Экс естественных Культура Система по изучению развития щитовидной железы

Краткое содержание

Этот протокол описывает вскрытие эмбрионального анлагена щитовидной железы мыши и культивирование эксплантов на полупористых фильтрах или на пластиковых предметных стеклах для микроскопии. Эта система идеально подходит для изучения морфогенетических или дифференцировочных событий, происходящих во время развития щитовидной железы эмбрионов дикого типа или нокаутных эмбрионов, и поддается экспериментам по приобретению и потере функции.

Аннотация

Щитовидная железа двудольное эндокринная железа локализуется у основания шеи, производя гормоны щитовидной железы Т3, Т4, и кальцитонин. T3 и T4 производятся дифференцированные тироцитов, организованных в закрытых сферах называемых фолликулов, а кальцитонин синтезируется С-клеток, которые чередуются между фолликулов и густой сетью кровеносных капилляров. Хотя взрослый архитектура и функции щитовидной железы широко описаны и изучены, формирование "ангио-фолликулярных" единиц, распределения С-клеток в паренхиме и паракринных связи между эпителиальных и эндотелиальных клеток далеко не понял.

Этот метод описывает последовательные стадии эмбриональных щитовидной ANLAGEN вскрытия и ее культуры на semiporous фильтров или на микроскопии пластиковых горок. В течение четырех дней, эта система культуры добросовестно повторяет в развитии щитовидной естественных условиях. В самом деле, (я) млрд.obation органа происходит (для эксплантов E12.5), (II) тироцитов предшественники организовать в фолликулах и поляризации, (III) тиреоциты и C-клетки дифференцируются, и (IV) эндотелиальные клетки, присутствующие в микродиссекции ткани пролиферируют, мигрируют в доли щитовидной железы, и тесно общаться с эпителиальных клеток, как они это делают в естественных условиях.

Тканей щитовидной железы может быть получен из дикого типа, нокаутом или флуоресцентных трансгенных эмбрионов. Кроме того, эксплантов культуры можно манипулировать добавлением ингибиторов, блокирующих антител, факторы роста или даже клетки или кондиционированной среды. Экс естественных развитие могут быть проанализированы в реальном времени или в любое время в культуре иммунного окрашивания и RT-КПЦР.

В заключение эксплантата щитовидной культуры в сочетании с последующей целом монтажа или на разделы изображений и экспрессия генов профилирования предоставляет мощную систему для манипулирования и изучения морфогенетических и дифференциации события щитовидной Organogenesis.

Введение

Щитовидная железа представляет собой набор независимых эпителиальных сферах, называется фолликулы, в окружении густой сетью эндотелиальных капилляров. Такая организация позволяет функция щитовидной железы: эндотелиальные капилляры обеспечивают тироцитов с йодом, необходимые для T3 и T4 синтеза гормонов, и распространять эти последние на все тело. Переменная между фолликулов и капилляров, C-клетки производят hypocalcemic гормон кальцитонин ^1. Хотя архитектура и функции взрослых щитовидной хорошо известны, клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в щитовидной эмбрионального развития (образование фолликул и дифференцировки) далеки от понимания.

Во время эмбриогенеза, тироцитов прародитель возникает как утолщение (по средней линии закладки в) брюшной стенки энтодермы передней кишки в эмбриональный день (е) 8,5 у эмбрионов мышей, в то время как C-клетки предшественники происходят на E11.5 как капли выступов ( ultimobranchial боумирает) четвертого глоточных карманов ^2-6. Срединная линия бутон затем отделяется от энтодермы, расширяет двусторонней основе сплавить в E13.5 с ultimobranchial органов на каждой стороне трахеи. Наконец, тиреоциты организовать в фолликулов и С-клетки дифференцируются.

Современные знания о формировании щитовидной железы, главным образом, происходит от гистологического анализа основных тканей, но морфогенетические события, участвующие в формировании щитовидной железы обладают высокой динамической и включают связи и взаимодействия между различными типами клеток и с внеклеточным матриксом. Недавние работы показали, что клетки-предшественники тиреоцитов производить высокие уровни VEGF по набору эндотелиальных клеток в развивающемся щитовидной железы, и, в свою очередь, набранных эндотелиальные клетки способствуют образованию фолликула и C-клетки дифференциация ^7.

Большинство Экс Vivo исследования щитовидной железы были выполнены на изолированных щитовидной железы клеток, полученных взрослых, выращиваются либо на 2D культуре ткани пластиковая дгибнет или в 3D матриц. Используя эти типы культур, дифференцированные фолликулярные клетки либо остаются поляризованы и организованные, как фолликулов или повторно приобрести 3D организацию ^8-10. Тем не менее, эти чистые эпителиальные клетки, эксплантированной от их физиологической среде и культивировали в 2D, игнорировать взаимодействия с внеклеточного матрикса, цитокинов, факторов роста и с другими типами клеток, таких как эндотелиальные клетки или нервов, что они обычно сталкиваются в естественных условиях. Очень хороший Исследование, недавно описал дифференциации протокол ЭС клеток в фолликулах щитовидной железы с использованием последний шаг культуры в 3D матригеле ^11. Однако эти 3D культур не имеют контакта с другими типами клеток.

Основываясь на предыдущем экспертизы по поджелудочной железы и слюнных желез органов культуры ^12-14, метод рассечения мышиных эмбриональных Anlagen щитовидной железы и культивирования эксплантов на semiporous фильтров или на микроскопии пластиковых горок была разработана.

Когдаработы с эмбрионами E12.5, двойной происхождение зачатков железы (по средней линии закладки в и две боковые ultimobranchial органы) ввел микродиссекции большого фрагмента ткани. Это содержится в трахею, но не пищевода, и простиралась от глотки арки артерий до черпаловидного набухания. При культивировании на фильтрах, по средней линии закладка проходит в поперечном направлении на каждой стороне трахеи, где они соединяются с ultimobranchial органов с образованием двух долей щитовидной железы, все еще соединенных узкой перемычкой.

В культуре, эпителиальные клетки размножаются, организовывать в фолликулах и дифференцироваться в тироцитов и С-клеток, в зависимости от их происхождения. Эндотелиальные клетки, содержащиеся в микродиссекции ткани также пролиферируют и проникают в долей щитовидной железы, наконец, связать в тесном контакте с эпителиальной фолликулярной структуры, независимо кровотока или циркулирующих факторов. Как развитие эксплантов добросовестно повторяет в естественных условиях развиватьния, эта система культуры является оптимальным для изучения морфогенетических и дифференциация события, происходящие во время развития щитовидной железы.

Ткани щитовидной железы могут быть получены из дикого типа, нокаутом или люминесцентных трансгенных эмбрионов, и система культуры поддается потери-и амплитудно-на-функции экспериментов. Наконец, покадровой визуализации флюоресцентно меченых эксплантатах щитовидной железы на микроскопии пластиковой посуды может быть использована, чтобы лучше исследовать кинетики и непрерывность морфогенетических движений, которые происходят в естественных условиях. Покадровой обработки изображений уже используется для изучения морфогенеза ветвления поджелудочной железы ^15,16 или зачатка мочеточника ^17.

Протокол

Мыши были подняты и обработаны в соответствии с принципами лабораторной ухода за животными Комитета университета защиты животных. Все процедуры и протоколы были одобрены этого Комитета.

1. Покрытие микроскопии пластической культуры палат

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги в стерильных условиях в ламинарном боксе. Два типа покрытия функционально эквивалентны.

1. Пальто пластической культуры камеры с фибронектина один день перед выделением тканей щитовидной железы:
   1. Разбавленные стерильные фибронектин к 50 мкг / мл конечной концентрации в среде M199 с добавлением 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 0,25 мкг / мл Fungizone и 2 мМ глутамина ^12.
   2. Покройте скважин с 200 мкл разбавленного фибронектина и инкубировать в течение ночи в 4 ° C холодильник.
   3. В день вскрытия, аспирации фибронектин, промыть лунки один раз M199 и добавить минимального объема 200 мкл M199, дополненной антибиотиками, глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
   4. Оставьте покрытых камеры в инкубаторе до готовности к пластине эксплантов.
2. Пальто пластической культуры камеры с типом коллагена 2 ч перед выделением тканей щитовидной железы:
   1. Разбавленные стерильные типа I коллагена в 50 мкг / мл конечной концентрации в 10 мМ HCl. ПРИМЕЧАНИЕ: Держите коллагена маточного раствора на льду.
   2. Накройте лунки 200 мкл разбавленного типа I коллагена и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре (RT).
   3. Аспирируйте тип раствора коллагена I, промыть лунки один раз M199 и добавить минимального объема 200 мкл M199, дополненной антибиотиками, глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
   4. Оставьте покрытых камеры в инкубаторе до готовности к пластине эксплантов.

2. Рассечение щитовидной железы Anlagen-содержащих тканей (E12.5) или щитовидной железы Лопасти (E13.5-e14.5)

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте чистые инструменты рассекает и Петри / Культура пластины. Основные этапы и разрезы, описанные ниже, являются одинаковыми для E12.5 и эмбрионов E14.5.

1. Жертвоприношение приуроченный беременных самок мышей в нужной эмбриональных (е) день (от E12.5 к E14.5) и удалить матку с помощью рассекает инструментов.
2. Поместите расчлененный матку в 10 см пластины, содержащей HBSS.
3. Держите один оконечность матки щипцами и открыть матку с маленькими ножницами по освобождению постепенно все эмбрионы.
4. Отдельные эмбрионов из плаценты с помощью ножниц и передачи эмбрионов с их внеэмбриональные мембран в новом 10 см пластины, содержащей HBSS.
5. Снимите желточный мешок и амнион. Примечание: С этой точки, работать под стереомикроскопа с просвечивания снизу; увеличение увеличение с шагом рассечение. Используйте вольфрама иглы в стеклянных капилляров как рассечения инструменты.
6. Использование иглы, какнож и вилка, снимите верхнюю часть головы, в том числе верхней челюсти и ушах (рис. 1А, разрезать вдоль).
7. Держите эмбриона на его спине и удалите первый дополнительный кусок нервной трубки (рис. 1А, разрезать вдоль б), то нижняя часть зародыша, просто под передних конечностей и выше сердца (рис. 1В).
8. Передача эмбриона кусочек, содержащий язык (ориентировать ткани) и шеи в новом 10 см пластины, содержащей HBSS.
9. Снимите нервной трубки и ткани кзади от пищевода / трахеи (рис. 1в, разрезанной вдоль).
10. Осторожно раздел ткани ломтик вдоль обеих сторон языка (рис. 1в, разрезанной вдоль В и В ').
11. Найдите пищевод и трахею, в продлении языком и отсечь язык, оставляя черпаловидный отек (рис. 1D, разрезать вдоль), и ткань на ботач стороны пищевода / трахеи (Рисунок 1D, разрезанной вдоль В и В ').
12. Снимите пищевод, и поместить в трахею с его вентральной стороной вверх.
13. Отсечь нежелательные ткани, такие как тимуса (рис. 1E) и всех тканей, расположенных сбоку от глотки арки артерий. Для E13.5 или эмбрионов E14.5, визуализировать долей щитовидной железы на каждой стороне трахеи (рис. 1F, красный пунктирными линиями) и далее анализировать лепестки из трахеи.
14. Перенести изолированный E12.5 трахея область или долей щитовидной железы E13.5-E14.5 в 35 мм планшет для культивирования, содержащей подогретого M199 среду, дополненную антибиотиков, глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Трансфер эксплантов использованием prewetted наконечник фильтра на Р-200 микропипетки. Для E12.5 эксплантов, сократить оконечность кончике расширить отверстие. ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно, и если эмбрионы имеют одинаковый генотип, выполните шаги 6 & 7 на всех эмбрионов,N 9-11, и, наконец, 12 и 13.

3. Покрытие и культура щитовидной железы эксплантов

1. Промыть эксплантов путем последовательного перевода в трех лунках 24-луночного планшета, содержащего 1 мл подогретого культуральной среде (= M199 с добавкой антибиотиков, глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки).
2. Покрытие из долей щитовидной железы на покрытых микроскопии пластиковых культуры камер:
   1. Аспирируйте M199 культуральной среды из камер покрытием.
   2. Осторожно, трансфер эксплантов щитовидной железы в культуре камер с помощью микропипетки и фильтров советы. Поместите один эксплантов в центре каждой камере.
   3. Удалите излишки среды и поместите культуры камеру, в инкубаторе для тканевых культур (37 ° C, 5% СО ₂₎ в течение 2 часов, чтобы экспланты приложить к матрице.
   4. Осторожно добавьте 200 до 300 мкл подогретого культуральной среды в каждую лунку.
   5. Выдержите в течение долгосрочного культуры в культуре ткани инкубаторе.
3. Покрытие ое область трахеи или щитовидной доли на semiporous фильтров:
   1. Заполните количество лунки 24-луночного планшета с требуемой 330 мкл подогретого культуральной среде.
   2. Место фильтры (например, 0,4 мкм Millipore фильтр) на носителе, заботясь, чтобы избежать захвата пузырьков воздуха ниже фильтра культуры.
   3. Осторожно, с помощью микропипетки и фильтров советы, трансфер эксплантов щитовидной железы с минимальным объемом среды на центр фильтров (максимальная 4/filter).
   4. Удалить избыток среды и пространства вне эксплантов с вольфрамовой иглы.
   5. Выдержите в течение долгосрочного культуры в культуре ткани инкубаторе. ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение культуральной среды через день под капотом ламинарного потока. Культура экспланты до 7 дней.

4. Целом монтажа Иммунофлуоресценции Протокол окрашивания для щитовидной железы эксплантов

Выбить эксплантов, выращенных на фильтрах (после шага 2 ниже), используя вольфрамовые иглы илитонкие щипцы и передачи в 24-луночный планшет для всех шагов, для первичного (этап 5) и вторичной (этап 7) антител инкубации (96-луночный планшет), за исключением. Для прикрепленных эксплантов, культивируемых на микроскопии пластиковых камер, выполнить все шаги в культуре камер.

1. Аспирируйте M199 культуральной среды и исправить эксплантов с ледяной 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин (500 мкл в 24-и блюдо и 300 мкл в микроскопии слайдов).
2. Промыть 2x 10 мин в Трис-буферного раствора с Тритон (TBST; 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100) при комнатной температуре.
3. Процесс эксплантов немедленно или хранить при -20 ° С Примечание: для длительного хранения при -20 ° С, обезвоживают эксплантов в метаноле с постепенным увеличением концентрации метанола в TBST, чтобы достичь 100% метанола. Когда все будет готово, чтобы продолжить иммуноокрашивания (шаг 4), увлажняет эксплантов путем постепенного добавления TBST в метанол.
4. Заменить TBST с блокирующим раствором (10% нормальной козьей сывороткой в ​​TBST) И инкубировать на море пильного рокера в течение 30-60 минут при комнатной температуре.
5. Развести первичного антитела в блокирующем растворе (100-200 мкл на состоянии). Перенесите "фильтр" эксплантов из 24-луночный планшет с 96-луночный планшет. Выдержите эксплантов с первичными антителами на море пильного рокера в течение ночи при 4 ° С.
6. На следующий день, отменить решение первичного антитела, передача "фильтр" эксплантов назад в 24-луночный планшет, и мыть по крайней мере, пять раз TBST на море пильного рокера в течение 45-60 мин каждого при комнатной температуре.
7. Развести вторичного антитела (например, антитела козы X-Alexa Fluor на 1:2000 разбавления) в TBST содержащей 1% нормальной козьей сывороткой и инкубировать эксплантов с этого разведения на ночь на море пильного рокер при 4 ° С и в темноте. Для ядерной контрастного, есть 1 мкг / мл бис-Benzimide (Hoechst) вместе с раствором вторичного антитела.
8. На следующий день, отменить решение вторичного антитела и мыть 5x с TBST на морском пилырокер в течение 45-60 мин каждого при комнатной температуре. Во время промывок, держать эксплантов в темноте.
9. Выполните дополнительный мыть в TBST мягко закрученной в течение ночи при 4 ° С в темноте.
10. Postfix в иммуноокрашиванию эксплантаты в 4% PFA при 4 ° С в течение 10 мин.
11. Вымойте 2x 10 мин с TBST.
12. Передача эксплантов либо постепенно в метаноле 100% для длительного хранения при -20 ° С или анализировать немедленно. Для эксплантатов культивируемых на фильтрах, и иммунологически окрашивали в 24-луночный планшет, передачи в камере микроскопии (например, LabTek или Ibidi) с TBST или лучше флуоресцентного монтажной среды перед анализом с многофотонной или конфокальной микроскопии.

5. Добыча РНК из щитовидной железы

Работа в РНКазы свободной среде. Таким образом, использовать нуклеиновых кислот и нуклеазам бесплатно наконечники и очистить как скамейки и оборудование от загрязнений и РНКаз. Этот протокол основываясь на фенол / хлороформ, выполните первый шагс (от 1 до 7), при химическом капюшоном.

1. Однородный один эксплантов щитовидной железы или две лопасти щитовидной железы с 300 мкл экстракционного раствора РНК с использованием одноразового пестиком в течение 1,5 мл пробирку. В между образцами, мыть пестик в 2% SDS, затем водой, затем этанолом.
2. Добавить еще 100 мкл экстракционного раствора РНК, вихрь 10 сек и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
3. Vortex в течение 30 сек и добавить 20 нг тРНК к каждому образцу.
4. Vortex в течение 1 мин и добавляют 80 мкл хлороформа.
5. Vortex энергично в течение 30 сек и инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
6. Спин течение 15 мин при 19000 х г в охлажденном (4 ° C) центрифуги.
7. Передача тщательно бесцветный верхнюю водную фазу в свежую пробирку, содержащую 20 мкг гликогена в качестве соосадителя.
8. Vortex и добавить 200 мкл 100% изопропанол алкоголя.
9. Vortex энергично в течение 15-30 сек, и пусть Осадок РНК при -20 ° С в течение 2-3 ч, или при -80 ° С в течение 1 часа.
10. Спин течение 30 мин при 19000XG при 4 ° С, и устранить супернатант.
11. Вымойте гранул с 450 мкл холодного 75% этанола и вихря выбить осадок.
12. Спин течение 10 мин при 19000 х г при 4 ° С, и устранить супернатант.
13. Сушат гранулы под капотом в течение 5 мин.
14. Ресуспендируют гранул с 10 мкл РНКазы свободной воды и инкубируют 10 мин при комнатной температуре.
15. Концентрация РНК Анализ, хранить при температуре -80 ° С или назад транскрибировать для анализа экспрессии генов.

Результаты

Закладок щитовидной железы (срединной линии и UB, вместе с окружающими тканями), а доли щитовидной железы расчленены из мышиных эмбрионов в E12.5 и e13.5/e14.5, соответственно (рис. 1). После одного дня в культуре на фильтре, по средней линии закладка видна (Фиг.2А) в виде удлиненной ткани, охватывающей на верхней части трахеи. Это постепенно образует две лопасти на каждой стороне трахеи. Если выделенные доли щитовидной железы (E13.5 или E14.5) культивируют, они будут расширяться, пройт...

Обсуждение

Эта статья описывает способ рассечения и культивирования эксплантов щитовидной железы (E12.5) или долей (E14.5) с целью изучения и лучше понять сложные события, приведшие к образованию щитовидной железы. Из-за двойного происхождения зачатков щитовидной железы (по средней линии закладки в и две боковые ultimobranchial органов), а их малый размер, фрагмент E12.5 ткани локализованной ростральнее к глоточной дуги артерий, и содержащей в трахею, но не пищевод является микродиссекции. Как показано, в течение четырех дней, эта...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
µ-слайд 8 лунок, ibiTreat, тканевая культура обработана, стерильный	проксиlab	80826
Коллаген типа I, крысиный хвост	Millipore	08-115
Фибронектин из плазмы человека	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Вольфрамовая проволока	Goodfellow	LS237450
вставка для культуральных планшетов (диаметр 12 мм)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadherin	BD Biosciences	610182	1/1,000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261