Методическая статья

Глютамин поток изображений, используя Генетически кодируемые сенсоры

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51657

⸱

31 июля 2014 г.

 , 
1Virginia Tech

В этой статье

Краткое содержание

Эта статья покажет, как контролировать динамику глютамина в живых клетках с помощью волнуйтесь. Генетически кодируемые сенсоры позволяют мониторинг в реальном времени биологических молекул на субклеточном резолюции. Экспериментальное проектирование, технические детали экспериментальных установок, и соображения для пост-экспериментального анализа будут обсуждаться на генетически кодируемых сенсоров глютамина.

Аннотация

Генетически кодируемые сенсоры позволяют мониторинг в реальном времени биологических молекул на субклеточном резолюции. Огромное разнообразие таких датчиков для биологических молекул стали доступны в последние 15 лет, некоторые из которых стали незаменимыми инструментами, которые обычно используются во многих лабораториях.

Один из интересных приложений генетически кодируемых датчиков является использование этих датчиков при исследовании процессов клеточного транспорта. Свойства перевозчиков, таких как кинетики и подложки специфики могут быть исследованы на клеточном уровне, обеспечивая возможности для камерного типа конкретных анализов транспортной деятельности. В этой статье мы покажем, как динамика транспортера можно наблюдать с помощью генетически закодированного датчик глютамина в качестве примера. Экспериментальное проектирование, технические детали экспериментальных установок, и соображения для пост-экспериментального анализа будут обсуждаться.

Введение

Из-за значительного прогресса в области технологий, что позволяет экспертизу транскриптома и протеома на клеточном уровне, то сейчас она стала ясно, что биохимия и результирующий поток метаболитов и ионов весьма сотового типа конкретных. Например, в печени млекопитающих, последовательный деградация глутамина и синтез проводят одновременно по перипортальных клеток и клеток перивенозной соответственно, подача аммоний в цикле мочевины в первом типе клеток, потребляя избытка аммиака в последнем 1-3. В некоторых случаях, значительная биохимическая гетерогенность обнаруживается даже в одном "типа клеток" 4, 5. В дополнение к такому пространственной специфичности, клеточные уровни метаболитов и ионов высокой динамичностью (например, сигнальных молекул, таких как Са 2 + и циклических нуклеотидов). Пространственно-временные закономерности метаболитов и ионов часто играют важную роль в передаче сигнала. Ммониторинг функционирования клеточных динамику метаболитов и ионов, однако, представляют уникальную проблему. Во многих случаях изменение концентрации быстрый и временный, примером которого случае сигнальных молекул, таких как Ca 2 +, который распадается в течение ~ 20 мс в дендритных шипов 6. Кроме того, компартментализация биохимических путей в рамках и среди клеток затрудняет количественную динамику метаболитов и ионов с использованием экстракции и хроматографии на колонке / методы масс-спектрометрии.

Генетически кодируемые сенсоры для биологических молекул в настоящее время широко используется в связи с высокой пространственно-временной резолюции, которая позволяет экспериментатор изучать короткоживущие и / или обособленных молекулярной динамики (обзор в 7, 8). Эти генетически закодированные датчики можно условно разделить на две категории; датчики интенсивности основе и ratiometic датчики. Датчики интенсивности на основе, как правило, состоят из связывающего домена и гриппаorescent белок (FPS), и растворенное вещество связывания с связывающего домена изменяет интенсивность флуоресценции. Ratiometic датчики, с другой стороны, часто пользуются Фостер резонансный перенос энергии (FRET) между двумя ФП, которые функционируют как пара волнуйтесь. Эти датчики состоят из связывающего домена и двух ФП, и растворенное вещество связывания вызывает изменение эффективности FRET между двумя ФП. Большое количество датчиков для биологически важных метаболитов и ионов были разработаны в последнее десятилетие 8, 9.

Один из захватывающих возможности, предлагаемые таких генетически кодируемых сенсоров является их использование в анализе с высоким разрешением процессов мембранного транспорта, который ранее не был легко обнаружить на клеточном уровне. Генетически кодируемые сенсоры облегчить анализ транспортных механизмов, таких как субстратной специфичности и рН зависимости 10, 11. Кроме того, в сочетании с генетическими разрешенииources таких как библиотека РНК-интерференции конструкции для модельных организмов, в настоящее время можно проводить обыски генома для новых транспортных процессов с использованием генетически закодированные датчиков. Действительно, использование генетически закодированного датчика приводят к открытию ранее неохарактеризованных перевозчиков в нескольких случаях 12, 13.

В последнее время наша лаборатория разработала серию FRET основе датчика для глутамина. Мы показали, что уровни глютамина сотовой могут быть визуализированы с помощью таких FRET глютамина датчики 10. Эти датчики состоят из FRET донора (mTFP1), вставленной в бактериальную обязательного глютамин белка glnH, и FRET акцептора (Венера) на С-концах glnH (рис. 1). FRET эффективность этих датчиков уменьшить при связывании глутамина, в результате уменьшения отношения интенсивностей акцептор / доноров. Изысканные регулирование глютамин транспортных процессов играет важную роль в биологических процессах, таких как neurotransmission 14, 15 и содержание цикла мочевины в печени 1, 16, 17.

Здесь мы показываем, методологию анализа транспортной деятельности с FRET датчиков для глутамина, используя широким полем флуоресцентного микроскопа настройки. Цель экспериментов, представленных здесь, чтобы обнаружить транспортера деятельность в одной ячейке и изучить субстрата специфику временно выраженной транспортера.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка образца

Примечание: Во многих случаях перфузии эксперименты смыть значительную часть клеток, которая может стать разочарование вопрос. Хотя не обязательно для всех клеточных линий, крышка покрытие стеклянных поверхностей с поли-L-лизин (добавить 1,0 ml/25 см 2 0,01% раствора на поверхность, инкубировать> 5 мин, мыть дважды класса культуры клеток водой и сушат в биобезопасности кабинет) повышает адгезию клеток. Кроме того, быть в курсе уровня безопасности (BSL) клеточной линии, используемой, и следовать стандартной операционной процедурой, утвержденной местной экологической офисе здоровья и безопасности. В этом эксперименте клетки COS7 были использованы из-за низкой эндогенного глутамина транспортной деятельности (см. рисунок 4).

  1. Семя клетки COS7 при ~ 70-80% слияния в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) + 10% космического телячьей сывороткой и 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, или на стерильных 25 мм покровные стекла, помещенных в культуре 6-луночныйблюдо или стеклянным дном горки 8-а. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2, 100% влажности в течение 24 часов.
  2. Замените питательную среду для DMEM + 10% космических сыворотки теленка (не антибиотики), в соответствии с протоколом производителя. Расти O / N при 37 ° С, 5% СО 2 при 100% влажности.
  3. Добавить 0,4 мг каждая из плазмидной ДНК, кодирующие датчик глутамин (pcDNA3.1, несущий датчик FLIPQTV3.0 под промотора цитомегаловируса 10) и mCherry-меченого ASCT2 от 10 до 50 мл бессывороточной среде (OPTI-MEM) и осторожно перемешать.
  4. Добавить 1 мл реагента для трансфекции в 50 мл бессывороточной средой. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
  5. Смешайте два решения, содержащие ДНК (шаг 1.3) и реагента для трансфекции (шаг 1.4) и инкубировать в течение 20 мин.
  6. Аккуратно добавить реагента для трансфекции в верхней части клеток и аккуратно перемешать покачиванием камеру. Выдержите в течение 24 часов при температуре 37 ° C, 5% CO 2, 100% влажности.
  7. После 24 часов, обменять среды в DMEM + 10% Космического телячьей сывороткой(CCS) + 100 единица пенициллина / стрептомицина.
  8. Клетки изображаются 48-72 ч после трансфекции.

2. Перфузии Эксперимент

Примечание: COS-7 клетки, используемые в данном эксперименте, средства массовой информации и перфузии камера хранились при комнатной температуре и окружающей среды концентрация СО 2. Тем не менее, если клетки используются требуют более высокой температуры и CO 2 контроль концентрации для выживания, подогреваемый столик микроскопа и / или окружающей среды камеру следует использовать.

  1. Подготовка перфузии буфера AF (См. перечень материалов). Прикрепите запорные краны до 50 мл шприцев, закрыть запорные краны затем заполнить их с перфузионные растворы. Откройте кран для краткого периода, чтобы заполнить свободное пространство в кран с буфером.
  2. Включите 8-канальный, гравитация-системы подачи перфузии с перфузии карандашом, а затем выберите "Ручной режим" в разделе Выбор опции Function. Поместите контейнер для отходов под перфузии карандашом.
  3. Вручнуюактивировать порты, нажав соответствующие номера и заполнить шланги с использованием 10 мл шприц, содержащий воду, а затем закрыть порт. После того, как порты заполнены водой, установить шприцы, содержащие буферные AF на порту 1-6 из системы перфузии, а затем открыть запорные краны. Открыть порты снова, чтобы заменить воду в трубке с буферов. Скорость потока должна быть около 0,8 мл / мин.
  4. Пресс отменить, как только на контроллере перфузии, чтобы вернуться в меню "Выбор функции". Перейдите к опции "Редактировать программы", затем введите в протокол перфузии указаны в таблице 1. Сохраните программу перфузии.
  5. Возьмем клетки из инкубатора. Мыть два раза с буфером перфузии, а затем установить клетки на сцене. Подключите систему перфузии в камеру. При использовании открытой камерой, создали еще один насос, который удаляет перфузии раствора из камеры.
  6. Откройте программное обеспечение Slidebook. Начните новый слайд.
    Примечание:Следующая процедура является специфическим для программного обеспечения Slidebook, но и другие программы, такие как MetaFluor и Ниш-элемент также может быть использован для типа изображений, описанной здесь. Теоретически эксперименты могут быть выполнены с помощью любого программного обеспечения, позволяющего изображений время блюд, и последовательности изображений могут быть проанализированы после экспериментально с помощью программного обеспечения, таких как ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) или Фиджи (http:/ / fiji.sc / Фиджи). Тем не менее, программное обеспечение, которое позволяет отслеживать в режиме реального времени отношение акцептор / доноров является весьма полезным.
  7. Монтаж салазок на сцену флуоресцентного микроскопа. Найти клетки коэкспрессирующей датчик и АТСК-mCherry с помощью соответствующих наборов фильтров (см. перечень материалов) под функции "Фокус". Отрегулируйте усиление, нажав вкладку "Камера" и сдвинув ползунок под "усилением". Кроме того, регулировать плотность установки нейтрального фильтра из фильтра плотность выпадающего меню нейтральной. Примечание: Если куб фильтр не включает в себя фильтр глаз, не использовать глазные штук с момента шорт-волны возбуждающего света вреден для глаз. Используйте экран компьютера, чтобы найти ячейки вместо этого.
  8. Получение изображений клеток with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Фильтры, указанные в Перечне материалов). Нажмите кнопку "изображения", а затем в окне приобретения, указать фильтры, которые собираются использовать. Нажмите кнопку «TEST» для регулировки времени экспозиции, набрав нужное время экспозиции в поле рядом с настройками фильтров. Примечание: Все три канала должны быть выставлены на той же длины. При настройке параметров визуализации, принять ожидаемое изменение эффективности рвать и кратное увеличение во внимание: например, если эффективность FRET, как ожидается, подняться в 2 раза во время эксперимента, параметры визуализации должна быть скорректированатак что интенсивность донора экс акцепторной EM в состоянии покоя должна быть <50% максимального значения, которые могут быть записаны на приборе, так что канал не станет насыщенным ходе эксперимента. Сигнал от меченых клеток должно быть по крайней мере в три раза выше, чем в фоновой области.
  9. Нарисуйте область интереса с использованием регионы инструмент в программном обеспечении. Кроме того, функция программного обеспечения для выбора пикселей выше определенной интенсивности может быть использован, а затем преобразуется в регионах. Чтобы сделать это, нажмите Mask - сегмент, затем переместите ползунок, чтобы выделить нужные области.
  10. Выберите "промежуток времени" в поле типа захвата, затем укажите интервал (10 сек в этом эксперименте) и моменты времени для эксперимента.
  11. Нарисуйте область в районе без каких-либо флуоресцирующих клеток. Эта область используется для вычитания фона. Щелкните правой кнопкой мыши область обращается, а затем установить его в качестве фона. Примечание: В идеале, клетки, которые нет выразить датчики должны использоваться в качестве фоновой области, чтобы учитывать как флуоресценции и фоновой цветения, обнаруженного камерой. Если такие клетки не доступны в поле зрения, по меньшей мере, область без клеток следует использовать для учета фоновой флуоресценции.
  12. Выберите нужную программу в разделе "Select Function - Запуск программы" вариант. Перейдите к сохраненной программы (см. шаг 2.3), а затем ударил ENTER на контроллере перфузии. Теперь программа загружается, и поразить любую клавишу начнет перфузии.
  13. Убедитесь, перфузии и эксперимент изображений начать в то же время, нажав кнопку "Пуск" в окне захвата, в то же время, как нажатие клавиш на контроллере перфузии.
    Примечание: Рекомендуется записать временной точке, где были обменены решения (это можно сделать с помощью "Записки" функции, найденные на вкладке приобретения).
  14. Выполните те же протокола USI перфузиинг клеток, экспрессирующих датчик, который, как ожидается, быть либо насыщенным, либо несвязанный в экспериментальных услови х.
    Примечание: Здесь FLIPQTV3.0_1.5μ, который насыщен в экспериментальных услови х, используется в качестве контроля, фиг.6 Такие контрольные эксперименты необходимы, чтобы подтвердить, что изменение эффективности FRET связано с фактическим изменением в подложке, а не. в связи с изменением других параметров, таких как сотовые рН.

3. Анализ после эксперимента

  1. Изучите, если образец дрейф произошла во время эксперимента. Нарисуйте регионах, представляющих интерес (ROI) с на изображении, полученном при временной точке 0, затем переместите ползунок в верхней части окна изображения и проверить, если клетки выпадают из трансформирования на снимках, сделанных позже в эксперименте.
  2. Если да, то используйте функцию отслеживания для коррекции дрейфа, сначала, создания масок вокруг клеток, выбрав Mask - сегмент, затем сдвиньте строку, задающую обрезание, теплицаhlight регионы, содержащая элементы. Ниже в хронологическом порядке регионы, нажав Mask - отслеживание частиц - отслеживание Basic частиц.
  3. Перерисовать трансформирования и фон регион в случае необходимости.
  4. Экспорт среднее интенсивность трансформирования в течение эксперимента. Нажмите Статистика - Экспорт - Данные побед / Timelapse.
  5. Когда эффективность FRET и количественное определение концентрации субстрата не надо, построить временной ход соотношения интенсивностей (Донор экс Acceptor эм, / Донор экс Донор EM) в качестве прокси динамики подложки. Для определения цитозольную концентрацию, рассчитать максимальные и минимальные изменения отношения (т. е. при насыщающего и отсутствие подложки, соответственно), Δr макс - Δr мин, по нелинейной регрессии Δratio (Δr) со следующим уравнением:
    Δr = [S] / (K D + [S]) х (Δr макс - Δr мин) + Δr мин
    где [S] является концентрация субстрата в цитозоле. Используя Δr макс - значения Δr мин, полученные, насыщенность (S) датчика в данный Δr рассчитывается как
    S = (Δr - Δr мин) / (Δr макс - Δr мин)
    S далее могут быть преобразованы в концентрации субстрата [S], используя следующее уравнение:
    S = [S] / (К д + [S])
    Примечание: интенсивность Acceptor экс Acceptor эм канала должна быть также нанесена изучить влияние ли экспериментальная условие флуоресценцию акцептора непосредственно.
  6. Когда базовый дрейф из-за фото-отбеливание наблюдается, выполнить базовую коррекцию. Чтобы сделать это, построить интенсивности донора и акцептора с течением времени (рис. 5, а). Тогда определить временные точки, используемые для гое базовый, в соответствии с задержкой в системе перфузии и транспортной активности конкретного клетки (фигура 5В).
  7. Рассчитать полиноминальными фитинг, что лучше всего описывает базовую линию. Тогда, нормализуют сырой интенсивность от каждой временной точке с базовым (рис. 5C). Рассчитать отношение интенсивности (Донор экс Acceptor ет, / Донор экс Донор EM) от нормированных донора и акцептора интенсивности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Типичные эксперименты времени курс представлены на рисунке 2. В этих экспериментах, FRET глютамина датчики с сродства 8 (2B FLIPQTV3.0_8m, рисунок 2А и В) мм и 100 мкМ (FlipQTV3.0_100 μ С и D) были коэкспрессии с обязательно теплообменник аминокислота ASCT2 18 в клетках COS7 10. Приток глутамина обнаруживается как изменение соотношения интенсивности флуоресценции между донором (mTFP1) и акцептора (Венера) (рис. 2А и 2С).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Успех экспериментов изображений зависит от нескольких важных факторов. Одним из таких факторов является сродство датчиков используются, как описано выше. Абсолютная концентрация субстрата в субклеточном компартменте интерес, однако, часто неизвестно. Поэтому мы рекомендуем попробовать несколько датчиков с шахматном сродства, чтобы найти тот, который работает лучше под нужный экспериментальных условиях. Например, в нашем случае трансфицировали в COS-7 клетки с помощью датчиков глутамина с 1.5μ, 100μ, 2м, и 8м (фи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Там нет ничего, чтобы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH грант 1R21NS064412, NSF гранта 1052048 и Джеффресс Мемориал Целевой грант J-908.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инвертированный флуоресцентный микроскопOlympusIX81F-3-5Также будет уместен аналогичный инвертированный флуоресцентный микроскоп других поставщиков.
Фильтр возбуждения (mTFP1)Omega Optical3RD450-460Ширина полосы 450-460 нм
Фильтр возбуждения (Venus)ChromaET500/20Ширина полосы 490-510 нм
Эмиссионный фильтр (mTFP1)ChromaHQ495/30mШирина полосы 475-505 нм
Эмиссионный фильтр (Venus)ChromaET535/30mШирина полосы 520-550 нм
Дихроичное зеркало (каналы FRET)Chroma470dcxrДлинный проход, 470 нм отсечь
Дихроичное зеркало (канал YFP)Chroma89002bsПроходы 445-490 нм, 510-560 нм, 590-680 нмНабор
фильтров CherryChroma49008Возбуждение 540-580 нм, длиннопроходный дихроичный с отсечкой 585 нм, фильтр излучения 595-695 нм
Источник светаOlympusU-LH100L-3-5Светодиодные или галогенные источники света, дающие стабильную интенсивность света, ртутные лампы не рекомендуются,
ПЗС-камераQaging, Rolera-MGi, EMCCD,
апохроматический флуоресцентный объектив
, ValveBank II,AutoMate, Scientific[01-08]Другие перфузионные системы, обеспечивающие быстрый обмен раствора, также будут работать
ламинарные камерыС&; L InstrumentsVC-MPC-TWДругие камеры с личинарным потоком также подойдут.
Камерный слайдLab-Tek154534Для экспериментов с открытой камерой
Перфузионный насосThermo Scientific74-046-12131Для экспериментов с открытой камерой
Программное обеспечение с поддержкой ратиометрических измеренийIntellegenent Imaging InnovationSlidebook 5.5
Ламинарный проточный шкаф биобезопасностиESCOLA-3A2
Isotemp CO2 IncubatorThermo Scientific13-255-25
Dulbecco's MEM (DMEM)ГиклонSH30243.01
Космическая телячья сывороткаГиклонSH3008703
пенициллин/стрептомицинГиклонSV30010
бессывороточная среда для трансфекции (OPTI-MEM I)Invitrogen31985Используется с липофектамином 2000
Раствор поли-L-лизинаSigmaP4707
25 мм круглая стеклянная крышкаThermo Scientific12-545-102В случае использования VC-MPC-TW
Lipofectamine 2000Invitrogen11668027Также можно использовать другие реагенты для трансфекции.
Раствор А (буфер Хэнка)9,7 г соли HANK (Sigma H1387), 0,35 г NaHCO3, 5,96 г HEPES на 1 л, pH скорректирован до 7,35 с раствором NaOH
B Раствор A+ 0,04 мМ Gln
Раствор C+ 0,2 мМ Gln
Раствор D+ 1 мМ
Gln Раствор EРаствор A + 5 мМ Gln
Раствор FРаствор А + 5 мМ Аля
, , перфузионная система Olympus Раствор A Раствор A

Ссылки

  1. Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
  2. Haussinger, D. Hepatic glutamine metabolism. Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).
  3. Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. Hepatic glutamine metabolism. Nutrition. 18, 301-303 (2002).
  4. Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
  5. Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31(2013).
  6. Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
  7. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
  8. Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
  9. Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
  10. Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591(2012).
  11. Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
  12. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  13. Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
  14. Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
  15. Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
  16. Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
  17. Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
  18. Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
  19. Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
  20. Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
  21. San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712(2013).
  22. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
  23. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
  24. Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114(2011).
  25. Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
  26. Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FRET

Похожие статьи