Method Article

Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/51609

⸱

May 22nd, 2014

 ,  ,  , 
1Developmental Biology, Center for Stem Cell Biology, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 2St. Giles Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, The Rockefeller University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нервного гребня (NC) клетки, полученные из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (HPSC) имеют большой потенциал для моделирования человеческого развития и болезни, а также для замены клеток терапии. Здесь фидерных вольное переложение настоящее время широко используется В пробирке Дифференциация протокол для вывода ЧПУ клеток из hPSCs представлена.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) имеют большой потенциал для изучения эмбрионального развития человека, для моделирования болезней человека в блюдо и в качестве источника для трансплантации клеток для регенеративной приложений после болезни или несчастного случая. Нервного гребня (NC) клетки являются предшественниками для большого разнообразия взрослых соматических клеток, таких как клетки из периферической нервной системы и глии, меланоцитов и мезенхимальных клеток. Они являются ценным источником клеток для изучения аспектов эмбрионального развития человека, в том числе спецификации клеточных судеб и миграции. Далее дифференциация клеток-предшественников ЧПУ в терминально дифференцированных типов клеток дает возможность моделировать заболевания человека в пробирке, расследовать механизмов болезни и генерировать клетки для регенеративной медицины. Эта статья представляет адаптацию имеющихся в настоящее время в пробирке дифференциации протокола для вывода ЧПУ клеток из hPSCs. Этот новый протокол требует 18 дней Differentiation, является фидерных бесплатно, легко масштабируемой и легко воспроизводимым среди человеческой эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) линий, а также человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) линий. И старые, и новые протоколы дают NC клетки равной идентичности.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) и человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) показали огромный потенциал, в частности, для исследования и дальнейшего лечения болезней человека, для которого ни хорошие модели на животных, ни первичные ткани доступны. Примеры применения для технологии чЭСК / hiPSC являются: Клетки особый интерес могут быть получены из чЭСК / hiPSCs для регенеративной медицины в неограниченном количестве 1. Клетки могут быть получены от пациентов, несущих конкретного заболевания и используется для установления в пробирке моделей заболеваний 2,3. Такие модели болезни затем могут быть испо....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка питательных сред, с покрытием блюда и обслуживании hPSCs

Подготовка 1.1 Медиа

Примечание: Фильтр все средства массовой информации для стерилизации и хранить при температуре 4 ° С в темноте в течение до 2 недель. Имена реагентов, каталог компаний и номера указаны в таблице материалов.

  1. DMEM/10% FBS: Комбинат 885 мл DMEM, 100 мл FBS, 10 мл Pen / Strep и 5 мл L-глютамин.
  2. HES-среда: Комбинат 800 мл DMEM/F12, 200 мл KSR, 5 мл L-глютамин, 5 мл ручка / стрептококковая, 10 мл MEM минимальная поддерживающая решения аминокислоты, 1 мл β-меркаптоэтанола. Добавить 10 нг / мл....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Два наиболее важных улучшений протокола R-NC по протоколу MS5-R-NC 11 являются фидерные без, определенные условия дифференциации и в целом сокращение требованием времени. MS5 фидерные клетки 13 представляют собой мышиные костного мозга стромальных клеток, полученных, которые были показаны, чтобы поддержать нервную дифференциации от ЭСК 14. ЭСК культивировали на MS5 фидерных клеток при низкой плотности формы эпителиальных структур и нейронных розеток 15, на периферии которого N.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для успешного дифференциации R-NC клеток из чЭСК / hiPSCs следующие соображения должны быть сделаны. Очень важно, чтобы работать в стерильных условиях культивирования во все времена. В частности, важно, чтобы проверить HPSC культур на загрязнение микоплазмой регулярно, так как это загрязнение будет мешать успешной дифференциации, но не могут быть легко обнаружены визуально в HPSC культур. Дифференциация R-NC следует начать на плотности 90-100% клеток; ниже плотность клеток влияет на выживаемость и эффективность R-NC диф.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют противоположные интересы раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана стипендией для продвинутых исследователей из Швейцарского национального научного фонда и за счет субсидий из NYSTEM (C026446; C026447) и инициативе Tri-институциональной стволовых клеток (Старр Foundation).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGibco-Life Technologies11965-092
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
DMEM/F12Gibco-Life Technologies11330-032
Замена нокаутирующей сывороткиGibco-Life Technologies10828-028Следует протестировать лот
L-глутаминGibco-Life Technologies25030-081
Пеницинлин/стрептомицинGibco-Life Technologies15140-122
MEM раствор минимальных незаменимых аминокислот Гибко-Лайф Технолоджис11140-050
&бета;-Меркаптоэтанол Gibco-Life Technologies21985-023токсичный
рекомбинантный человеческий FGF базовый (FGF2)R& D Systems233-FB-001MG/CF
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
DMEM/F12 порошок Invitrogen12500-096
глюкозасигмаG7021
бикарбонат натрия SigmaS5761
APO Человеческий трансферринSigmaT1147
Человеческий инсулин SigmaI2643
Путрисцина дигидрохлоридSigmaP5780
СеленитSigmaS5261
ПрогестеронSigmaP8783
Матригельматрица BD Biosciences354234
поли-L Орнитин гидробромидSigmaP3655
Мышиный ламинин-IR& ампер; D Systems3400-010-01
ФибронектинBD Biosciences356008
диспаже в сбалансированном солевом растворе Хэнка 5 ед/млТехнологии стволовых клеток7013
Трипсин-ЭДТА Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 дигидрохлоридTocris-R& D Systems1254
LDN193189Stemgent04-0074
SB431542Tocris-R& D Systems1614
АккутазаИнновационные клеточные технологииAT104
Аскорбиновая кислота SigmaA4034
BDNFR& D Systems248-BD
FGF8R& D Systems423-F8
Мышь рекомбинантная звуковой еж (SHH)R& D Systems464SH
HBSSGibco-Life Technologies14170-112
HEPESGibco-Life Technologies1563-080
Человеческий рекомбинантный EGFR& D Systems236EG
желатин (PBS без Mg/Ca)в домашних
условиях Антитела:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgMSigmaC6680-100TSTпартия должна быть протестирована
Anti-p75 mIgG1 (рецептор фактора роста нервов)Advanced Targeting SystemsAB-N07партия должна быть протестирована
APC крыса анти-mIgMBD Парминген550676партии следует протестировать
AlexaFluor 488 козий антимышиный IgG1 протестировать партиюInvitrogenA21121
Anti Oct4 mIgG2b (используется в разведении 1:200)протестировать партиюSanta Cruzsc-5279
Материал/оборудование:
эмбриональные фибробласты мыши (7 миллионов клеток/флаконGlobalStemGSC-6105M
Чашки для клеточных культур: планшеты 10 см и 15 см, центрифужные пробирки, пробирки FACS, пипетки, пипетки наконечники
Стеклянный гематоцитометр
Центрифуга
Инкубатор для клеточных культур (CO2, влажность и температура контролируются)
Колпак для ламинарного потока клеточных культур со встроенным микроскопом
Колпакбиобезопасности для клеточных культур
Машина для сортировки клеток, i.e. MoFlo
Инвертированный микроскоп
1 мл TB шприц 27Gx1/2BD Biosciences309623
Клеточный подъемник ПолиэтиленCorning Incorporated3008
Следует Следует )для клеточных культур

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
  2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neural Crest Progenitor CellsHuman Pluripotent Stem CellsFeeder free DifferentiationFluorescence Activated Cell SortingNeural Rosette StageHNK 1 and p75 MarkersCell Migration AssayDefined Small MoleculesPoly L ornithin CoatingN2 Differentiation Medium

Related Articles