой массой ДНКInvitrogen10068-013
NE Буфер #4NEBB7004S
Platinum PCR SuperMix High FidelityInvitrogen12532-016
Набор для миниподготовкиQiagen27106Подойдет любой набор
для быстрой лигации NEBM2200S
Азид натрияSigma26628-22-8
PBSInvitrogen10010-023
PEGAmresco25322-68-3
Tris Base Ultrapurerpi77-86-1
Wizard SV Система очистки гелем и ПЦРPromega06.01.2015
XhoINEBR0146S
XmaINEBR0180S
YPD media LabExpress3011-URA
MediaLabExpress3010
PCR MachineInvitrogen4359659Подойдет любая ПЦР-машина
TIRF МикроскопOlympus IX81
Hamamatsu ORCA-R камераHamamatsu
подойдет

Ссылки

  1. Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
  2. Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
  3. Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
  4. Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
  5. Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
  6. Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).
  7. Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
  8. Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
  9. Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
  10. Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
  11. Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
  12. Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
  13. Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
  14. Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
  15. Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
  16. Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
  17. Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
  18. Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982(2012).
  19. Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
  20. Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
  21. Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
  22. Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
  23. Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
  24. Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
  25. Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
  26. Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
  27. Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

R256HTIRFGFP
Aip1p Динамика изменяются по R256H мутация в актина
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.