Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Живых изображений сотовый первичных Rat неонатальных кардиомиоцитов После Аденовирусный и Лентивирусов Трансдукция Использование конфокальной вращающийся диск микроскопия

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51666

⸱

24 июня 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology, 2Department of Internal Medicine, Yale Cardiovascular Research Center and Section of Cardiovascular Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод визуализации живых клеток с использованием первичных неонатальных кардиомиоцитов крысы после лентивирусной и аденовирусной трансдукции с использованием конфокальной микроскопии вращающегося диска. Это позволяет детально наблюдать за клеточными процессами в живых кардиомиоцитах.

Аннотация

Первичный крыс неонатальные кардиомиоциты могут быть использованы в основном в пробирке сердечно-сосудистых исследований, поскольку они могут быть легко изолированы в больших количествах в одной процедуры. Благодаря достижениям в области микроскопа технологии это относительно легко для захвата изображений живых клеток с целью исследования клеточных событий в режиме реального времени с минимальным беспокойством относительно фототоксичности к клеткам. Этот протокол описывает, как взять живые клетки интервальная съемка фотографий первичных крысиных неонатальных кардиомиоцитов с помощью конфокальной вращающийся диск микроскоп следующие лентивирусным и аденовирусной трансдукции модулировать свойства клетки. Применение двух различных типов вирусов облегчает достижение соответствующего уровня ставок трансдукции и экспрессии для двух разных генов. Хорошо сфокусированных изображений живых клеток могут быть получены с использованием автоматической фокусировки системы микроскопа, который поддерживает стабильную фокусировку в течение длительных периодов времени. Применяя этот метод, функции экзогенно инженераред белки, экспрессированные в культивируемых первичных клеток могут быть проанализированы. Кроме того, эта система может быть использована для изучения функции генов с использованием киРНК а также химических модуляторов.

Введение

Первичные крысы неонатальные кардиомиоциты уже давно используются для исследования функции кардиомиоцитов в пробирке 1. Они легко изолировать от крысят несколькими хорошо известными способами 2-4. Наиболее распространенным методом работают коллагеназы или трипсин, чтобы переварить соединительной ткани сердца до выделения клеток. Исследователи также разработали методы выделения кардиомиоцитов из взрослых грызунов 5-8, а также новорожденных мышей 9,10.

Этот протокол описан способ выделения кардиомиоцитов из неонатальных детенышей крыс, используя процедуру ферментативному перевариванию двухступенчатый. Трипсин первом использовании O / N при 4 ° С, а затем очищенный коллагеназы при 37 ° С Инкубация ткани сердца с помощью трипсина O / N при 4 ° С уменьшает шаги, необходимые для сбора урожая клеток по сравнению с методами, использующими последовательные инкубации в теплом растворе фермента 2. Кроме того, с помощью очищенного COllagenase, а не сырой ферментов, много к партии изменчивость может быть устранена, тем самым обеспечивая повышенную воспроизводимость.

Функциональные исследования конкретного белка часто используют систему экспрессии белка с использованием аденовирус 11-13 и / или 14-16 лентивирусов. [Примечание по] Вирусный производство и манипуляции должны проводиться в соответствии с рекомендациями NIH.

Аденовирус не интегрируется в геном хозяина. Она имеет очень высокую эффективность трансдукции в большинстве типов клеток, в том числе делящиеся клетки и не-делящихся клеток, а также первичных элементов и установленных клеточных линий. Это делает аденовирус надежным вектор для экспрессии генов. Высокие уровни белка, кодируемого вектором аденовируса развивать в течение 48 часов следующего трансдукции, и они могут продолжаться в течение нескольких недель 17. Однако один недостаток использования аденовирус для экспрессии белка в том, что развитие рекомбинантного адекватноnovirus является одновременно сложным и трудоемким. Этот недостаток отчасти объясняет, почему многие исследователи обращаются к лентивирусы для выражения рекомбинантного гена. В отличие от аденовирусных конструкций, создавая лентивирусов конструкцию быстро. Хотя лентивирусы как правило, имеют более низкую эффективность трансдукции, чем аденовирусы, в обоих разделительных и не делящихся клеток, они интегрируются в геном хозяина. Следовательно, выражение гена трансдуцированных является более стабильным, чем для лентивирусов для аденовирусов.

В связи с технологическими достижениями в области микроскопии, это намного проще, чтобы захватить клетки изображения живых клеток, выражающих рекомбинантных белков. Это справедливо даже на скоростях Оценить видео приобретения. Это позволяет исследователю определить, как определенные изменения в интересующего белка функционально воздействовать на клетки в реальном времени. Конфокальной вращающийся диск микроскоп имеет несколько ключевых особенностей, которые делают его оптимальным методом для Ливе ячейки изображения 18,19. Вращающегося диска Yokogawa позволяет гораздо более быстрого получения изображения, в то же время используя гораздо меньше мощности лазера, чем точка сканирующей конфокальной микроскопии. Обе эти особенности обусловлены вращающийся диск, который содержит многочисленные конфокальных отверстия, через которые проходит лазерный одновременно с образцами. Во время приобретения, сам диск вращается быстро и непрерывно 18-20. С помощью автоматической фокусировки систему микроскопа, устойчивый фокус сохраняется в течение длительного периода времени. Это позволяет исследователям принять целенаправленных изображения живых клеток. Приобретенные изображения воспроизводятся как видеофайл. Изображения анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений, таких как ImageJ 21,22, Фиджи 23 или другого имеющегося в продаже программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выделение крыс неонатальных кардиомиоцитов

  1. Использование модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) и минимальную поддерживающую среду (MEM) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллина / стрептомицина (P / S) в качестве культуральной среды. Добавить бромдезоксиуридин (BrdU) в среду, чтобы предотвратить рост фибробластов в течение первых 2 дней после изоляции.
База среднего FBS BrdU (мМ) P / S (U / мл)
выбор DMEM 10% 0 20
Первый день DMEM 10% 0.1 10
На следующий день DMEM / MEM 5% 0.1 10
Далее культура DMEM / MEM 5% 0 10

Таблица 1:. Среда для крыс неонатальных кардиомиоцитов Используйте это средства массовой информации для культивирования крысы новорожденных кардиомиоцитов. DMEM / MEM 1:1 смесь DMEM и MEM среде.

  1. Изоляция кардиомиоцитов, день 1 (Оценочная требуется время, приблизительно 1 час)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для работы с новорожденных грызунов, обратитесь к местным требованиям университета и правилами, установленными программами по уходу за животными, и придерживаться институционально одобренных протоколов животных. Все способы, описанные в этом протоколе были утверждены в Институциональная уходу и использованию животных комитета Йельского ресурсного центра животных на.
    1. Подготовка реагентов и инструменты: сбалансированный солевой раствор кальция и магния-Free Хэнка (CMF HBSS), 30 мл х 2, 10 мл х 2, на льду; 1 мг трипсина, восстановленный с 2 ​​мл CMF HBSS, на льду; автоклавного инструментов; 70% этанол (EtOH) в 250 мл химический стакан; четыре стерилизовать 10 см пластиковой посуды, три для изоляции сердца и один для трипсинизации.
    2. Заказать 1 Литтэ из 1-к-2-дневных крысят (около 10 щенков) с их плотины от экспериментального животного дистрибьютора.
    3. День 1, трансфер щенков в маленькой клетке и усыпить плотину с кетамин / ксилазина коктейля (Кетамин, 200ml/10g и ксилазина 20ml/10g) передозировка.
    4. Возьмите одного щенка и стерилизовать все его тело с 70% этанола. Обезглавьте щенка с ухоженными острыми хирургическими ножницами на стерилизованной 10 см пластиковую чашку в месте, изолированном от других щенков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для того чтобы собрать образцы как можно быстрее, лучше всего использовать самый быстрый и эффективный способ для прекращения жизни грызуна. Обезглавливание при правильном использовании квалифицированными специалистами с благоустроенной оборудования может привести к меньшим страхом и тревогой за животным и быть более быстрым и практичным, чем другие формы эвтаназии. Это согласуется с рекомендациями Американской Ветеринарной Руководства Ассоциации медицинских для эвтаназии животных.
    5. Удалить побоевискусство стерилизованными инструментами, и положил сердце в 30 мл ледяной охлажденной CMF HBSS в 50 мл коническую трубку. ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите сердца как можно быстрее и положить их на лед сразу. После удаления сердца от тела, все процедуры нужно делать на льду.
    6. Сбор 5 сердца в 30 мл ледяной охлажденной CMF HBSS, а остальные 5 сердца в еще 30 мл ледяной охлажденной CMF HBSS. Вихревой трубки для полоскания сердца. ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага, выполнить все процедуры ламинаре.
    7. Удалите супернатант и передать сердца к новому стерилизованного 10 см пластиковую чашку на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не для аспирации сердца с аспиратором.
    8. Удалить крупных сосудов и / или нежелательные ткани. Добавьте 10 мл ледяной охлажденной CMF HBSS к блюду, чтобы ополоснуть сердца.
    9. Перенесите все сердца на новый стерилизованного 10 см пластиковую чашку на льду. Фарш сердца ножницами до менее 1 мм 3 на льду.
    10. Добавить 9 мл охлажденной CMF HBSS. Добавьте 1 мл охлажденной трипсина reconstituted с CMF HBSS (конечная 50 мкг / мл).
    11. Закройте блюдо парафильмом и покрыть ее с алюминиевой фольгой, затем поместить его в холодной комнате (4 ˚ C) в течение ночи.
  2. Изоляция кардиомиоцитов, День 2 (Расчетное требуется время, около 4 часов)
    1. Подготовка реагентов и инструменты: 50 мл коническую трубку х 2; 2 мг ингибитора трипсина, восстанавливают 1 мл CMF HBSS, на льду; 1500 единиц коллагеназы, восстановленный с 5 мл Лейбовиц L-15, при комнатной температуре (RT); Лейбовиц L-15, восстановленный с 1 л стерилизованной воды и фильтруют через 0,22 микронный фильтр, 8 мл при комнатной температуре; 10 мг / мл (32,6 мМ) BrdU в воде; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; два 10 см пластиковые клеточных культур блюда; 3,5 см со стеклянным дном блюда.
    2. День 2, Подготовка желатиновые покрытием блюда. Добавьте 1 мл 0,1% раствора желатина, чтобы покрыть нижнюю тарелку 3,5 см стекло для эксперимента изображений. Выдержите блюда при 37 ˚ С в течение нескольких часов, а затем аспирации и отказаться раствор желатина перед использованием.
      НЕТTE: 3,5 см со стеклянным дном блюдо подходит для эксперимента изображений с помощью флуоресцентного микроскопа. Для извлечения белков из первичных кардиомиоцитов обнаружить экспрессию белка помощи вестерн-блоттинга (ВБ), 0,1% желатина покрытием пластиковые клеточных культур посуду можно использовать.
    3. Перевести все ткани сердца переваривается трипсином в течение ночи с буфером для конической трубе 50 мл на льду в стерилизованной крышкой. Добавить 1 мл ингибитора трипсина в CMF HBSS (конечная 182 мкг / мл). Закрыть крышкой 50 мл коническую трубку плотно, чтобы предотвратить загрязнение.
    4. Выдержите трубки в течение примерно 30 мин в инкубаторе 37 ˚ C, чтобы нагреть ткани и буфер для 30-37 ˚ С. Добавить 5 мл коллагеназы в Лейбовиц L-15 (конечная 94 ед / мл). Инкубировать при 37 ˚ С в течение 45 мин при осторожном встряхивании (170-200 оборотов в минуту в шейкер 37 ˚ С инкубатор).
      Примечание: Этот шаг может быть сделано за пределами ламинарном боксе. Все последующие шаги должны сделать при комнатной температуре.
    5. Лечить снаружи 50 мл коническую трубку с 70% этанола и положитьэто в стерилизованной крышкой.
    6. Растирают тканей с использованием автоматического пипетки с пипетки на 3 мл / сек скорости 20 раз. Разрешить ткани остаток урегулировать в течение 3 мин и процеживают супернатант с 70 мкм ячейки фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: обычный размер 10 мл пипетки может быть использован для растирания.
    7. Добавить 5 мл Лейбовиц L-15 для остальных сгустков ткани и растирают и фильтруют супернатант снова. Промыть фильтр клеток с 2 мл Лейбовиц L-15.
    8. Наведите отфильтрованного раствора клеток в капюшоне в течение 20 - 60 мин, чтобы позволить коллагеназы переварить частично разрушенного коллагена.
    9. Отложений клетки при 100 х г в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в 20 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS и высокой концентрации P / S (20 ед / мл).
    10. Предварительно плиты клетки на двух 10 см пластиковых клеточных культур блюд в течение 1 часа в СО 2 инкубатора при 37 ˚ C для выбора кардиомиоцитов. Примечание: Фибробласты придавать более легко в нижней части блюда, чем кардиомиоцитов.
    11. БелыйIle ожидания, подготовить DMEM, содержащей 10% FBS, P / S (10 ед / мл) и 0,1 мМ BrdU. Добавить 1 мл 10 мг / мл BrdU в 325 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS и P / S.
    12. Вихревой блюда аккуратно и собирать кардиомиоцитов, содержащий супернатант из двух 10 см чашки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство кардиомиоциты все равно завис в супернатанта после 1 часа инкубации. Во избежание загрязнения с фибробластами, которые слегка прикрепленных к блюду, не собирают супернатант с помощью пипетки.
    13. Дополнительно> Граф клеток в супернатант с и без 0,2% трипанового синего и проверить жизнеспособность клеток.
    14. Отложений клетки при 100 х г в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в DMEM, содержащей 10% FBS, P / S (10 ед / мл) и 0,1 мМ BrdU. Пластина клеток в 2 х 10 5 клеток / блюдо в покрытые желатином 3,5 см со стеклянным дном посуды для наблюдения с помощью микроскопа. ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокоить клетки после покрытия по крайней мере 24 часов в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С.
    15. День 3, ЧаNGe средние 24 часа после нанесения покрытия, чтобы DMEM / MEM, содержащей 5% FBS, P / S и 0,1 мМ BrdU.
    16. День 4, Изменение средних 48 часов после посева в DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S.
      Примечание: изменение среднего каждые 2-3 дня с DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S.

2. Лентивирусов трансдукции

  1. Упаковка лентивирусных плазмид
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к другим источникам для дальнейшего углубленного информации по этому вопросу 24-26. Это займет около 3 дней, чтобы подготовить лентивирусного решение. Лучше всего использовать свежий раствор лентивирусов для достижения более высокой эффективности трансдукции. Начните упаковку лентивирусных плазмид и изоляции крыс неонатальных кардиомиоцитов в параллельном режиме. Вместо того чтобы использовать полиэтиленимин (PEI) 27 для упаковки лентивирусов плазмид, коммерчески доступный реагент трансфекции может быть использован. Следуйте инструкциям производителя.
    1. Подготовка реагентов и инструментов; НЕККлетки 293Т, 10 см пластиковые клеточных культур блюда, лентивирусные решения плазмиды (pMDLg / pRRE, PRSV-Rev, pMD2.G, лентивирусный векторные передачи, 1,0 мг / мл каждая), 1 г / л PEI, сыворотки среде, 20 мМ хлорохин в воде, 10% отбеливателя, 1% SDS в 70% этанола
    2. День 0, плиты 2-2,5 х 10 6 НЕК 293Т клеток на 10 см блюдо накануне трансфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 30-60% слияния в трансфекции является оптимальным.
    3. День 1, Подготовка PEI трансфекции решение. Добавить 30 мкл 1 г / л PEI в 960 мкл бессывороточной среды в 1,5 мл трубки. Добавить 4 плазмиды в трансфекции решения PEI в 1,5 мл трубки, и смешать с отводом.
    Название плазмиды Примечание Размер (кб) Объем добавлено (мл) Окончательная сумма в 10 см блюдо (мг) Конечная концентрация в 10 см блюдо (PM)
    Лентивирусов вектор переноса кодирует ген должен быть упакован 9-13 3.6-5.2 3.6-5.2 60
    pMDLg / pRRE выражает ВИЧ-1 GAG / POL 8.8 1.76 1.76 30
    PRSV-Версия выражает ВИЧ-1 REV 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G выражает VSV G 5.8 1.16 1.16 30

    Таблица 2:. Количество плазмид для упаковки лентивирусов использовать эти суммы для трансфекции плазмиды клеток НЕК293 в 10 см чашки. Итоговый объем лентивирусным вектора переноса за блюдо может отличаться в зависимости от его размера, поддерживать конечной концентрации за блюдо при 60 мкМ. Средний молекулярный вес от одной базовой пары двухцепочечной ДНК 660 дальтон.

    1. Утилизировать старые средуот 10 см блюдо из HEK 293Т и осторожно добавить 9 мл новой среде (DMEM + 10% FBS, без P / S).
    2. Добавить смесь PEI-ДНК мягко каплям на тарелку и нежно вихревой смешать со средой. Добавить 10 мкл 20 мМ хлорохина (конечная 20 мкМ) в 10 мл среды. Примечание: Хлорохин, как полагают, уменьшают деградацию плазмиды, содержащие трансфекции комплексов через частичной нейтрализации рН в пределах лизосомальных отсеков 28.
    3. Выдержите в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С в течение 6 часов. Затем удалить среду, содержащую смесь PEI-ДНК и добавляют 10 мл новой среде (DMEM + 10% FBS + 20 мМ 4 - (2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-кислоту (HEPES), рН 7,4 + P / S) . ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации вируса будет производиться в среде. Аспирационные Пипетки Пастера и / или советы должны быть подвергнуты дезактивации на 10% отбеливателя. Всегда обеззараживания биологической безопасности поверхность шкафа и потенциально загрязненное оборудование с 70% этанола независимо от того, была пролита супернатантили нет. Если разлив произошел, тщательное обеззараживание с 1% SDS в 70% этанола необходимо.
    4. 2-3 день, инкубировать в СО 2-инкубатор при 37 ˚ С в течение 48-72 часов. День 4, собирать лентивирусов решение (продолжать разделе 2.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Средний могут быть изменены в 48 часов после трансфекции. Сбор Вирус супернатант 48 часов и 72 часа в два раза может достичь для получения более высокого титра вируса решения.
  2. Коллекция решения лентивирусным и трансдукции
    1. Подготовка реагента и инструменты: 15 мл конические пробирки, 1 М HEPES, рН 7,4 (0,22 мкм фильтруется)
    2. День 4, Сбор супернатант, содержащий частицы лентивирусов (лентивирусов раствор) 10 мл стерилизованной Luer-Lok шприц, затем фильтруют супернатанта через 0,45 мкм фильтр в 15 мл коническую пробирку. Добавить 1/100 объема 1 М HEPES рН 7,4 до отфильтрованного раствора лентивирусов (конечная 10 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для фильтрации, используйте только целлюлозы тузТейт или полиэфирсульфона (PES) (связывание низким содержанием белка) фильтры. Не используйте нитроцеллюлозных фильтров. Нитроцеллюлозы связывает поверхностные белки на лентивирусным конверт и разрушает вирус.
    3. Удалите среду от 3,5 см чашки крысы неонатальных кардиомиоцитов, полученных на последнем шаге разделе 1.2, добавить 1 мл фильтрованной лентивирусным решения 3.5 см блюдо.
    4. Добавить гексадиметрин бромид (конечная концентрация 4-6 мкг / мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: гексадиметрин бромид может повысить лентивирусов эффективность трансдукции. Концентрация гексадиметрин бромид должны быть оптимизированы.
    5. Выдержите блюдо для 6 часов в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С в течение лентивирусным трансдукции, а затем изменить среду, чтобы новый DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S. Выдержите блюдо в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интеграция экзогенного гена в геном хозяина по лентивирус считается, будет завершена к 72 часов.
    7. День 7, использовать клетки от шага 2.2.5 для следующего шага. Примечание: Белки выражение из лентивирусов плазмиды может быть подтверждено WB или иммуноцитохимии (ICH) после 48-72 часов трансдукции, чтобы определить относительный уровень экспрессии (фиг.1А и 1В).
  3. Концентрация лентивирусным решения
    Примечание: Лучше всего использовать свежий раствор лентивирусов, чтобы достичь наивысшую эффективность трансдукции, в случае, лентивирусов решение титр не достаточно высока, лентивирусов раствор может быть сконцентрирован полиэтиленгликоль (ПЭГ) осадков 29.
    1. Приготовление раствора 4x ПЭГ (32% ПЭГ6000, 400 мМ хлорида натрия (NaCl), 40 мМ HEPES рН 7,4)
      1. Для 125 мл раствора ПЭГ 4x, взвешивают 40 г ПЭГ6000, затем растворить его в 60 мл воды.
        Примечание: Примечание: (. Т.е. средняя молекулярная масса составляет 6000 ПЭГ6000) после ПЭГ число средняя молекулярная масса
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.1.2) Медленно добавляют 10 мл5 М NaCl. Медленно добавьте 5 мл 1 М HEPES рН 7,4. Регулировка рН до 7,4 с помощью 2 М гидроксида натрия.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.1.3) Добавьте воду до 125 мл. Стерилизация 4x раствора ПЭГ мембранной фильтрацией с 0,22 мкм фильтр и хранить его при температуре 4 ˚ С.
    2. Лентивирус концентрация
      1. Фильтр лентивирусов трансдуцированных супернатант в новую пробирку на 50 мл с помощью 0,45 мкм фильтра.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.2) Добавить решение 4x Peg 1:03 соотношение (раствор ПЭГ: супернатант = 1:3). Хранить при температуре 4 ˚ С в течение 16-48 часов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.3) Центрифуга при 2600 х г при 4 ˚ С в течение 30 мин. Удалите супернатант и центрифуги в 2600 х г при 4 ˚ C в течение 5 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.4) Удалите супернатант осторожно, чтобы не нарушая гранул. Повторное приостановить гранул в бессывороточной среде с использованием 1/2 до 1/25 объема от первоначального объема надосадочной жидкости.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.5) Используйте прямо или заморозить с помощью жидкого азота затем сохранить при -80 ˚ C

3. Аденовирусной трансдукции

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к другим источникам для методов построения и распространения аденовирусных конструкций 13. Аспирационные Пипетки Пастера и / или советы должны быть подвергнуты дезактивации на 10% отбеливателя. Всегда обеззараживания биологической безопасности поверхность шкафа и потенциально загрязненное оборудование с 70% этанола независимо от того, была пролита супернатант. Если разлив произошел, тщательное обеззараживание с 1% SDS в 70% этанола необходимо.

  1. Аденовирусный титрования на 50% тканевой культуры инфекционного дозы (TCID 50)
    Примечание: Перед трансдукции, необходимо, чтобы титровать аденовирусный маточного раствора. ТцД 50 является одним из лучших методов для титрования вируса решение. Поскольку метод оценивает титр инфекционным мощностью до НЕК 293Т, рассчитанной тцД 50 отражает фактическое infectability аденовируса складе. ОРП (бляшкообразующих униTS) пропорциональна TCID 50 с коэффициентом около 0,56 30.
    1. Подготовка клетки и инструменты: НЕК 293Т, 10 см клеточных культур блюда, 96-а плоским дном культуры клеток плиты, 8-канальный мульти пипеток
    2. Подготовьте 70-90% сливной НЕК 293Т в одном 10 см блюдо.
    3. Выполните предварительный разбавление 1/10 4 вируса складе. Добавить 50 мкл DMEM + 10% FBS в каждую лунку 96-луночного плоским дном для культуры клеток пластины. Добавьте 25 мкл предварительно разбавленной вируса складе в первом ряду, от А до Я.
    4. Хорошо перемешать и перенести 25 мкл из первой строки скважин на второй строке с 8-канальной пипетки несколькими. Повторите разведение на 1/3 вирусной решения каждой строке скважин, вплоть до 11-й строки и отбросить последние 25 ул.
    5. Triturate НЕК клетки 293Т в 10 мл DMEM + 10% FBS. Добавить 50 мкл раствора клеток в каждую лунку от строк с 1 по 12.
    6. Инкубируйте клетки при 37 ˚ С в СО2-инкубаторе для 11-13 дней. Добавить 50 мкл DMEM + 10% FBS через 4-5 дней и 7-8 дней обшивки.
    7. Измерьте цитопатические эффекты в каждую лунку по 11-13 дней после заражения.
    переулок 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    Ряд г г г г г г г г г
    Ряд B г г г г г г г г г
    Ряд C г г г г г г г г г
    Ряд D г г г г г г г
    Ряд E г г г г г г г г г г г
    Ряд F г г г г г г г
    Ряд G г г г г г г г г
    Ряд Н г г г г г г г г г г г
    количество положительных лунок в каждом ряду 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    соотношение положительных лунок в каждом ряду 1 1 1 1 1 1 1 0,75 0.63 0.25 0.25 0
    г Показано более 50% цитопатических эффектов
    Показано под 50% или не цитопатических эффектов

    Дорожка 1, разбавление 3 1 4 x10; дорожка 2, разбавление 3 2 x10 4; ...; полоса 11, разбавление 3 2 x10 11; , д. 12, контроль.
    S = сумме соотношения положительных лунок в каждом ряду
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0,75 +0,63 +0,25 +0,25 +0 = 8,875
    ТцД 50 = 3 х 10 4 х 3 х (8.875-0.5) = 2,97 х 10 8
    ТцД 50 / мл = 5,94 х 10 9

    Таблица 3: Пример зараженного 96 хорошо пластины после 10 дней инкубации измерить цитопатические эффекты в каждую лунку и подвести соотношения положительных скважин в ряду..

    1. Рассчитать титр по формуле Kaerber в 31.
    2. ТцД 50 = (разбавление первой полосе) х (разведение) (S-0.5)
    3. S = сумме соотношения положительных лунок в каждом ряду
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола, тцД 50 = (30000) х (3) (S-0.5). Поскольку 50 мкл вирусного раствора используется в данном протоколе, разделить TCID 50 на 0,05 рассчитать TCID 50 / мл.
  2. Аденовирусной трансдукции
    1. Рассчитать необходимое количество аденовирусного раствора от его титра (PFU / мл, вирусной частицы / мл или TCID 50 / мл). Используйте формулу для расчета МВД (множественность заражения).
    2. EM> [Место Таблица 4 здесь]
    3. Добавить расчетное количество раствора вируса в бессывороточной среде (см. таблицу 5). Все хорошо перемешать и выдержать в течение 20 минут при комнатной температуре.
    4. EM> [Место Таблица 5 здесь]
    5. День7 возьми блюдо, полученное на последнем шаге раздела 2.2, и заменить среду с 750 мкл нового DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение среднего объемав трансдукции до примерно 50% от первоначального объема является критическим для высокой эффективностью трансдукции.
    6. Добавить разбавленный вируса решение блюдо. Выдержите блюдо для 4-8 часов в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С. Затем вместо свежей средой.
    7. Выдержите блюдо для 24-48 часов в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С. В день 8-9, использовать клетки для эксперимента изображений живых клеток. Примечание: Белки выражение из аденовирусного плазмиды может быть подтверждено WB или ICH после 24-48 часов трансдукции, чтобы определить относительную уровень экспрессии белка (фиг. 1с и 1d).

4. Изображений живых клеток

  1. Получение изображений с помощью конфокальной вращающийся диск микроскоп с контролируемой температурой камеры и экологической системы CO 2 (необязательно)
    1. Включите систему контроля температуры по крайней мере 1 часа до приобретения, так что все устройства в равновесие до 37 ˚ С до начала приобретения. Включите confocаль спиннинг диск микроскопа системы (ПК для работы, микроскоп, вращающийся диск блок, ПЗС-камеры, лазеры, флуоресцентный источник света, нормальный источник света, моторизованный этап и автоматические жалюзи).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более 1 час необходимо добиться полного уравновешивания температуры всех устройств.
    2. Изменение среды в 3,5 см со стеклянным дном блюд до нужной среды для приобретения, если это необходимо. Место блюдо на сцене конфокальной спиннинг диска микроскопа в контролируемой температурой камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с сферической аберрации для оптимального наблюдения с помощью микроскопа использованием 3,5 см со стеклянным дном блюдо с п. 1.5 покровного стекла (около 0.16-0.19 мм толщины) идеально подходит. Если цель используется имеет коррекции воротник, изображения, полученные с покровными стеклами толщиной более 0,17 мм может быть скорректировано. Кроме того, Фенол красный имеет небольшой флуоресценции. Иногда желательно использовать фенол красный свободный среду, такую ​​как DMEM без фенолового красного. Если нет устройство для контроля CO 2 концентрация на столике микроскопа, то лучше использовать СО 2 независимых среднего или среднего буферизируются HEPES для долгосрочного покадровой обработки изображений.
    3. Выберите оптический путь окуляров.
    4. Поверните заслонку светлого поля источника света на. Настройте фокус с клетками под микроскопом через окуляры. Поверните затвор для светлого поля источника света офф.
    5. Поверните затвор для флуоресцентного источника света на. Найти клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки под микроскопом через окуляры. Поверните затвор для флуоресцентного источника света офф.
    6. Дополнительно> Нажмите кнопку активации для совершенной системы фокусировки перед микроскопом, чтобы включить совершенную систему фокусировки на, чтобы сохранить фокус устойчивый при приобретении покадровой.
    7. Измените путь света к вращающимся диском конфокальной микроскопии. Изменение настроек для приобретения надлежащим с помощью программного обеспечения, проверка изображения ДИСПЛЕЙYED на экране. (Например, Focus, мощность лазера, время экспозиции, ПЗС усиления камеры и вне набора)
    8. Установить настройки для флуоресцентного получения изображений с помощью операционной программного обеспечения. Пример: Выберите "Изменить каналы с использованием световых путей» и «Канал 1: EGFP" приобрести флуоресцентный сигнал от EGFP для одного канала.
    9. Установите частоту между временных точках по настройке параметров покадровой, чтобы принять покадровой изображения с помощью программного обеспечения. Пример: на приобретение одной временной точке каждые 5 минут, выберите "Минут на временной точке" из выпадающего меню и введите 5 в поле ввода текста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите "максимальной скорости", чтобы сделать фильм по фактической скорости. Если выражение флуоресцентного белка низкий, флуоресценция может быстро отбелить во время сбора покадровой. В этом случае лучше уменьшить количество сбора временных точках.
    10. Запустите приобретение покадровой, нажав кнопку "STAКнопка RT ", чтобы приобрести последовательность изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше не использовать функцию сбора несколько-очков. Это может привести к потере фокуса или движения области изображения во время покадровой обработки изображений.
  2. Анализ полученных изображений
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приобрел изображения могут быть воспроизведены в видеофайл и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа.
    1. Выберите полученные изображения, которые будут включены в кино. При необходимости, на полях области интереса со стороны образов и выберите интересные моменты времени, чтобы уменьшить размер файла фильма с помощью программного обеспечения.
    2. Экспорт изображений в виде файла фильма в AVI или в формате MOV. Выберите формат фильма из "Формат" в раскрывающемся меню и сроках, необходимых для готового фильма, затем нажмите кнопку "Экспорт". ПРИМЕЧАНИЕ: покадровой изображения, полученные на одном временной точке каждые 5 минут можно воспроизводить как фильм частотой 10 кадров в секунду, что в 3000 раз быстрее, чем его фактической скорости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы проиллюстрировать технику, лентивирус кодирования EGFP (усиливается зеленый флуоресцентный белок) с метками Сх43 (коннексина 43) или мутировал Сх43 32 был использован, чтобы выразить EGFP с метками белков в клетках и кодировку аденовируса FGFR1DN (фактор роста фибробластов рецептора 1 доминирующим негативное ) был использован, чтобы закрыть FGF сигнализации в клетке 33-35. Через три дня после выделения кардиомиоцитов, выделенные кардиомиоциты были трансдуцированных лентивирусов, чтобы выразит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Первичные кардиомиоциты, выделенные из новорожденных крыс уже давно используются для изучения функций кардиомиоцитов в пробирке. Этот протокол описывает способ выделения неонатальных кардиомиоцитов из крысят с использованием двухэтапный метод фермент пищеварение, сначала переваривания с трипсина O / N при 4 ° С, а затем очищенную коллагеназы. Одним из преимуществ использования очищенной коллагеназы шаг в том, что то же самое класс фермента используется для всех выделений. Таким образом, качество и количество из...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Аленго Ньямайанту и доктора Илзе Тиммерман за их советы по упаковке лентивирусов. Эта работа поддержана грантом Американской кардиологической ассоциации на развитие ученых 10SDG4170137.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 Ножницы для обезглавливанияWPI501749Автоклав перед использованием
1 Тонкие ножницы для изоляции сердца и измельченияWPI14393Автоклав перед использованием
2 тонких щипца (Dumont No. 5)SigmaF6521Автоклав перед использованием
3 Стерилизованная пластиковая посуда 10 смSigmaCLS430165Для изоляции сердца
3,5 см Стеклянное дно Чашки для культурMatTekP35G-1.5-20-CДля окончательного покрытия кардиомиоцитов для будущей визуализации живых клеток. Микропосуда из ибиди является приемлемой альтернативой.
3,5 см Стеклянная посуда для культурыMatTekP35G-0.17-14-CДля TIRF или изображения с высоким разрешением
Раствор этанола, 70% (v/v) в водеSigmaE7148
2% ЖелатинSigmaG1393
1 Стерилизованная пластиковая посуда 10 смSigmaCLS430165Для трипсинизации
Алюминиевая фольгаЛюбая марка
ПарапленкаSigmaP7543
Две 10 см пластиковые чашки для культивирования клетокSigmaCLS430165Для выбора
АвтопипеткаDrummond Scientific4-000-300Для растирания
Клеточный счетчик
Целлограф, автоматический клеточный счетчикnexcelomДля проверки и подсчета клеток
Микроскоп и гематоцитометрЛюбая маркаДля проверки и подсчета клеток
Трипановый синий раствор, 0,4%инвитроген15250-061
CO<суб>2 инкубаторSanyoMCO-19AIC
Инкубационный орбитальный шейкерSigmaZ673129Для встряхивания сердечной ткани коллагеназой при 37 °°; C при 170-200 об/мин
10 мг/мл BrdU растворBD Pharmingen550891
DMEM, с высоким содержанием глюкозыinvitrogen41965039Смешайте среду, как указано в протоколе, и согрейте перед применением
MEMinvitrogen31095029Смешайте среду, как указано в протоколе, и согрейте перед использованием
Фетальная бычья сывороткаinvitrogen26140079
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)invitrogen15140-122
Секция 2 Лентивирусная трансдукция
3 Упаковка плазмид
pMDLg/pRREAddgene12251
pRSV-RevAddgene12253
pMD2.GAddgene12259
Вектор переноса лентивируса, pLVX-IRES-PuroClontech632183
Opti-MEM (бессывороточная среда)инвитроген31985070
реагент
полиэтиленимин" Max", (МВт 40 000) - высокопотенциальная линейная PEI (эквивалентна 25 000 МВт в свободной базовой форме) Polysciences24765-2Может быть заменен на X-tremeGENE 9 от Roche
X-tremeGENE 9Roche6365779001заменителем PEI в качестве реагента для трансфекции
ХлорохинSigmaC6628Растворите в воде и получите 100 мМ исходный раствор. Ингибирование эндосомального закисления может быть достигнуто с помощью 10-100 мкм; М Хлорохин.
HEPESSigmaH3375
10 мл шприц Luer-Lok, стерилизованныйBD309604
0,45 шт; m фильтрыSigmaF8677Используйте только фильтры из ацетата целлюлозы или полиэфирсульфона (PES) (с низким связыванием белка). Не используйте нитроцеллюлозные фильтры. Нитроцеллюлоза связывает поверхностные белки на чечевичной оболочке и разрушает вирус.
Гексадиметринабромид SigmaH9268Растворите в воде и сделайте 8 мг/мл стокового раствора, затем отфильтруйте его для стерилизации.
Полиэтиленгликоль 6,000Sigma81260
Хлорид натрияSigmaS9888
Гидроксид натрияSigmaS5881
Section 3 Аденовирусная
HEK 293T клеткиATCCCRL-11268
Некоторые 10 см Чашки для клеточной культурыSigmaCLS430165
96-луночный микропланшет с крышкой, плоское дно, культура тканей, стерильнаяBD Falcon353072Для титрования
Многоканальная пипетка, 10-100 μ l, 8-канальныйeppendorf3122 000.035
Раздел 4 Визуализация
Вращающийся диск конфокальная микроскопияPerkinElmerL7267000
Камера с регулируемой температуройЛюбая маркаДля поддержания температуры на уровне 37 °°; C
A CO2 экологическая системаЛюбая маркаОпционально для поддержания оптимальной концентрации CO<<
sub>>2<> Независимая среда, без глутаминаinvitrogen18045-054   Для длительной цейтраферной съемки
DMEM, высокий уровень глюкозы, HEPES, без фенола, красныйинвитроген21063-029Для длительной покадровой визуализации
для трансфекциитрансдукцияживых клеток

Ссылки

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31 (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28 (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79 (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32 (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. , 264-573 (1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Аденовирусная трансдукциятайм-лапс визуализацияпротокол изоляции клетокбелок с меткой EGFPдоминантно-негативный FGFRпланшеты со стекнианным дномсистема автофокусировки
Живых изображений сотовый первичных Rat неонатальных кардиомиоцитов После Аденовирусный и Лентивирусов Трансдукция Использование конфокальной вращающийся диск микроскопия
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.