Методическая статья

Способ получения первичных клеток рака яичников от твердых образцов

DOI:

10.3791/51581

⸱

4 февраля 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Heath, University of Minnesota, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Maricopa Medical Center and St Josephs Hospital and Medical Center, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование описывает подробный способ выделения и характеристики первичных клеток рака яичников от твердых клинических образцов. Рак яичников клинические образцы подвергаются ферментативного расщепления, чтобы получить жизнеспособную, фибробластов без эпителиального рака яичников (EOC) клеток высоко подходящий для последующих применений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Надежные инструменты для исследования яичников инициацию и прогрессирование рака срочно необходимы. Хотя использование яичников линий раковых клеток остается ценным инструментом для понимания рака яичников, их использование имеет много ограничений. К ним относятся отсутствие неоднородности и множество генетических изменений, связанных с расширенной пассажей в пробирке. Здесь мы опишем метод, который позволяет быстро созданию первичных клеток рака яичников образуют твердые клинические образцы, собранные во время операции. Метод состоит в воздействии клинических образцов для ферментативного расщепления в течение 30 мин. Выделенный клеточной суспензии дают расти и могут быть использованы для последующей приложений, включая скрининга лекарственных средств. Преимущество первичных яичников линий раковых клеток более установленных яичников линий раковых клеток является то, что они являются представителями оригинальных конкретных клинических образцов они являются производными от и могут быть получены из различных сайтах будь примары или метастатическим раком яичников.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на относительно низкий уровень заболеваемости, рак яичников является самой опасной из гинекологических заболеваний и пятой ведущей причиной смерти от рака среди женщин 1,2. В основном это связано с отсутствием надежных инструментов и моделей, которые верой и правдой резюмировать возникновение и прогрессирование заболевания 3. Большинство наших знаний сегодня о раке яичников стало возможным за счет использования увековечены яичников поверхности эпителиальных клеток (IOSEs), рак яичников клеточных линий и первичных клеток рака яичников, извлеченных из асцитической жидкости 4-7. К сожалению, их использование имеет ряд ограничений в том числе ряд генетических и фенотипических изменений, связанных с процессом Иммортализация или в проходах пробирке и неоднородности населения в результате асцитической жидкости препарата.

Таким образом, первичные рака яичников клетки, полученные из идентифицируемых и конкретных твердых образцов рака яичников представляют собой Uniquэ инструментом для изучения яичника прогрессирование рака.

Основные трудности, связанные с получение этих злокачественных клеток обусловлены разрастанием стромальных клеток или фибробластов вместе с потере жизнеспособности и преждевременной отсутствия пролиферативной способностью в культуре этих EOC клеток. Существует несколько методов для создания одного клеточные суспензии из твердых опухолей существуют в настоящее время, с помощью механических средств или ферментативной диссоциации, однако некоторые методы дают большее количество предпочтительного результата 8. Здесь мы показываем, что ферментативное расщепление с диспаза II приводит к эффективной восстановление жизнеспособных, фибробластов без EOC клеток. Полученные таким образом культуры EOC очень восприимчивы к генетической манипуляции и могут быть также использованы в тестах скрининга лекарственных средств, указывая, что эти EOC культур подходят для многих последующих применений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление по этике
Твердые образцы рака яичников были получены из университета Миннесоты ткани закупок фонда (ТПФ) после Экспертный совет организации Комитета: Human Тема Комиссия (IRB) одобрение.

1. Настройка Реагент

  1. Подготовить всю DMEM среду, дополняя DMEM с 10% FBS, и 100 единиц пенициллина-стрептомицина. Хранить среды при 4 ° С и теплой до 37 ° C перед использованием.
  2. Алиготе диспаза II на отдельные тома 5-10 мл, чтобы избежать многократного замораживания оттаивает и хранить при температуре -20 ° С в nonfrost без морозильной камеры.

2. Ткань Коллекция

  1. Сбор твердых образцов рака яичников (~ 5 г в размере) на момент операции из районов макроскопически определены как рак патологоанатом. Клинические образцы де-идентифицированы и зарегистрированы в соответствии с институциональными протоколов.
  2. Поместите образцы в стерильной, SCREW крышка, полипропилен образцов контейнер, наполненный 30 мл охлажденного льдом PBS. Транспорт образцы из хирургической лаборатории патологии в научно-исследовательской лаборатории для обработки на льду, и в течение 30 мин от сбора образцов (рис. 1).

3. Обработка ткани

  1. Работа в стерильных условиях, передавать образцы на чашке Петри (60 мм х 60 мм), содержащей 10 мл свежей, охлажденной льдом PBS и с помощью стерильного лезвие, дальнейшее сокращение в мельчайшие кусочки возможных (2 мм или меньше) ( фиг.2А и 2 B).
  2. Передача фарш ткани в 15 мл конической пробирке, содержащей 10 мл предварительно нагретого (37оС в течение 30 мин) диспазы II (2,4 U / мл) в DMEM и инкубировали в 5% CO 2 и 37 ° С в течение 30 мин. Для обеспечения оптимального переваривания образцов, вручную агитировать клеточной суспензии каждые 5 минут.
  3. После 30 мин инкубации, передачи (с использованием10 мл серологической пипеткой) Клеточную суспензию на клеточный фильтр (70 мкм меш) помещают сверху в 50 мл коническую пробирку и применить мягкое давление на сетке с помощью шприца. Отменить любые недиссоциированного ткани (оставшийся на верхней части меш) и собирают полученной суспензии клеток в 50 мл стерильные конические пробирки. Центрифуга при 320 мкг в течение 7 мин при 4 ° С (рис. 3).
  4. Жидкость над осадком сливают и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS.
  5. Выдержите клеточной суспензии в чашку Петри на 5% CO 2 и 37 ° C (рисунок 4).
  6. Изменение среды после 24 часов от первоначального посева. Это позволяет для удаления клеточных остатков и большинство эритроцитов, присутствующих в культуре.
  7. Изменение среды каждые три дня в течение следующих двух недель, после которых культуры первичной EOC готовы для последовательных применений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Свежие клинические образцы рака яичников собраны после операции (рис. 1) и сократить на мелкие кусочки (рис. 2А и 2В), составляющих суспензии клеток. Это позволяет для оптимальной экспозиции образцов в ферментативной обработки. Клеточную суспензию подвергают ферментативному перевариванию и инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин. Во время инкубационного суспензия становится все более ясно (особенно после каждого агитации), и это является признаком ткани разукрупнения. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лучшее понимание яичников этиологии рака и развития имеет решающее значение для улучшения результатов женщин, пострадавших от этой разрушительной болезни. В этом контексте использование создан и "продаже" яичников линии раковых клеток, несомненно, было чрезвычайно полезно. Тем не менее, сегодня мы знаем, что рак клеточные линии не являются репрезентативными для человеческого опухоли они произошли от во многом в том числе отсутствие гетерогенности 9,10.

Здесь мы сообщаем ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить сотрудников ткани закупок фонда университета Миннесоты за помощь в сборе образцов пациентов ткани. Эта работа была поддержана Министерством обороны яичников исследований рака программы (ОГОС) OC093424 в МБ, по Рэнди бритвы исследованию рака и общественного фонда к МБ, Миннесоты яичников Альянса рака в Мб и фондом Онкогинекология Ведомственные к МБ. Доноры не участвовал в разработке дизайна исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x PBS, стерильный Invitrogen14190-144
Крышка винтовая, контейнер для образцов из полипропилена, стерильныйThermo Scientific02 1090
DMEM medium, стерильный Invitrogen11995-065
Фетальная бычья сыворотка, стерильнаяThermo Scientific HycloneSH30396.03
100x Пенициллин-стрептомицин, жидкаяInvitrogen15140-122
Dispase II, стерильнаяRoche04942 078 001
Маленькие щипцы с тонким наконечником и лезвие скальпеля, стерильныещипцы Fisher Scientific: 08-953E, лезвия: 08-927-5D
Ножницы малые препарирующие, стерильныеFisher Scientific08-945
15 мл Тубы с конической крышкой, стерильныеBD Falcon352097
50 мл Тубы с конической крышкой, стерильныеBD Falcon352027
10 мл Серологическая пипетка, стерильная Corning13-678-11E
6 мл Поршень шприца, стерильный Tyco Healthcare8881516911
Нейлоновый фильтр (70 μ м ) клеточное ситечко, стерильноеBD Falcon352350
5 см чашка Петри, стерильная Corning430166
чашке Петри 10 см, стерильная Корнинг430167

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
  2. Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
  3. Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
  4. Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
  5. Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
  6. Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
  7. Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
  8. Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
  9. Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
  10. Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи