Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

23.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51663

⸱

28 мая 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, Institute of Clinical Pathology and Medical Research, Westmead Hospital, 2Centre for Research Excellence in Critical Infection, Westmead Millennium Institute, Westmead Hospital, 3Sydney Emerging Infectious Diseases Institute, University of Sydney, Westmead Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Применение матрицы-лазерной десорбцией / время ионизации полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии (MS) непосредственно к культуре крови бульона ускоряет идентификацию бактерий. Представленный метод является быстрым и надежным методом идентификации грамотрицательных бактерий непосредственно из культуры крови бульоне.

Аннотация

Важную роль в клинической лаборатории микробиологии является обеспечение быстрой идентификации бактерий, вызывающих инфекции кровотока. Традиционный идентификация требует суб-культуру сигнальное культуры крови бульоне с идентификации доступных только после колоний на твердой агар созрели. MALDI-TOF MS является надежным, быстрый способ идентификации большинства клинически значимых бактерий при нанесении на колоний на твердых средах. Применение MALDI-TOF MS непосредственно к культуре крови бульона является привлекательным подход, поскольку он имеет потенциал для ускорения идентификации видов бактерий и улучшить клиническое управление. Тем не менее, важной проблемой для преодоления является удаление предварительно анализ интерферирующих смол, белков и гемоглобина, содержащихся в культуре образцов крови, которые, если их не удалить, мешают MS спектров и может привести к недостаточному или низкими оценками идентификации дискриминации. Кроме того, необходимо сосредоточиться BacterИ.А. развивать спектры достаточно высокого качества. Представленный метод описывает концентрацию, очищение, и извлечение грамотрицательных бактерий, позволяющих раннего выявления бактерий из сигнальном культуры крови бульоне.

Введение

Пациенты с инфекции кровотока (BSI) из-за бактерий по-прежнему имеют высокую смертность в стационаре, начиная от 6-48% 1. Доставка соответствующего эмпирического антибиотика способствует выживанию и в подгруппе пациентов с тяжелым сепсисом, каждый час задержки в соответствующей терапии коррелирует со снижением выживаемости 2,3. Соответственно, одной из ключевых задач клинической лаборатории является быстрое обнаружения, идентификации и общайтесь присутствие бактерий в культурах крови сообщить клинические решения. Было показано, что микробиологическая лаборатория имеет наибольшее влияние на антимикробной терапии на момент отчетности Граму 4 и недавно, обсервационное исследование показало, что время матрица-активированная лазерная десорбция / ионизация массового полета спектрометрии (MALDI-TOF MS) выполняется непосредственно на культуры крови бульонов влиять назначения в более чем одной трети BSI, вызванного грамотрицательных бактерий 5.

Промышленное освоение MALDI-TOF MS привело к действенным лабораторного инструмента для идентификации микроорганизмов 6,7. Технология в настоящее время хорошо известны и была интегрирована в многих лабораториях для быстрого и точного определения микроорганизмов, выделенных на твердой среде 6,8. Прямое применение MALDI-TOF MS культуры крови (до н.э.) бульона, что дали понять, "позитивный" для микроорганизмов обращений в обоих клиницистов и лабораторного менеджеров из-за возможности получения более раннюю идентификацию микроорганизмов при низких затратах.

Клиническая полезность прямого применения MALDI-TOF MS к культуре крови бульона было ограничено широким диапазоном чувствительности наблюдаемых по сравнению со стандартным фенотипическая культуры на основе методов идентификации, с сообщениями о успешной идентификации грамотрицательных бактерий, начиная от 47-98.9 % 9-11. Изменение чувствительности всегоотносится к композиции бульона BC, начальной концентрации бактерий, вариации методов подготовки образцов, а также массив грамотрицательных организмов, встречающихся в популяции исследования 9. По сравнению с этими другими опубликованными протоколами метод, представленный здесь избегает использования этанола, хлорид аммония или дополнительного (не матрица) ацетонитрила. В результате бактериальный осадок не будет остаются жизнеспособными (до точки экстракции белка), позволяющий потенциальные методы испытаний фенотипический восприимчивость к быть нанесен непосредственно на этих организмов в бульоне. Кроме того, данный способ, как было показано, чтобы быть недорогой, надежный и быстрый с бактериальной идентификации доступных в пределах 25 мин из культуры крови грамотрицательных результатов окраски, с минимальными "руки на" время 12.

Этот метод представляет собой простой протокол в доме спин-лизис использования добычу муравьиной кислоты наносится непосредственно на положительных культуральных бульонах крови для выявления грамотрицательных бacteria с технологией MALDI-TOF MS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Кровь Культура Отвары Отметить как «Позитивный»

  1. Снимите сигнализируется бутылку культуры кровь из непрерывного мониторинга инкубационного шкафа и поместить его в кабинете биологической безопасности. Примечание: Бутылки могут содержать опасные микроорганизмы и универсальные меры предосторожности должны быть выполнены. В связи с риском инфекционных аэрозолей в выборке, все процедуры отбора проб должны быть выполнены в шкафу с ламинарным потоком биобезопасности класса II.

2. Граму готов

  1. Подготовьте Граму от сигнальное культуры крови бульоне в соответствии с местными институциональными протоколов. Примечание: Когда грамотрицательные микроорганизмы идентифицируют по микроскопии культуру крови бульон обрабатывается в соответствии со следующим способом. Когда грамположительные организмы будут определены, альтернативный молекулярный метод таргетинга генетическую идентификацию и маркеры сопротивления применяется в бульон (не рассматриваются в этой статье) 13.
е "> 3. Передача помеченные крови культуральной жидкости в сыворотке Разделительный Tube

  1. Аккуратно перемешайте бутылку культуры крови путем обращения 2-3х.
  2. В шкафу биобезопасности приложить 10 мл шприц с передаточным безопасность крови устройства.
  3. Установите передачи крови устройства к бутылке культуры крови и вывести 5 мл бульона в шприц. Перенести атмосферный BC бульон в разделительную трубку сыворотки.

4. Концентрация крови культуральной жидкости

  1. Центрифуга, отделяющую трубку сыворотки в 1250 мкг в течение 15 мин, который удаляет большой объем эритроцитов.
  2. Аспирируйте и отбросить супернатант с помощью стерильной пипетки передачи быть осторожным, чтобы оставить примерно 1 мл светлого сгустка крови непосредственно над интерфейсом гель / жидкости. Примечание: аэробные бутылки показать четкое разделение эритроцитов к нижней части трубы с интерфейсом гель / жидкость появляется непрозрачный белый цвет. В противоположность этому, когдаприменяется к литической анаэробной культуры крови бульона интерфейс гель / жидкость выглядит как темно-красный цвет из-за лизированные компоненты эритроцитов остальные приостановлены в супернатанте.

5. Повторите центрифугирования вымыть шаги

  1. Аккуратно перемешайте последние 1 мл поглощающее покрытие жидкости над интерфейсом гель стерильной пипеткой, а затем передать весь объем в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Центрифуга новую трубку при 288 мкг в течение 30 сек.
  2. Передача супернатант, используя пластиковые одноразовые 1 мл пипетки передачи в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки и выбросить трубку с шариком. Примечание: Очень важно на этом этапе, что осторожность, чтобы избежать передачу таблетки. Это особенно важно для образца обрабатываемой из анаэробного бутылки до н.э. как супернатант остается пигментированный осадок и не всегда хорошо видно.

6. Лизис остаточных клеток

  1. Центрифуга образца при 18407 х г в течение 1 мин, а затем аспирата (и выбросить) супернатант с помощью тонкой передачи наконечником пипетки, чтобы оставить как можно меньше остаточной жидкости, насколько это возможно, не нарушая гранул.
  2. Ресуспендируют остаточный осадок в 1 мл стерильной ДНКазы и РНКазы свободной воды с помощью пипетки вверх и вниз. Примечание: Некоторые авторы описали использование спиртовых растворах вместо стерильной воды для ресуспендируют осадок которая делает бактерии нежизнеспособных.
  3. Центрифуга ресуспендированные решение на 18407 мкг в течение 1 мин.

7. Добыча бактериальных белков

  1. Аспирируйте и отбросить супернатант, опять же используя стремление с тонкой пипетки гарантируя, что столько жидкости, сколько возможно удаляется.
  2. Ресуспендируют осадок в 10 мкл муравьиной кислоты (70% об / об). Примечание: муравьиная кислота может влиять на тело, если оно вдыхании или если он вступает в контакт с кожей. При подготовке или манипулирования решения оно тecommended, что персонал использовать вытяжной шкаф в дополнение к индивидуальной защиты.
  3. Хорошо перемешать с помощью пипетки для обеспечения гомогенной ресуспендировали решение. Использование пипетки физически нарушить гранул могут быть необходимы для обеспечения более гомогенного раствора.

8. Подготовка MALDI-TOF Целевая плиты

  1. Привить чистую MALDI-TOF мишень с 2 мкл подготовленной суспензии в целевой точке. Подготовьте 3 целевые сайты для каждого образца, чтобы преодолеть случайные проблему не удалось читает.
  2. Разрешить визирная MALDI-TOF для просушки. Скорость сушки может быть увеличена путем размещения пластины на краю вытяжном шкафу, чтобы максимизировать воздушный поток через пластину.
  3. Накладываются друг на высушенную место с 1 мкл матричного раствора (10 мг / мл α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (HCCA), 50% ацетонитрила, 2,5% трифторуксусной кислоты). Примечание: раствор Матрица может влиять на тело, если оно вдыхании или если он вступает в КонтаКТ с кожей. При подготовке или манипулирования решения рекомендуется персонал использовать вытяжной шкаф в дополнение к индивидуальной защиты.
  4. Разрешить целевой пластина MALDI-TOF сушить на краю вытяжном шкафу, как описано выше. Убедитесь, однородная подготовка наполняет каждого из целевых мест на плите.

9. Место MALDI-TOF Целевая плиты в масс-спектрометр

  1. Вставьте мишень MALDI-TOF в масс-спектрометра MALDI-TOF. Убедитесь, что пластина сидит на одном уровне с подпружиненных пластин. Примечание: не вставляйте мишень, пока все целевые места не станут сухими.
  2. Убедитесь, что резиновое уплотнение чистый пух, пыль и волосы, чтобы требуемые условия вакуумные может быть создан.
  3. Закройте этап крышку MALDI-TOF, а затем нажмите кнопку "в / из" на передней панели прибора. Крышка теперь будет блокировать и позволяют необходимости вакуум должен быть создан.

10. MALDI-TOF MS Spectra Приобретение

  1. Откройте MALDI Биотипирование и программное обеспечение FlexControl.
  2. В программном обеспечении Typing выбрать "новую классификацию" из выпадающего меню под названием "файл". Назовите проект и выберите "Новый". Выберите "Next", чтобы завершить установку в программном обеспечении Typing.
  3. В окне программы управления идентифицировать на экране графический подставки цели. Выделите MALDI-TOF целевые места, которые используются, перемещая курсор привитых пятен, удерживая левую кнопку мыши.
  4. Используйте правую кнопку мыши щелкните в любом месте на выбранных целевых позиций, а затем выберите "добавить аналитов" из выпадающего меню.
  5. Добавить культуры идентификационных крови, чтобы "ИД" колонке для каждой из целевых мест и нажмите кнопку "Далее", когда завершена.
  6. Выберите коммерческую "таксономии" Спектры базу данных и выберите "Далее". Примечание: Laboratories может использовать дополнительный в доме или коммерческих баз данных, чтобы увеличить количество эталонных спектров.
  7. Нажмите "Finish" и MALDI-TOF MS начнется генерации спектров. Примечание: настройки MALDI-TOF были в соответствии с настройками изготовител (линейный положительном режиме, 60 Гц частоты лазера, напряжение 20 кВ ускорение, 16,7 IS2 напряжение кВ, 170 нс задержки экстракции, и 2,000-20,137 дальности м / з).
  8. Если программное обеспечение MALDI управления не в состоянии генерировать пики, ручная приобретение спектров могут быть выполнены (метод не описан).

11. Сообщение Анализ Интерпретация MALDI-TOF MS Scores

  1. После того, как спектры приобретаются и анализ завершен, нажмите кнопку "+" рядом с видовой идентификации на программное обеспечение Typing расширить список идентификационный для каждой цели.
  2. Исследование 5 лучших идентификации, отметив, если топ-5 аналогичны. Дискордантные топ 5 родов с показателями ≥ 1,7 из той же целипятно поднял вопрос о возможности смешанных бульонов. Примечание: технология MALDI-TOF имеет плохую чувствительность для обнаружения смешанных бульонов. Например, когда бульон содержит смешанное видов высокий балл доверия могут быть идентифицированы в течение только одной из смешанных видов.
  3. Когда оценка ≥ 2.0 отличается самой высокой матча на целевой точке, сообщают видов.
  4. Когда высокий балл на целевом пятна ≥ 1,7, но <2,0, сообщают только роды. Если дополнительные критерии лучших 5 идентификаций согласованы, то представить видовом уровне.

12. Удаление MALDI-TOF Target плиты

  1. Когда все спектры являются полными нажмите кнопку "вход / выход" на машине MALDI-TOF.
  2. Откройте MALDI-TOF целевой пластины емкость и снимите мишень MALDI-TOF.
  3. При использовании многоразовой MALDI-TOF мишень, чистые все целевые места, используя спирт и хранить MALDI-TOF пластину при комнатной температуре, когда он будет чистым и сухим.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сгенерированный MALDI-TOF MS спектры по сравнению с интегрированной справочной базы данных спектров. Логарифмическая оценка присваивается за доверие матча между тестовой изолята и справочную базу данных изолирует, с рекомендацией счетом ≥ 1,7, необходимых для возможного выявления до уровня родов (рис. 1) и ≥ 2,0 для вероятного идентификации для определения видов (рис. 2). Сообщить видовом уровне при счете ≥ 1.7 и первые 5 идентификации подобраны с помощью программного обеспечения Typing...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Важно при применении MALDI-TOF MS в культуральной жидкости крови, что шаги сообщение центрифугирования выполняются с достаточной осторожностью, чтобы не ремикс разделенных компонентов. Особенно важно, чтобы удалить культуры крови составляющие и клеточных белков человека, включая гемоглобина, которые могут производить шипы, препятствующие со спектрами MALDI-TOF.

Хотя МС производит рекомендуем сократить партитуры ≥ 2.0 для видов и ≥ 1,7 для идентификации рода, другие отчеты предложили более ни...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BACTEC Plus Aerobic/F MediumBecton Dickinson; BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США 442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F MediumBecton Dickinson; BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США 442265
BACTEC Peds Plus MediumBecton Dickinson; BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США 442194
Vacutainer - Устройство для переноса кровиBecton Dickinson; BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США364880Одноразовое устройство для отбора проб, снижающее риск травмы от укола иглой
Vacutainer SST 5,0 мл, Advance plusBecton Dickinson; BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США 367954Сыворотка Разделительная трубка
Шприц 10 млБектон Дикинсон; BD, Franklin Lakes, NJ, США302143
Трансферный пипеткаSamco, США222-20S
Трансферный пипетка (с тонким наконечником)Samco, США232-20S
микроцентрифужная пробирка (2,0 мл)Eppendorf, Гамбург, Германия0030.120.094
Стерильная вода (без ДНКазы и РНКазы)Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США10977-015
Муравьиная кислотаSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАF0507
Матричный раствор Bruker Daltonics, Бремен, Германия28507410 мг/мл &альфа;-циано-4-гидроксикоричная кислота, 50% ацетонитрила, 2,5% трифторуксусной кислоты
Настольный микрофлекс LT MALDI-TOF MSBruker Daltonics, Бремен, ГерманияИспользование программного обеспечения BioTyper 3.1 (Build 65) и FlexControl 3.3 (Build 99)

Ссылки

  1. Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
  2. Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
  5. Clerc, O., Prod'hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
  6. Dekker, J. P., Branda, J. A. MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
  7. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  8. Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
  9. Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
  10. March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
  11. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
  12. Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
  13. Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
  14. Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
  15. Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
  16. Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
  17. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
  18. Novel,, et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
  19. Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.