Автоматическое измерение микроциркуляции крови скорость потока в легочных метастазов у ​​крыс

Краткое содержание

Представлен метод измерения скорости микроциркуляторного кровотока при метастазах рака легких на плевральной поверхности у крыс автоматизированным способом, с использованием закрытой грудной клетки легочной прижизненной микроскопии. Эта модель может быть использована в качестве широко распространенного инструмента для проведения физиологических исследований метастазов в легких у грызунов.

Аннотация

Поскольку легкое является основным органом-мишенью метастатического заболевания, животные модели для изучения физиологии легочных метастазов имеют большое значение. Тем не менее, на сегодняшний день существует очень мало методов для динамического исследования метастазов в легких на микроциркуляторном уровне из-за трудности доступа к легкому с помощью микроскопа. В данной работе представлен метод прижизненной микроскопии для функциональной визуализации и количественной оценки микроциркуляции поверхностных легочных метастазов у крыс с использованием закрытого окна в грудной клетке и автоматизированного анализа скорости и направления кровотока. Полезность этого метода продемонстрирована для измерения увеличения скорости кровотока в ответ на фармакологическое вмешательство, а также для визуализации хорошо известной извилистой сосудистой сети солидных опухолей. Это первая демонстрация прижизненной микроскопии легочных метастазов в закрытой модели грудной клетки. Из-за своей минимальной инвазивности, а также из-за относительной простоты и практичности, эта технология имеет потенциал для широкого использования в лабораториях, специализирующихся на исследовании опухолей легких.

Введение

Легкое является одним из наиболее важных органов-мишеней метастатического заболевания, и поскольку это состояние трудно успешно лечить химио- и лучевой терапией, излечение все еще редкое^1,2. Специфические патофизиологические и микроциркуляторные особенности солидных первичных и метастатических опухолей, такие как микрорегионарная гипоксия, ограничение диффузии и неэффективная сосудистая сеть опухоли, в значительной степени способствуют их резистентности к противоопухолевому лечению^3,4. Благодаря микроскопическим масштабам и динамическому характеру таких параметров, как микрососудистый кровоток, прижизненная микроскопия опухоли у живого животного стала очень важным инструментом исследования^{в этой области}. В то время как модели прижизненной микроскопии применялись к опухолям в различных органных участках, включая метастатическое легкое в открытой грудной клетке, до сих пор не разработан протокол исследования легочных метастазов в физиологически сохраняющей, закрытой среде грудной клетки^6,7. Такое усилие особенно затруднено необходимостью хирургического доступа к грудной клетке без влияния на общую функцию легких^7-9. Недавно был представлен метод визуализации легочного микроциркуляторного кровотока в закрытой грудной клетке у живых крыс с использованием флуоресцентной^{прижизненной} микроскопии. Этот протокол позволяет проводить систематическую количественную оценку скорости кровотока от вводимых, флуоресцентно меченных эритроцитов с использованием компьютерного анализа, сохраняя при этом физиологическую стабильность животного и сохраняя целостность легких^. В настоящем исследовании показано, как эта технология может быть модифицирована для визуализации и количественного определения микроциркуляторного кровотока в легочных метастазах, инокулированных в хвостовую вену, на поверхности плевры у крыс с ослабленным иммунитетом. Эта модель также является первой моделью, в которой изучаются метастатические опухоли легких в условиях прижизненной микроскопии закрытой грудной клетки.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных, связанные описанные в этом протоколе были ранее утверждены Уходу за животными и использованию комитета Университет Дьюка (DUIACUC) по.

1. Рак клеточной культуре и впрыска

1. Развивайте флуоресцентно меченных метастатических раковых клеток (например, человека MDAMB231-GFP клетки рака молочной железы, подарок от доктора Патриции Steeg, NCI, и YFP меченных мыши клеток саркомы, подарок от д-ра Дэвида Кирша, Duke University Medical Center, отдел радиационной онкологии) не в соответствующей культуральной среде (например, Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептавидин) при 37 ° С до примерно 90% сплошности.
2. Trypsinize клеток, мыть их два раза с PBS, граф, а затем ввести их в хвостовую вену изофлурановой анестезии-10 недель самок голых крыс при 5000000 клеток на животное, с помощью шприца с иглой 27 G. Anesthes Хирургические уровняИ. А. проверяется отсутствие реакции на носок крайнем случае.

2. Мониторинг метастазов Использование MicroCT

1. Изучение крыс один раз в неделю с помощью микро-CT / микро-облучатель, чтобы обнаружить присутствие метастазов выше примерно 2 мм в диаметре в диаметре. Микро-КТ в эксплуатацию, как описано выше ^12.
   1. Тема крысы до 3% ИФ анестезии до визуализации. Подтвердите глубокую анестезию пальца щепоткой.
   2. После начала наркоза, быстро передавать крыс колыбели изображений в камере изображений и подключения через носовой конус к ИФ-воздушной смеси на 2,5-3%. Отрегулируйте положение крысы в ​​колыбели таким образом, что его грудная клетка, расположенного в фотонном пучке MicroCT сканера, используя внешнее управление позиции и лазерной разделитель на подставке изображения. Убедитесь, дверь в камеру изображения закрыта, чтобы защитить следователь из гамма-лучей.
   3. Управление позицию животного еще раз с помощьюцветная видеокамера. Выполните пробную КТ изображения бежать с низким разрешением, а также использовать полученное изображение, чтобы отрегулировать поле зрения с XYZ размеров грудной полости.
   4. Изображение крысы грудной клетки с использованием 2 мм Al фильтра на 40 кВп, 2,5 мА, и 0,008 воксел на 7 FPS и вернуть животное в клетку. Визуализация одного животного следует принимать не более 15 или 20 мин. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью выздоровел. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в достаточной сознание поддерживать грудины лежачее положение.
   5. Подтвердите метастазы появлением относительно рентгеноконтрастных объектов, которые не могут быть объяснены внутригрудных сосудов (1А)

3. Окно палата хирургии

1. Анестезия, жизненно важных функций и хвостовую вену катетеризации
   1. Выберите животных с наличием метастазов. Вводят животное с внутрибрюшинного DOSE 50 мг / кг фенобарбитала. Подтвердите хирургическое уровня анестезии пальца щепоткой прежде чем продолжить.
      Примечание: протоколы анестезии должен быть согласован с соответствующей экспериментальной установки. Пентобарбитал был выбран здесь как длительного действия анестетика, для того, чтобы вызвать глубокий наркоз для длительных процедур, а также предложить возможность легкому повторного введения. Тем не менее, потеря животных передозировки является общей проблемой с анестезией пентобарбиталом. Другой вариант, который сохраняет вегетативные рефлексы в большей степени, чем фенобарбитала является кетамин в сочетании с седативными средствами, такими как ксилазина или медетомидина, который, однако, позволяет только для одного повторного дозирования цикла.
   2. Бритье животных на стороне тела, что имеет метастазы, и в области шеи, используя машинку. Протрите все оставшиеся свободные волосы с поверхности кожи. После распущенные волосы удаляют, применять ветеринарный мазь для глаз, чтобы предотвратить их от высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: бестимусных голых крыс могут иметь остаточную волосы, которые requiУдаление разрешения, прежде чем приступить хирургических процедур. Это очень важно, чтобы удалить все волосы тщательно, так как это может помешать хирургических процедур и визуализации.
   3. Fix животное в положении лежа на спине на металлической пластине, которая находится на 37 ° C вода циркулирует грелку. Передние и задние конечности крепятся на пластине с лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это полезно для контроля и записи жизненно важные признаки, такие как частота сердечных сокращений и артериального оксигенации крови с помощью пульсоксиметра, на протяжении хирургических и экспериментальных процедур.
2. Интубация трахеи
   1. Для того чтобы разместить катетер для вентиляции животного, сначала сделать поперечное шейки разрез кожи с последующим разделением средней продольной мускулатуры брюшной части трахеи.
   2. Используйте многократного действия открытие к закрытию при резком щипцов для создания прохода для шва через спинной стороне трахеи.
   3. Сделайте небольшой надрез в трахее на Т-Он вентральной стороне, не более чем полукруглое, примерно между второй и третьей кольца трахеи. Оставьте достаточно длинный участок трахеи воздействию на дорсальной поверхности, чтобы включить фиксацию катетера трахеи.
   4. Вставьте 2,5 мм до 3,0 мм "Y" трахеи канюли в трахее и затяните с 4-0 мононити шва. Обеспечить канюли соединен с вентилятором на циклическое изменение давления с бутылкой, подключенного к каналу годности, который наполнен 6 см воды, чтобы поддерживать положительный легких давление. Втекающая газ должна быть 100% кислорода, если экспериментально не желал иначе.
   5. Вставка катетера с 25-27 G иглы, и заполнены гепаринизированной физиологического раствора в один из хвостовых вен крысы, и закрепить в месте с лентой.
      Примечание: Обеспечить проходимость хвостовой вены катетер в течение всей процедуры, неоднократно инъекционных небольшое количество гепаринизированной физиологического раствора в хвостовую вену. Кроме того, орально-интубации трахеи, т.е. руководством трахеиТрубка через рот анестезированных животных и мимо гортани в трахею, является возможной альтернативой процедуре трахеотомии, описанной здесь. Тем не менее, этот метод требует специальной подготовки и опыта, чтобы избежать повреждения трахеи, а также исключает случайное катетеризации пищевода.
3. Применение легких окне
   1. Удалить кожу со стороны грудной клетки, где метастазы находится, создавая разрез, а затем снятие кожи с использованием тупым.
      Примечание: кожа может быть вырезан и удален после отрыву
   2. Перейдите по рассекает два слоя наложенного мускулатуры (грудной, зубчатой ​​и широчайшие мышцы спины), но оставляя межреберные мышцы нетронутыми. Создание перфорации в грудной полости приблизительно 1,5 см в диаметре, путем удаления части обычно два смежных ребра. В идеале, найдите перфорации области шестого и седьмого RIBS.
   3. Osteotomy:
      1. Чтобы свести к минимуму кровотечение и повреждение поверхности легких, плотно удерживать ребро быть сокращены с зубчатыми хирургических щипцов во время резки. Использование хирургических ножниц, разрезать медиальной стороне ребра первых, под углом примерно 45 °, в результате чего заостренный сторону оставшегося грудной кости, указывая на улице.
      2. Впоследствии, сократить боковой стороне грудной кости таким же образом, снова оставляя острый сторону грудной кости, указывая наружу, чтобы предотвратить повреждение поверхности легких.
      3. Повторите процедуру для прилегающей ребра, а затем вырезать межреберные мышцы и снять вырезали кусок. Во время этой процедуры, поддерживать давление легких таким образом, что механическое взаимодействие между поверхностью легких и грудной клетки сводится к минимуму. Для этого соответствующим образом регулируя вдохновение давление на искусственной вентиляции легких.
   4. Вставка из окна:
      1. Вставьте на заказ окно легких, состоящая из покровного стекла, что являетсяприсоединен к разъему плексигласа (Фиг.1В). Установите окно в гнездо склеиванием или путем применения очень небольшое количество вакуумной смазки. Вставка окно таким образом, что поверхностные метастазы расположены близко к центру окна. Если необходимо, отрегулируйте вставленный дыру, чтобы принести микрометастазов в центре окна, увеличивая отверстие слегка соответствующей стороны.
         ПРИМЕЧАНИЕ: метастатической болезни на плевральной поверхности могут быть определены как явно узнаваемых белых точек или областей, расположенных в противном случае от розового до лосось цветных здоровые части поверхности легких, которые появляются преимущественно по трещинам. В то время как микрометастазов может произойти на других участках плевральной внешний вид, исследованные клеточные линии почти всегда отображать наплавки микрометастазов в перфорированной области, когда метастазы могут быть обнаружены рентгенологически.
      2. После установки гнездо в перфорации, а также создание прямой контакт с висцеральной плевры лУн, шов края оконной рамы к окружающей межреберных мышц, используя 4,0 мононити шов (рис 1в). Используйте небольшое увеличение давления вдоха на искусственной вентиляции легких, чтобы помочь остаточный воздух, чтобы избежать и создать уплотнение.
         Примечание: частота дыхания у крыс может сильно варьироваться, в зависимости от состояния анестезии, состояние возбуждения или тревоги, концентрации кислорода во вдыхаемом воздухе (FiO _2), и т.д., рекомендуется настроить частоту дыхания между 70 и 90 ударов в минуту. Давление вдохновение должны быть скорректированы с осторожностью и не быть установлен в более прибл. 8 см H ₂ O (0,6 мм рт.ст.), чтобы избежать повреждения поверхности легких.
   5. Расположите животное в специально разработанной фиксатор, который предназначен для устранения Z-направленного движения (рис 1D) на стальную пластину, которая расположена на термостатический (электрический) одеяло отопления, под флуоресцентным микроскопом. Управление тело животноготемпературы с помощью ректального термистор. Отрегулируйте винты животного фиксатор, и давление вдохновение на искусственной вентиляции легких для достижения оптимального контроля бокового движения.
      Примечание: естественное дыхание у млекопитающих включает все три направления движения легких и расширение грудной клетки: двусторонняя, спинно-брюшного и черепно-хвостовой. Для того чтобы сохранить естественное движение дыхания, насколько это возможно, важно, чтобы свести к минимуму Z-направленного сжатия в необходимом объеме. Поскольку Z-мерное удерживающее имеет потенциал, чтобы представить артефакты, которые могут повлиять на кровоток и другие параметры, желательно, чтобы постоянная условий во серии повторных измерений в одной и той же животного.

4. Работа с изображениями и измерения микроциркуляции кровотока

1. Собирают клетки крови с помощью пункции сердца и маркировать их с DiI (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 =, 3 = тетраметил-индодикарбоцианинового перхлорат), как описано ранее ^10.
2. Вводят 300 мкл меченых эритроцитов в хвостовую вену крысы перед окном камеры операция выполняется, чтобы избежать первого прохода адгезии эффекты на оконное стекло. Ликвидировать все пузырьки воздуха в шприце или катетера, как введение воздуха в вену будет препятствовать какие-либо дополнительные инъекции.
3. Изображение кровотока с ПЗС-камеры микроскопа при -40 ° С температура охлаждающей чипа, и примерно 100X целом разрешение (т.е. с объектива микроскопа 10X, 10X и до камеры глазного). Используйте стандартные наборы Rhodamine / TRITC фильтра (возбуждение 450-490 нм, эмиссия> 515 нм). Запишите фактически используемой частоты кадров и разрешение пиксела получаемых в виде последовательности изображений. Запись по крайней мере, 200 (в идеале около 300) кадров стека, чтобы обеспечить успешное анализ скорости потока.
4. Пополнить потери жидкости у животного путем введения примерно 1 мл физиологического раствора IP каждый час.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные установки, которые включают вмешательства, например,Препарат, который изменяет скорость кровотока в легочной метастазов рака, требует повторных измерений скорости кровотока в легких метастатическим раком. Для этих расширенных экспериментов, важно, чтобы пополнить животное с достаточной жидкости.
5. Эвтаназии животных от инфузии 3 мл 3 н KCl в хвостовую вену
6. Оценить стеки, используя опубликованы, публично доступный Matlab-компьютер на базе алгоритма, который будет создавать оттенки серого скорость потока и цвет кодируется карты для всех кровотока следы ^10,11. Впоследствии оценить полученные изображения в градациях серого с помощью коммерческого или публично доступное программное обеспечение для анализа изображений, таких как изображения J, после пороговой от значений, которые указывают на отсутствие движения клеток крови, т.е. не активное сосудов.

Результаты

Сосудистую в солидных опухолей, как известно, значительно отличаются от нормального кровоснабжения, показывающий большую степень извитости, и более высокие intervascular расстояния ^13. Соответственно, дорожки кровотока в экспериментальных легочных рака молочной железы и саркомы метастазов имеют неправильную форму и большие зазоры intervascular (фиг.2А, нижние две панели) по сравнению с нормальной легочной микроциркуляции (фиг.2а, верхняя панель). В предыдущем исследовании, сп...

Обсуждение

Модель представлена, что является возможным изменениям изображения в микроциркуляторном кровотока и других динамических процессов в легких метастазов у ​​крыс, используя прижизненный микроскопии и вычислительный анализ потока крови. В то время как другие методы существуют, чтобы выполнить микроскопии на открытых легких в открытых ribcages грызунов, эта модель также первым снимком метастазами в легких, через стенки грудной клетки перфорации в условиях закрытого груди. С помощью этого метода, возможность показана для изме...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Атимические обнаженные крысы	Чарльз Ривер	Код штамма 316	Самка 10-недельной атимической обнаженной крысы
микро-КТ/микро-Облучатель	Прецизионный рентгеновский аппарат	Xrad 225Cx	Используйте микроКТ для обнаружения метастазов
DiI (1,1=-диоктадецил-3,3,3=,3=-тетраметил-индокарбоцианина перхлорат)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Смешайте 100 мкл упакованных эритроцитов со 100 мкл 0,5 мг/мл DiI в 200-градусном этаноле, 2 мл 5% раствора декстрозы в воде и заполните до 10 мл конечного объема с помощью физиологического раствора
ИВЛ для грызунов	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Прибор важен для поддержания положительного давления в легких после применения пневмоторакса
Флуоресцентный микроскоп Zeiss Axioskop вертикально	Zeiss	Axioskop	для прижизненной визуализации
CCD камера	Andor	iXonEM 885	CCD камера для визуализации кровотока в реальном времени
Пульсоксиметр	StarrLife	MouseOx	Пульсоксиметр
Флуоресцентный микроскоп		Флуоресцентный микроскоп	Axioskop

Микроскоп Zeiss