Статический Адгезия Анализ по изучению активации интегрина в Т-лимфоцитов

Summary

Статическое испытание адгезии является мощным инструментом, который может быть использован для моделирования взаимодействия между Т-лимфоцитов и других типов клеток. Взаимодействие генерируются путем инъекции меченых Т-клеток в лунках, покрытых молекул адгезии, в то время как планшет-ридера используется для количественной количество прилипших клеток после последовательных промывок.

Abstract

Т адгезии лимфоцитов требуется для множества функций Т-клеток, в том числе перехода на участках воспаления и формирования иммунологических синапсов с антиген представляющих клеток. Т-клетки достижения регулируемой адгезию, контролируя адгезионные свойства интегринов, класса молекул клеточной адгезии, состоящих из гетеродимерных пар трансмембранных белков, которые взаимодействуют с молекулами-мишенями на клетках-партнеров или внеклеточного матрикса. Наиболее ярким Т-клеток интегрину является функция лимфоцитов антиген (МАФ) -1, состоящий из субъединиц αL и β2, чья цель внутриклеточный молекулы адгезии (ICAM) -1. Способность Т-клетке контролировать адгезию происходит от способности регулировать аффинных состояния отдельных интегринов. Наизнанку сигнализации описывает процесс, при котором сигналы внутри клетки вызвать внешние домены интегринам предположить активированном состоянии. Большая часть наших знаний этих сложных явлений основана на механистическойисследования, проведенные в упрощенном в пробирке модельных системах. Т-лимфоцит адгезия анализа, описанного здесь является отличным инструментом, который позволяет Т-клетки придерживаться с молекулами-мишенями, в статических условиях, а затем использует флуоресцентный планшет-ридера для количественного адгезивностью. Этот анализ был полезен при определении стимулирующих адгезию или ингибирующее вещества, которые действуют на лимфоцитах, а также характеризующие сигнальных событий, связанных. Хотя изобретение описано здесь на LFA-1 - ICAM-1 адгезии, опосредованной; Этот анализ может быть легко приспособлены для обеспечения изучении других адгезивных взаимодействий (например, VLA-4 - фибронектина).

Introduction

Т адгезии лимфоцитов является фундаментальным процессом в иммунном ответе ^1. Он необходим для T взаимодействия клеток с эндотелиальные клетки украшать стенки капилляров, для сканирования антиген представляющих клеток (АРС) в лимфатические узлы, и для формирования иммунологических синапсов (IS) с клетками-мишенями ^2. Эти требования являются функционально и кинетически различны. Процесс лимфоцитов экстравазационным состоит из хемоаттракции, прокат, фирмы адгезии и переселения. Переход от подвижного фирме адгезии требуется Т-клеток реагировать на G-белком сигнала рецепторов быстро. Этот ответ дает интегрину взаимодействие лиганда, который замедляет и аресты качению ячейку ^3. Немедленное изменение интегринового жадностью посредником этот процесс. Миграция требует динамического взаимодействия betweenTcells и эндотелиальные клетки с образованием спаек в «переднем конце» и поломки спаек в "задней части"с интервалом около минуты между формирования и разрушения ^4. ЕСТЬ формирует inminutes, но должен оставаться нетронутым в течение нескольких часов ^6.

Интересно, что одна молекула адгезии, интегрин семья функция-член лимфоцитов антиген (МАФ) - 1, имеет важное значение для всех этих процессов ^5. LFA-1 опосредует адгезию через взаимодействие с несколькими членами надсемейства иммуноглобулинов. Наиболее широко изучены лиганд с наибольшим сродством к LFA-1 межклеточной адгезии (ICAM) -1. Неактивированного циркулирующие лимфоциты экспрессируют низкое сродство LFA-1 на поверхности клеток и, следовательно, не могут придерживаться ICAM-1 покрытием поверхности. LFA-1 сродство является переменной и регулируется несколькими сигнальных событий, таких как G активации белком рецептор цитокина, стимуляции и сигналов, опосредуемых Т-клеточных рецепторов (TCR). Полученную высокое сродство форма LFA-1 передает внутриклеточный активации во внеклеточное пространство твозь взаимодействия с ICAM-1. Этот путь называется наизнанку сигнализации ^7. Кроме того, передачи сигналов через LFA-1 из внеклеточного пространства называется снаружи внутрь сигнализации.

Внутриклеточный каскады, участвующих в наизнанку и за ее пределами в сигнализации сигнализации являются одним из основных направлений современных исследований. Небольшой ГТФ Rap1 недавно стала ключевой составляющей наизнанку понять, что является общим как для TCR перевязки и цитокина сигнализации ^8. Решающая роль Rap1 в активации интегринового выделен в связи с открытием, что избыточная экспрессия Rap1 стимулирует интегринзависимой адгезию Т-клеток, в то время как Т клеточной адгезии заблокирован выражения доминантной негативной Rap1 ^9. Эти достижения в нашем понимании интегринового регулирования Rap1 были совершены с использованием в инструментах пробирке. Среди них статический адгезия анализа, описанного здесь.

Общая цель этого метода состоит в изучении Tклеток адгезия к ICAM-1 поверхностей, покрытых. Более конкретно, оно используется для объективно оценивать количественно и LFA-1 сродство к его счетчик лигандов в живых клетках в реальном времени, при разных условиях. Этот метод использует полистирола лунки, покрытые ICAM-1, чтобы имитировать клеточные поверхности, что Т-клетки взаимодействуют с. Многие описанные ранее адгезии статическая Т-клеток анализы были экспериментально комплекс. Эти анализы часто требуется для Т-клеток, которые будут радиоактивно метили, используемые культивируемые клетки роговицы крупного рогатого скота, чтобы создать внеклеточный матрикс в качестве субстрата для T клеточной адгезии, или называют для не-физиологической стимуляции Т-клеток в течение длительного срока, чтобы способствовать T клеточную адгезию ^10. Использование флуорометрического измерения для количественной оценки Т-клеток после инкубации адгезии является более чувствительным и точным методом количественного по сравнению с проточной цитометрии и микроскопии, как используются во многих других системах анализа ^11. Кроме того, один Микроскоп клетокИК анализ локализации интегрина не допускает широкий, населения на основе анализа так же, как флуорометрического измерения. Хотя активации специфичные для состояния LFA-1 антитела являются коммерчески доступными, эти антитела предложить низкую чувствительность по отношению к способу, описанному здесь. Основное преимущество над альтернативными методами является его простота и способность исследовать различные экспериментальные условия одновременно. При рассмотрении этого метода для конкретного приложения, следует принять во внимание, что Т-клетки должны быть негативно выбран, свежевыделенные, и помечены с флуоресцентным маркером.

Protocol

1. Покрытие стрипы

Примечание: Цель этого шага заключается в пальто поверхности полистирола с ICAM-1 в качестве лигандов для Т-клеток LFA-1.

1. Подготовьте следующие решения:
   1. Готовят раствор для покрытия путем ресуспендирования рекомбинантный ICAM-1 забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na ₂ HPO _4, 2 мМ KH ₂ PO _4, рН 7,4), обогащенной кальцием (1 мМ CaCl ₂₎ и магний (2 нМ MgCl _2). Убедитесь, что конечная концентрация ICAM-1 10 мкг / мл, изготовленные из 0,7 мг / мл маточного раствора и выдерживают в -80 ° C морозильник.
   2. Готовят раствор адгезии путем обогащения PBS с 0,5% человека (или бычий сывороточный альбумин) (HSA / BSA), 2 мМ MgCl _{2 и} 1 мМ CaCl _2.
   3. Подготовка промывочного раствора добавлением 2 _мМ MgCl2 и 1 мМ CaCl ₂ в PBS. Довести все решения до 37° С перед использованием.
2. Промыть 24 скважин с 50 мкл промывочного раствора. Это будет включать немытые скважин, положительные (PMA обработали клетки), и отрицательные (без покрытия скважин) управляет. Для каждого условие, установленное по крайней мере, три скважины (трех экземплярах).
3. Добавить 50 мкл раствора для покрытия в каждую лунку. Не добавить в непокрытых скважин управления. Инкубируют в течение одного часа внутри 37 ° С инкубатор.
4. Аспирируйте раствор для покрытия мягко, не допуская кончик трогать дно лунок. Промывают один раз 50 мкл промывочного раствора.
5. Добавить 50 мкл адгезии раствора и инкубировать планшет в течение одного часа в 37 ° С инкубатор.
6. Аспирируйте мягко и мыть один раз 50 решения мкл мыть. Используйте пластины в тот же день, однако можно держать его при 4 ° С в течение ночи, и использовать его на следующий день.

2. Т Выделение клеток из крови

1. Добавить человеческого T коктейль обогащению клеток при 50 мкл / мл Oе цельной крови (например, для 3 мл антикоагулянта (гепарина, ЭДТА, или цитрат) цельная кровь, добавить 150 мкл коктейля). Все хорошо перемешать.
2. Инкубировать 20 мин при комнатной температуре.
3. К 50 мл центрифужную пробирку добавляют 3 мл обработанной крови и равный объем PBS (без кальция и магния), обогащенной 1% D-глюкозы при комнатной температуре. Осторожно перемешать с помощью пипетки Пастера.
4. Добавьте 15 мл Ficoll-Paque PLUS в центрифужную пробирку.
5. Осторожно слой на 6 мл разбавленного образца крови на изоляции лимфоцитов среды.
6. Центрифуга при 400 мкг в течение 20 мин при 20 ° C с обламываются.
7. Откачать верхний слой с помощью чистой пипетки Пастера, оставляя слой лимфоцитов в покое на границе раздела. Верхний слой плазмы могут быть сохранены для последующего использования. С помощью чистой пипетки Пастера перенести лимфоцитов слой на чистую центрифужную пробирку.
8. Добавить 3 томов (9 мл) PBS в лимфоцитах. Приостановить клетки, осторожно дракрыло их в и из пипетки Пастера.
9. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин при 20 ° C.
10. Удалить супернатант. Лимфоциты должны теперь быть приостановлено в среде, подходящей к применению. Передача клеток в культуральной колбы T-75 в 20 мл RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина.

3. Подготовка клеток

Примечание: Необходимым условием для клетки должны быть помечен флуоресцентным реагентом. В этом протоколе использовать карбоксильную флуоресцеина сукцинимидилового эфира (CFSE), однако зеленый флуоресцентный белок (GFP), выражающие клетки приемлемой альтернативой.

1. Всего 2,4 х 10 ⁶ Т-клетки (1 х 10 ⁵ для каждой скважины) с помощью гемоцитометра.
2. Ресуспендируют клеток в культуральной среде не хватает сыворотки (сывороточного голодания). Инкубируйте клетки в течение 2 часов в 37 ° С инкубатор.
3. Центрифуга клетки в течение 5 мин (400 мкг). Аспирируйте СМИ иресуспендируют в 1 мл PBS.
4. Добавить CFSE в разведении 1:1000 (фондовом сделал до 5 мм). Крышка от света и инкубировали в течение 8 минут при комнатной температуре.
5. Остановить реакцию, добавив 10 мл 37 ° C PBS и спина при 400 мкг в течение 5 мин.
6. Повторное приостановить осадок клеток с 1,2 мл подогретого раствора сцепления (1 х 10 ⁵ клеток на 50 мкл).

4. Стимуляции клеток

Примечание: Для того чтобы инициировать адгезию клетки должны быть стимулированы. В следующем эксперименте клетки стимулировали с помощью TCR с использованием анти-CD3 антитела сшивания, однако растворимый SDF-1 может служить в качестве альтернативы. В зависимости от цели эксперимента, различные фармакологические реагенты могут быть добавлены до или во время стимуляции для изучения влияния на клеточной адгезии. Форболмиристатацетата (РМА) является форболовым эфиром, который структурно похожи на второй мессенджер диацилглицерин (DAG) и, следовательно, активирует киназу несколькоы вниз TCR (в основном протеинкиназы С); здесь он используется в качестве положительного контроля.

1. Теплый планшет до 37 ° C.
2. Разделить клеток в 8 мл 1,5 пустых трубок (150 мкл в каждую пробирку), одну трубку для каждого состояния.
3. Лечить клетки соответственно:
   1. Стимулирование одну трубку с PMA в 10 нг / мл в качестве положительного контроля. Держите три пробирки лечить, чтобы служить в качестве контроля для стимуляции ("нет стимуляции"), немытые управления нагрузка ("нет мыть"), и управления для ICAM-1 покрытием ("без покрытия").
   2. Стимулирование четыре трубки с различными концентрациями анти-CD3 антителами (0,1, 1, 5 и 10 мкг / мл). Продолжить на следующей стадии без задержек.
4. Алиготе 50 мкл вынужденного смеси клеток в каждый пустой хорошо. Окончательное число клеток на лунку 1 х 10 ^5.
5. Поместите планшет в 37 ° C инкубаторе в течение 15 мин.
   Примечание: Некоторые клеточные линии T требуют короткий стимуляции время релаксации. В течение этого времени клетки будут осесть на дно лунки и придерживаться целевых лигандов.

5. Стиральная гостях Неприлипающие Клетки

Примечание: цель этого шага для удаления клеток, которые были не способны образовывать тесные контакты с лиганда покрытием поверхностей. С помощью многоканальной пипетки этого шага для того, чтобы гарантировать, что те же физические силы будут применены ко всем лунок. Важно, чтобы сохранить указанные контрольные лунки неумыто, чтобы помочь в расчете процент адгезивных клеток.

1. Добавить 150 мкл теплой адгезии раствора в каждую скважин. Встряхнуть тарелку мягко в течение нескольких секунд, прежде чем снимать среду из лунок. Не прикасайтесь к нижней части лунки с подсказками.
2. Повторите этот шаг три раза. Изменить направление пипетки, когда пипетки буфер в и.

6. Определение Процент прилипшие клетки

_content "> Примечание: На этом этапе флуоресцентный планшет-ридере используется для измерения интенсивности флуоресценции в каждой лунке Интенсивность находится в прямой корреляции с числом прилипающих клеток..

1. Включите ридере. Откройте программное обеспечение для считывания планшетов, нажав на пиктограмму на рабочем столе.
   1. В меню "Задача" нажать "Новый", чтобы создать новый протокол.
   2. В меню "Действия" выберите опцию "Read". Нажмите кнопку "интенсивность флуоресценции" и нажмите "ОК" на вкладке.
   3. Из выпадающего меню выберите "Длина волны возбуждения 485" и "длина волны излучения 528". Хит "Ok" на вкладке.
   4. В "Оптик" меню параметров выберите "Нижний" и нажмите на вкладку "Ok". Вернитесь в меню «Действия» и установить температуру до 37 ° С и нажмите "ОК".
   5. Вставьте планшет в ридере инажмите кнопку "Выполнить". Результат будет экспортировать в таблицу Excel.
2. Вычислить процент адгезивных клеток, используя следующую формулу: процент от адгезивных клеток = (средний интенсивность флуоресценции читать в промытых скважин) / (среднее интенсивность флуоресценции читать в неумытых клеток) × 100%.

Results

Ниже приведен пример адгезии методом с использованием первичных Т-клетки стимулировали различными концентрациями анти-CD3 антител. Это полезно знать флуоресценцию немытых клеток (т.е. общая нагрузка). Нестимулированные клетки служат в качестве отрицательного контроля и PMA обработанные клетки положительный контроль за анти-CD3 антител. Клетки высевали в непокрытых скважин служить в качестве контроля для ICAM-1. В типичном эксперименте процент адгезивных клеток, обработанных РМА между 40% до 50%, а доля стимулир...

Discussion

Есть несколько анализов для изучения сигналы LFA-1 и Т активации клеточной адгезии ^12. Проточная цитометрия используется для измерения LFA-1 сродством состояния в живых клеток с использованием моноклональных антител, которые связываются избирательно либо согнут или расширенный LFA-1. Одним из ограничений этого метода является то, что он не принимает во внимание алчность Интегрины. Миграционные анализы являются полезными инструментами, но они измеряют миграции, а не жалкие адгезии в определенной точке времени....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Планшетный ридер	BioTek	Synergy H1 Hybrid
Multichannel Pipet		Fisher 21-377-829
96-луночный микропланшет с оптическим дном	Corning Costar	3603
Рекомбинантный ICAM-1	R& D Systems	ADP4-050
Антитела к CD3	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	Молекулярные зонды	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS, содержащие кальций и магний	Gibco
Периферические лимфоциты	например мыши или человека
Хлорид магния	Sigma-Aldrich	M8266
Хлорид кальция	Sigma-Aldrich	499609
программное обеспечение Open Gen 5	BioTek	Version 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
Центрифужные пробирки 15 и 50 мл	Fisher	352099, 352070
Одноразовые пластиковые пипетки Пастера	Fisher	13-711-7M
Колбы для культур T-75	Fisher	50-754-1366
RosetteSep Набор для энрикации Т-клеток	StemCell Technologies	15061