Добыча Venom и Venom железы Microdissections от пауков для протеомные и транскриптомных анализов

Яды выделениями животных преимущественно вводят в другое животное для целей хищничества или обороны, а также имеют важные биологические приложения с биомедицинской актуальности ^1-3. Только некоторые животные синтезировать яд, но его производство таксономически широко распространены беспозвоночных (например, книдарий, моллюсков-конусов, скорпионов, пауков и) и позвоночных (например, змей, некоторых рыб и млекопитающих), потому что он самостоятельно развивалась несколько раз ^{в 1,4} , Биохимические характеристики ядов, как правило, показывают, что они состоят из широкого спектра белков и пептидов, которые в основном действуют на кровеносную и нервной систем, инъецированных животных, чтобы быстро доставить составные токсины ^1. Небольшая часть ядовитых животных может представлять угрозу для человека, особенно видов с синантропных распределений ^5. Изучение состава яда и функциональной деятельности играет важную роль вфункциональные характеристики позвоночных клеточных компонентов (в частности, нейронные ионные каналы) ⁶ и в выяснении фундаментальные клеточные процессы (например нейросекрета) ^7. Кроме того, выберите яда пептиды обладают полезными свойствами в биомедицинских контекстах, в том числе их использование в качестве средства лечения рака и боли ^8,9, и добываются на кандидатов приводит наркотиков и развития против змеиного яда. Ядов также играют заметную роль в экологическом и эволюционном исследований ^1,4,10,11, таким образом, коллекция этих опасных выделений имеет множество утилит.

Есть> 40000 описанных видов пауков (порядка Пауки), и все, кроме одного из пауков семей более чем 100 обладают парных ядовитых желез, которые оканчиваются в клыков ^12. Видовое разнообразие высокой пауков предполагает, что они представляют собой крупнейший клад ядовитых организмов. Однако биохимические характеристики ядов пауков есть лargely сосредоточено на небольшом количестве видов наиболее часто связанных с человеческой укуса. Последние протеомные и транскриптомных исследования ядов пауков указывают, что они, как правило, содержат много уникальных белков и пептидов ^2,13,14. Достижения в области высокой пропускной кДНК последовательности и масс-спектрометрии пептидов дактилоскопии значительно облегчило открытие этих ядовитых белков ^15. Тем не менее, такая работа начинается со сбора достаточного яда и / или ядовитых желез из пауков и подробной документации для таких методов мало ^16.

Эта статья представляет собой протокол для сбора яда и ядовитых желез из черная вдова пауков, которые могут быть применены к подобного размера пауков. Сбор яда отдельно от желез позволяет идентифицировать белки, которые секретируются в яд, в отличие от белков, выполняющих другие клеточные функции. Черные вдовы и другие Lвиды atrodectus широко признаны одними из самых опасных пауков в связи с их высокой нейротоксической яда, который вызывает сильную боль у человека, который иногда сопровождается обильным потоотделением, мышечных сокращений, гипертонии, затрудненное дыхание и пятнистый паралича ^5. Протокол коллекция яд, представленные здесь использует электростимуляции доставить электрический ток для анестезии пауков, чтобы вызвать мышечные сокращения и высвобождения яда. Капли яда быстро собрали с микро-капилляров и разливают в пробирки для хранения морозильной. Поскольку протокол включает опасные процедуры, она должна быть выполнена только с помощью хорошо обученных людей, и осторожность призвал на ключевых шагов. Собранный яд имеет множество применений, таких как характеристики и изоляции учредительных молекул ^2, для физиологических экспериментов или функциональных анализов ^18, и, чтобы стимулировать экспрессию гена яда ^11. Протокол завершается DESCRiption из яда железы диссекции и сохранение полезной для клонирования яда-специфических генов, экспрессия которых было показано, что происходит в 2-3 дней после яда истощение в различных пауков ^10,11.

1. Подготовка Электро-стимулятор аппарата

1. Подключите электро-стимулятор шнур питания к розетке и подключите внешний педаль для внешнего входного сигнала.
   Примечание: Электрические провода должны быть надежно изолированы и подвергаются металл доставки ток не должны быть затронуты. Носите латексные или нитриловые перчатки для защиты. Выключатель питания Электро-стимулятор должен быть в положении ВЫКЛ при подключении шнура питания и крепления проводов.
2. Подключение положительный электрод к выходному разъему красного на электро-стимулятора (когда переключатель полярности находится в нормальном режиме) и подсоединить отрицательный электрод с выходным выводом черного. Примечание: Каждый электрод провод должен прекратить в крокодил.
3. Установите стимулятор для следующих рекомендуемых начальных установок: напряжение = 7 V, частота = 1 импульсов в секунду, задержка = 0 мс, продолжительность = 200 миллисекунд, две импульсы переключения = обычная, и переключатель режима = выключен.
4. Контрольный выход из электродов путем присоединения зажимами для voltmeтер положительные и отрицательные щупы. Включите выключатель питания стимулятора и доставить ток с педалью.

2. Подготовка щипцы иммобилизации и другие материалы

1. Опустите одну зубец полулегком пинцетом в жидком пластиковым покрытием и ждать четыре часа, чтобы позволить покрытия в сухом месте. Плотно оберните 15 мм кончика противоположной зубца с одним слоем ниток хлопчатобумажных швейных и закрепите нить, связывая конец в узел.
   Примечание: нить используется для поглощения прикладной физиологический раствор, что способствует электрической проводимости, в то время как пластиковое покрытие обеспечивает изоляцию для замедления тока.
2. Вырезать кончик тупой иглы для подкожных инъекций с острыми ножницами и сгладить открытие с наждачной бумагой. Приложите иглу к вакуумной отходов ловушку (например, вакуум-фильтра колбы) через трубки.
   Примечание: игла всасывания от воды и пересказывают, и будет служить для замыкания цепи, созданной стимулятор электродов. Открытие игла муул быть достаточно малы, чтобы не нанести вред паука, но достаточно большой, чтобы вакуумного решения без засорения (например, 25 G х 1 ½ в колеи, см список материалов).
3. Позиция в полулегком щипцы горизонтально в плотно закрытом положении с помощью виниловым покрытием двусторонний зажим, прикрепленный к магнитным основанием или постоянной аппарата стенда под полем вскрытии микроскоп зрения, с пластиковым покрытием зубец щипцов сверху и нить покрыта зубец на нижней.
   Примечание: двусторонний зажим поддерживается в стационарном положении на магнитном основании с помощью держателя зажима (см список материалов). Резинкой может быть плотно закреплены вокруг зубцами полулегком щипцов, рядом с держателем зажима, чтобы добавить дополнительное давление, чтобы держать в полулегком щипцов в закрытом положении вокруг паука раз ввел.
4. Прикрепите положительный зажим электрода аллигатора в нижней зубец щипцов »перед резьбой и приложить отрицательное крокодил, чтобы притупить металла вакуумный иглу. Замыкания с вольтметра путем размещения положительный вывод на щипцов зубец между нитью и крокодил и размещения отрицательный провод от тупой вакуумной иглой Тест. Нажмите педаль, чтобы обеспечить достаточный ток обнаруживается и удалить ведет, если достаточный ток обнаруживается.
5. Подготовьте несколько микрокапиллярной трубы для сбора яда. Удерживая одну микрокапиллярной трубу на одном конце с рукой в ​​перчатке и на другом конце с стерильных металлических щипцов, поместив конец щипцов-горизонтально над пламенем горелки Бунзена. Потяните на микрокапилляр с металлическими щипцами от пламени, чтобы создать удлиненную наконечник, удерживая другой конец в стационарном положении.
   Примечание: носить защитные очки, как микрокапилляры можете легко перелом.
6. Отдых подготовленные микрокапиллярах на монтажной замазки полосы в чашке Петри. Изучите микрокапиллярных заканчивается под микроскопом рассекает и создать небольшой, скошенный отверстие в вытащил конце со стерильными металлическими щипцами.
7. Лябел переменное число стерильных 0,5 мл пробирки. Добавить стерильной деионизированной воды, чтобы стерильные пробирки (например, 5 мкл деионизированной воды автоклавного). Закрыть трубы и место трубки на льду.
8. Приготовьте солевой раствор в химический стакан и заполнить втором стакане с водой в автоклаве.

3. Иммобилизация Паук в щипцы

1. Включите CO ₂ танка и перенести паука из закрытой пластиковой сбора флакона (см список материалов) в СО ₂ камеры с помощью длинных металлических щипцов.
   Примечание: черные пауки вдовы имеют опасную яд; всегда носите перчатки во время этого протокола.
2. Держите паука в камере в течение 5-10 мин или до наркозом и больше не двигаться, когда мягко ткнул с длинными щипцами. Используйте пипетки передачи мочить нить на щипцы с физиологическим раствором.
   Примечание: Рекомендации по CO ₂ параметров анестезии для черных вдов, относятся к Испании и Мур ^19.
3. Получить наркозом паука из CO ₂камера, выбирая его по его передних ног с использованием тупых рассекает щипцов и руки в перчатках. Перемещение наркозом паука полулегком щипцы аппарат. Отдельные зубцы закрытых полулегком пинцетом и поместить головогрудь паука между зубцами и позволяют зубцы, чтобы закрыть запорный обеспечить паука проводится крепко на месте, но не быть раздавленным. Убедитесь, что паук находится панцирь тыльной стороной вниз (см Foelix ²⁰ для руководства к паука анатомии), опираясь на нити покрыты зубцами, и брюшная сторона панциря в перед пластиковое покрытие, в то время как положительный электрод остается прикрепленной к нижней вилке. Работают быстро при обращении паука.
4. Отрегулируйте не рассекает микроскопа увеличение, фокус, и источник света, пока хелицер паука и клыки четко видны.

4. Яд Коллекция

1. Включите вакуум и спрей паука хелицеры с водным раствором, используя второй тупой наконечником шприца пeedle. Всасывания в сторону воды с вакуумной иглой для удаления примесей.
2. Сенсорный вакуумный иглу с прикрепленной отрицательного электрода к паука трибуны и доставить импульс с педаль один или более раз. Вакуумная от пересказывают при необходимости.
   Примечание: паук трибуна находится внутри рта кзади, чтобы Хелицеры на спинной поверхности между хелицер и endites (см Foelix ²⁰ для детального паука анатомии). Примечание: При каждом импульсе, ноги контракт паука, и яд будет виден в виде прозрачных капель, выходящих из клыков.
3. Соберите яд капли с кончика микрокапиллярной и передачи капиллярного кончика в 0,5 мл пробирку с водой или буферным раствором (раствор будет втягиваться в капилляр).
   Примечание: во избежание проколов паука с капилляра, которые могут привести к загрязнению гемолимфы и смерти. Также во избежание загрязнения капилляра с шелком и клеем из фильеры.
4. Прикрепите передачи шприц с адаптером трубка для микрокапилляр (на конце, противоположном кончике сбора) и гispense яд решение вернуться в трубке. Поместите трубку на льду.
   Примечание: Утилизировать капилляров отходов в соседнем контейнер для острых предметов.
5. Разместить пластиковую сбора флакон, вместе с его крышкой, рядом с пауком. Аккуратно возьмите паука ноги с тупыми Препаровальный щипцы в одной руке и осторожно откройте полулегком щипцы штыри с другой стороны, раздвижные паука в сборе флакон с тупыми щипцами и быстро тесном крышкой. Продолжить с рядом пауков и магазинов яда содержащих труб в -80 ° C морозильнике, когда закончите.
   Примечание: по-прежнему проявлять осторожность при перемещении паука от щипцов обратно в пузырек. Убедитесь, что сбор флакон и крышка находится неподалеку от паука для ее быстрой передачи и в перчатках.

5. ядовитой железы Вскрытия

1. Два-в-три дня после сбора яда, обезболить паука в СО ₂ камеры (см шаг 3,1). Заполните жидкий носитель азота и место рядом с рассекает микроскоп.
   Примечание: белыйан работе с жидким азотом, защита использование глаз и криогенных перчатки.
2. Чистый район рассечение и рассечения щипцы с раствором, что исключает РНКазы и ДНК загрязнения. Заполните небольшую чашку Петри, размещенный под микроскопом рассекает с рассечения буфер (например, цитрат 1x солевой раствор-натрия (SSC) буфере).
3. Передача паук из CO ₂ камеры на чашке Петри и использовать пинцет, чтобы быстро отделить головогрудь с живота.
4. Держите головогрудь под микроскопом рассекает с пинцетом и поместить хелицеры в поле зрения. Используйте острые концы второй парой щипцов, чтобы вырезать кутикулу присоединения к панцирь к боковым аспектов хелицер. Сбоку понять хелицеры, используя вторую пару щипцов и аккуратно потяните вперед и назад, пока яд железы не вытащил.
5. Отдельные железы от хелицер (или оставить прикрепленные к Хелицеры при желании) и перевод на cyrosafe трубки 0,5 мл. Место Клосаред трубки в жидкий азот.
   Примечание: каждый рассечение следует принимать не более 15 мин.
6. Повторите рассечение с дополнительными пауков пока не закончено. Передача трубки из жидкого азота в -80 ° C морозильнике.

Коллекция яда и яд железы вскрытий часто выполняются охарактеризовать яда белки и пептиды на уровне 10,11,15 последовательности. Собранные яд также могут быть использованы в физиологических анализов, чтобы определить их функциональную активность 18. Сбор яда будет стимулировать экспрессию гена железы яда, тем самым облегчая клонирование конкретных токсина транскриптов с помощью ОТ-ПЦР 10,11. Идентификация яда белков также может быть выполнена в высокой пропускной образом за счет интеграции стандартных методов масс-спектрометрии с базами данных последовательностей, полученных из яда железы кДНК библиотек 15,21. Примером такой работы, начиная от яда и желез, собранных с использованием протокола указано выше, демонстрируя свою эффективность, показано на рисунке 1.

Venom собраны из L. Геспер взрослые самки переваривали трипсином и подвергают в раствореАнализ MuDPIT, которая связывает ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) с тандемной масс-спектрометрии (MS / MS). Вот анализ MuDPIT была выполнена в Университете Аризоны протеомики консорциума. Массы обнаруженных пептидов и их фрагментов (диссоциированных ионов дочерние, выведены из спектров), сравнивали с пептидных последовательностей теоретически предсказанные переводов из последовательностей кДНК, полученных из библиотеки экспрессии генов, построенного из L. Геспер ядовитых желез (железы, приобретенные в соответствии с протоколом вскрытия описано выше) 21. В этом эксперименте, 36 были обнаружены белки от всех собранных спектров, на 99,9% -ного порога вероятности, и содержали по крайней мере один пептид обнаружено. Один из обнаруженных белков поддерживается 43 общего спектров (образец спектров показано на фиг.1А), соответствующие трем эксклюзивных пептидов, охватывающих 35% белковой последовательности (Фиг.1В). Обнаруженный протеин (в переводе с collecte d кДНК) имеет максимальную BLASTP хит для latrodectin от L. tredecimguttatus (GenBank, P49125.1), с электронной счетом 2E-46, и разделяет 80% идентичностью на уровне аминокислотной последовательности белка с обнаруженной в этом эксперименте. Latrodectin, который также известен как альфа-latrotoxin низкой белка молекулярной массы, является признанным яд составляющая черной вдовы пауки 22, 23, проверки эффективности представленной протокола. Некоторые белки, определенные из яда соответствуют последовательностям, для которых нет BLAST хитом не найдены. Неясно, является ли такой результат из-за ограниченных геномных ресурсов, доступных для пауков, а также ограниченного функционала информации для своих белков, или из-за неизвестного белка представляет собой яд примеси. Тем не менее, ген или экспрессии белка анализирует изучения обилие такого нового белка в ядовитых желез по сравнению с другими тканями должны выявить, является ли он подлинным компонент яда.

ЛОР "л: держите-together.within-страницу =" всегда ">
Рисунок 1: Latrodectin пептид, идентифицированный с черной вдовы яда с помощью масс-спектрометрии () представитель спектры (один из 43) обнаружен с помощью MS / MS части MuDPIT анализа L.. Геспер яд, который был назначен в предсказанной переводе собранной последовательности кДНК, показанной в части В. спектров показывает массы к заряду (m / z) обнаруженных дочерних ионов на горизонтальной оси, полученного путем фрагментации исходного пептида (CGEEDFGEEIVK), с буквами на верхней указывающий на пептидную последовательность на основе дочерних ионов масс. (В) последовательности белка, к которой спектры в части А был назначен, показывающий в красный, жирный и подчеркнутый текст собой соответствующую последовательность из спектров, приведенных в части А, дополнительный красный текст (не жирный) представляет собой еще один пептид в этом белке обнаружен с другой собранной зрectra. Последовательность белка в переводе с последовательностью кДНК, полученной из расчлененных ядовитых желез.

Автор не имеет никакого отношения к раскрытию и никаких конкурирующих финансовых интересов.