Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Человека плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) имеют большой потенциал для изучения эмбрионального развития человека, для моделирования болезней человека в блюдо и в качестве источника для трансплантации клеток для регенеративной приложений после болезни или несчастного случая. Нервного гребня (NC) клетки являются предшественниками для большого разнообразия взрослых соматических клеток, таких как клетки из периферической нервной системы и глии, меланоцитов и мезенхимальных клеток. Они являются ценным источником клеток для изучения аспектов эмбрионального развития человека, в том числе спецификации клеточных судеб и миграции. Далее дифференциация клеток-предшественников ЧПУ в терминально дифференцированных типов клеток дает возможность моделировать заболевания человека в пробирке, расследовать механизмов болезни и генерировать клетки для регенеративной медицины. Эта статья представляет адаптацию имеющихся в настоящее время в пробирке дифференциации протокола для вывода ЧПУ клеток из hPSCs. Этот новый протокол требует 18 дней Differentiation, является фидерных бесплатно, легко масштабируемой и легко воспроизводимым среди человеческой эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) линий, а также человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) линий. И старые, и новые протоколы дают NC клетки равной идентичности.
Введение
Эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) и человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) показали огромный потенциал, в частности, для исследования и дальнейшего лечения болезней человека, для которого ни хорошие модели на животных, ни первичные ткани доступны. Примеры применения для технологии чЭСК / hiPSC являются: Клетки особый интерес могут быть получены из чЭСК / hiPSCs для регенеративной медицины в неограниченном количестве 1. Клетки могут быть получены от пациентов, несущих конкретного заболевания и используется для установления в пробирке моделей заболеваний 2,3. Такие модели болезни затем могут быть испо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка питательных сред, с покрытием блюда и обслуживании hPSCs
Подготовка 1.1 Медиа
Примечание: Фильтр все средства массовой информации для стерилизации и хранить при температуре 4 ° С в темноте в течение до 2 недель. Имена реагентов, каталог компаний и номера указаны в таблице материалов.
- DMEM/10% FBS: Комбинат 885 мл DMEM, 100 мл FBS, 10 мл Pen / Strep и 5 мл L-глютамин.
- HES-среда: Комбинат 800 мл DMEM/F12, 200 мл KSR, 5 мл L-глютамин, 5 мл ручка / стрептококковая, 10 мл MEM минимальная поддерживающая решения аминокислоты, 1 мл β-меркаптоэтанола. Добавить 10 нг / мл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Два наиболее важных улучшений протокола R-NC по протоколу MS5-R-NC 11 являются фидерные без, определенные условия дифференциации и в целом сокращение требованием времени. MS5 фидерные клетки 13 представляют собой мышиные костного мозга стромальных клеток, полученных, которые были показаны, чтобы поддержать нервную дифференциации от ЭСК 14. ЭСК культивировали на MS5 фидерных клеток при низкой плотности формы эпителиальных структур и нейронных розеток 15, на периферии которого N.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для успешного дифференциации R-NC клеток из чЭСК / hiPSCs следующие соображения должны быть сделаны. Очень важно, чтобы работать в стерильных условиях культивирования во все времена. В частности, важно, чтобы проверить HPSC культур на загрязнение микоплазмой регулярно, так как это загрязнение будет мешать успешной дифференциации, но не могут быть легко обнаружены визуально в HPSC культур. Дифференциация R-NC следует начать на плотности 90-100% клеток; ниже плотность клеток влияет на выживаемость и эффективность R-NC диф.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют противоположные интересы раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана стипендией для продвинутых исследователей из Швейцарского национального научного фонда и за счет субсидий из NYSTEM (C026446; C026447) и инициативе Tri-институциональной стволовых клеток (Старр Foundation).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Замена нокаутирующей сыворотки | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Следует протестировать лот |
| L-глутамин | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Пеницинлин/стрептомицин | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM раствор минимальных незаменимых аминокислот | Гибко-Лайф Технолоджис | 11140-050 | |
| &бета;-Меркаптоэтанол | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | токсичный |
| рекомбинантный человеческий FGF базовый (FGF2) | R& D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 порошок | Invitrogen | 12500-096 | |
| глюкоза | сигма | G7021 | |
| бикарбонат натрия | Sigma | S5761 | |
| APO Человеческий трансферрин | Sigma | T1147 | |
| Человеческий инсулин | Sigma | I2643 | |
| Путрисцина дигидрохлорид | Sigma | P5780 | |
| Селенит | Sigma | S5261 | |
| Прогестерон | Sigma | P8783 | |
| Матригель | матрица BD Biosciences | 354234 | |
| поли-L Орнитин гидробромид | Sigma | P3655 | |
| Мышиный ламинин-I | R& ампер; D Systems | 3400-010-01 | |
| Фибронектин | BD Biosciences | 356008 | |
| диспаже в сбалансированном солевом растворе Хэнка 5 ед/мл | Технологии стволовых клеток | 7013 | |
| Трипсин-ЭДТА | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 дигидрохлорид | Tocris-R& D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1614 | |
| Аккутаза | Инновационные клеточные технологии | AT104 | |
| Аскорбиновая кислота | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R& D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R& D Systems | 423-F8 | |
| Мышь рекомбинантная звуковой еж (SHH) | R& D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Человеческий рекомбинантный EGF | R& D Systems | 236EG | |
| желатин (PBS без Mg/Ca) | в домашних | ||
| условиях Антитела: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | партия должна быть протестирована |
| Anti-p75 mIgG1 (рецептор фактора роста нервов) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | партия должна быть протестирована |
| APC крыса анти-mIgM | BD Парминген | 550676 | партии следует протестировать |
| AlexaFluor 488 козий антимышиный IgG1 | протестировать партию | Invitrogen | A21121 |
| Anti Oct4 mIgG2b (используется в разведении 1:200) | протестировать партию | Santa Cruz | sc-5279 |
| Материал/оборудование: | |||
| эмбриональные фибробласты мыши (7 миллионов клеток/флакон | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Чашки для клеточных культур: планшеты 10 см и 15 см, центрифужные пробирки, пробирки FACS, пипетки, пипетки наконечники | |||
| Стеклянный гематоцитометр | |||
| Центрифуга | |||
| Инкубатор для клеточных культур (CO2, влажность и температура контролируются) | |||
| Колпак для ламинарного потока клеточных культур со встроенным микроскопом | |||
| Колпак | биобезопасности для клеточных культур | ||
| Машина для сортировки клеток, i.e. MoFlo | |||
| Инвертированный микроскоп | |||
| 1 мл TB шприц 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Клеточный подъемник Полиэтилен | Corning Incorporated | 3008 |
Ссылки
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
