Оценка противогрибковое действие изолированных альвеолярных макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

Альвеолярные макрофаги являются первой линии фагоциты, которые сталкиваются ингаляционных микробы. Макрофаги признать Aspergillus мотивы рецепторами распознавания патогена, глотать и ограничить рост ингаляционных спор (конидий), и инициировать воспалительные реакции. Фагоцитов НАДФН оксидазы преобразует молекулярный кислород к супероксиданиона и вниз по течению реактивных промежуточных кислорода (Rois). Хроническая гранулематозная болезнь (КГД) является наследственным расстройством НАДФН-оксидазы характеризуется тяжелых бактериальных и грибковых инфекций и чрезмерными воспалительных реакций.

Хотя NADPH оксидаза имеет решающее значение для нейтрофилов-опосредованной иммунной защиты ^{1 - 3,} важность НАДФН-оксидазы в макрофагах не определена. Предыдущие исследования показали, что альвеолярные макрофаги поглощают и убивают Aspergillus споры, в то время как нейтрофилы главным целевой этап гиф ^5. Тем не менее, были противоречивыми Resulц как на роль НАДФН-оксидазы в макрофагов в борьбе с ростом А. fumigatus споры ^{6, 7.}

Цель этого метода в том, чтобы очертить конкретную роль НАДФН-оксидазы в макрофагах в посредничестве иммунную защиту против А. fumigatus споры. Мы обнаружили, что NADPH оксидазы в альвеолярных макрофагов контролирует рост фагоцитированы А. fumigatus споры ^4. Чтобы наиболее точно смоделировать реакцию хозяина к ингаляционных грибов, мы использовали альвеолярных макрофагов собирают бронхоальвеолярного лаважа с нестимулированных мышей сразу после жертвоприношения. Использование изолированных альвеолярных макрофагов позволило нам сосредоточиться на своей противогрибковой активности в отсутствие других иммунных клеток (например, завербованные нейтрофилов), которые защищают против Aspergillus в естественных условиях. В этом методе, альвеолярных макрофагов окрашивали в естественных условиях до сбора таким образом, чтобы свести к минимуму количество послеуборочной манипуляции. </ Р>

Еще одно преимущество этого протокола является использование GFP-экспрессирующих А. fumigatus штамм. Этот гриб выражает GFP из конидиального этапе через стадию гиф и не имеет необходимость дальнейшего окрашивания. Для получения изображения с более подробно, мы выбрали конфокальной микроскопии, который позволит реконструкцию трехмерных структур из полученных изображений. Трехмерная реконструкция дает возможность различать гифы растет во всем, а не в или через макрофагов. Конидии также может быть точно различают как внутриклеточный против внеклеточного.

Все процедуры, проводимые на животных в этом исследовании были утверждены Комитетом уходу и использованию животных в Roswell Park института рака в общем и отвечает всем требованиям государства, федерального, и Национальные институты медико-санитарных правил.

1. В естественных условиях макрофагов Маркировка

Примечание: PHK26 является липофильным краситель, который будет рассмотрен фагоцитами как в обращении и в тканях при внутривенном введении (IV). PKH26 был использован для маркировки в естественных условиях, чтобы свести к минимуму количество послеуборочной манипуляции макрофагов. PKH-26 имеет то преимущество, стабильно накапливаются в альвеолярных макрофагов в течение длительных периодов. Ожидание 10 дней после введения позволяет урегулирования всех меченых клеток из обращения, оставляя только альвеолярных макрофагов стабильно помечены PKH26 ^{8, 9.} PKH26 является красный флуорохромом, что имеет возбуждение (551 нм) и выбросов (567 нм) характеристики совместимыеродамином или обнаружения фикоэритрин систем. Любая процедура маркировки можно ввести артефакт, в том числе потери жизнеспособности. Однако, так как мы используем тот же подход для маркировки макрофагов в различных генотипов мыши (например, WT против NADPH-оксидаза-дефицитных), эффекты этих артефактов будет равномерным.

1. Развести исходного раствора PKH26 (1 × 10 ^-3 М в этаноле) 1:05 в разбавителе C, предоставленной изготовителем.
2. Нагрузка 100 мкл разбавленного PKH26 в 1/2 мл инсулиновый шприц (29 G х 1/2 ") для каждой мыши.
3. Администрирование для мышей внутривенной инъекции (либо в хвостовую вену или ретро орбитальной) минимум за 10 дней до сбора урожая.

2. Сбор альвеолярных макрофагов по бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ)

Количество мышей, чтобы использовать для эксперимента могут варьироваться. Типичный выход из нестимулированной мыши находится в диапазоне 3-5 × 10 ⁵ альвеолярных макрофагов, однако это число может значительно варьироваться барельефред от таких факторов, как размер мыши, опыта человека, выполняющего промывание, и количество инстилляции промывной жидкости и объемом отводимой из легких. В этом протоколе легких промывание выполняется с закрытой грудной полости, которые наряду с повторными 1 мл промываний помогает увеличить доходность клеток.

1. Усыпить мышь путем введения смертельную дозу анестетика AVERTIN (12,5 мг) внутрибрюшинно (IP) с использованием асептических условий для поддержания стерильного раствора.
2. Спрей мышь полностью с 70% этанола.
3. Удалить кожу по передней части животного подвергая грудную клетку (рис. 1А).
   1. Сделайте небольшой надрез в коже только под диафрагмой.
   2. Вставьте палец в разрез и потяните кожу от черепной конце животного (рис. 1А).
   3. Поднимите слегка по голове, расширяя брюшной стороне шеи (рис. 1А).
4. Вырезать небольшое отверстие через грудную клеткув правой стороне грудной клетки выкачать легкие, а также позволит визуализацию легких во время следующих шагов.
5. Найдите трахею, и тщательно отсечь окружающие ткани.
   1. Удалите слюнных желез, грудинно-подъязычный мышцы и гортань, и т.д. с изогнутыми щипцами.
   2. Осторожно поднимите с изогнутым пинцетом и отрезать ножницами тонкую ткань, покрывающую трахею (адвентиции) выявления основной кольцами структуру хряща.
6. Вставьте катетер в трахею.
   1. Использование изогнутых щипцов, место шва за (от спины к) трахеи и тянуть длину 10 см через отверстие.
   2. Начиная выше перстневидным (утолщенной кольца хряща) тщательно направлять 22 г катетер вниз трахеи остановки, где трахея исчезает за грудиной.
   3. Плотно связать нить вокруг трахеи и катетера для плотного прилегания. Удалить иглу из катетера.
7. Соберите 4-ходовой кран.
   1. Заполнятьодин 6 мл шприц с DPBS, 1% FBS и приложить к 4-ходовой кран, как указано на рисунке 1b.
   2. Прикрепите пустую 6 мл шприц по указанной позиции на 4-ходовой кран (рис. 1В).
   3. Прикрепите открытый порт на 4-ходовой кран к катетера (рис. 1В). Будьте осторожны, чтобы не сместить катетер из трахеи.
8. Сбор промывной жидкости из легких.
   Примечание: Следователи могут решить использовать более низкие объемы промывной жидкости, чтобы свести к минимуму возможность повреждения ткани. Важно, что такой же подход применяться последовательно во всех группах мышей.
   1. Поверните ручку на кран так пустой шприц закрыт и медленно вдохнуть ~ 1 мл DPBS, 1% FBS раздувать легкие. Соблюдайте инфляции легких через разрез дырок в шаге 2.4.
   2. Будьте осторожны, не overinflate легкие.
   3. Поверните ручку на кран так, чтобы полный шприц закрыт, и тщательно снять грипп ID из легких.
   4. Соблюдайте легкие выкачать через разрез дырок в шаге 1.4. Катетер может должны быть перемещены немного назад или вперед, чтобы получить хорошую ничью. Соблюдайте особую осторожность, чтобы сохранить катетер в трахею.
   5. Повторяйте шаги 2.8.1-2.8.4 5-6х, пока все DPBS, 1% FBS была введена и выведены из легких. Примечание: восстановление легких жидкости не будет 100% от вводимой жидкости.
9. Пустой шприц с промывной жидкости в 50 мл коническую трубку. Сохранить клетки при комнатной температуре.
10. Гранул клетки центрифугированием при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и слейте супернатант. Это при желании могут быть сохранены для анализа цитокинов.
11. Ресуспендируют клеток в 1-5 мл RPMI 1640 с 10% FBS и рассчитывать на гемоцитометре. В нестимулированной мыши,> 95% клеток, полученных путем BAL, как ожидается, макрофаги, которые могут быть подтверждены цитологии.

3. Культивирование и сбор урожая Гриб

1. Тарелка конидии из fumigatus штамма Aspergillus, выражающей GFP на Сабуро мозга и сердца инфузии (BHI) скошенный агар с хлорамфеникол (0,05 г / л) и гентамицин (0,5 г / л).
2. Инкубируют в темноте в течение неплотно закрывают 7 до 10 дней при комнатной температуре.
3. Урожай конидии по стиральной уклоном с 10 мл 0,01% Tween 20 в DPBS. Слегка очистить грибок с stripette, чтобы ослабить. Промыть наклонной несколько раз увеличить выход.
4. Pass конидий суспензии через сито 100 мкм клеток в 50 мл коническую.
5. Гранулы конидии центрифугированием при 400 х г в течение 10 мин.
6. Ресуспендируйте конидии в 50 мл DPBS и считать с помощью гемоцитометра.
7. Мыть два раза с DPBS и разбавляют до требуемых концентрацийцентрации.

4. Грибковые вызов и конфокальной микроскопии

Чтобы исследовать роль макрофагов НАДФН-оксидазы в защите хозяина, способность изолированных альвеолярных макрофагов мышей трех генотипов по контролю рост фагоцитированы Aspergillus спор оценивали. Генотипы используемые в этом исследовании, включают; 1) мышей дикого типа, 2) Ncf1 * / * Mn-мыши с природной Ncf1 мутации (Ncf1 кодирует p47 ^phox, требуемом компоненте фагоцитов НАДФН-оксидазы), оставляя им НАДФН оксидазы недостаточным, и 3) Ncf1 * / * Mn + трансгенных мышей (MN обозначает трансген, несущего дикого типа Ncf1 под контролем промотора человеческого CD68), где NADPH-оксидаза активность была восстановленного в популяции моноцитов / макрофагов ^{10, 11.}

Конфокальной микроскопии лучше всего подходит для этого анализа в связи с наличиеми рост не фагоцитированы конидий на слайдах. Конфокальный микроскоп позволит для визуализации отдельных плоскостях в пределах Z-оси, и позволяют дифференцировать гриба растущего вокруг, а не внутри макрофагов. Все конфокальные изображения получены с помощью масла погружения объектив 63x. Z-стеки приобретаются с электронным коэффициент увеличения 2,5. Толщина Z-стека определяется с использованием DAPI и изображения в светлом поле, чтобы определить верхний и нижней части поля. Z-стеки колебалась от 14 до 24 мкм с отдельными кусочками толщиной ~ 1 мкм. Для количественного макрофагов, одиночные сканы 1X электронного масштабирования проводились на 10 полей, на генотип. Интактные макрофаги были определены на основе PKH26 и DAPI окрашивания мембраны и ядра соответственно. Конидии были определены на основе FITC выражения и яркого поля изображения.

1. Подготовить стерильные покровные и тарелки
   1. Под Кабинетом биологической безопасности, смочите 22 х 22 мм покровные стекла в 70% этанол в течение 5-10 мин.
   2. Промыть покровные в стерильной PBS.
   3. Использование стерильного пинцета, осторожно поместить одну покровное в нижней части каждой лунки стерильного упакованного отдельно 6-луночный планшет.
2. Семя ~ 1 х 10 ⁶ собирают PKH26 помечены альвеолярных макрофагов, взвешенные в 300 мкл RPMI 1640, 10% FBS на каждую покровное. Точное количество может варьироваться в зависимости от урожайности.
3. Разрешить макрофагов придерживаться путем инкубации при 37 ° С с 5% CO ₂ в течение ночи.
4. На следующее утро, добавить ~~~HEAD=iobj 1 х 10 ⁷ GFP-экспрессирующих A. fumigatus конидии суспендируют в 100 мкл предварительно нагретого (37 ° C) RPMI 1640, 10% FBS.
5. Вернуться пластину до 37 ° С инкубатор с 5% CO _2.
6. Клетки должны быть закреплены в течение минимум 2 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° С. Через 3, 7 и 14 час исправления клеток добавлением равного объема 2% формальдегида в каждую лунку (конечная концентрация 1% формальдегид). Место пластины дляточки в начале времени при 4 ° С в течение ночи. Для окончательного момент времени (14 ч), зафиксировать клетки при комнатной температуре в течение 2 часов.
7. После фиксации аккуратно удалить покровные с помощью щипцов и промойте в DPBS.
8. Удаление избытка жидкости, поместив край покровного стекла в сложенном Kimwipe.
9. Применить 6 флуоресценции мкл монтажную среду с DAPI в предметное стекло микроскопа.
10. Lay один край покровного стекла на предметном стекле и осторожно падение с стороне клеточной вниз в монтажную среду. Монтаж среду будет распространяться и образуют ровный слой под покровное. Там нет необходимости нажимать на покровное.
11. Уплотнение края покровного стекла с прозрачным лаком для ногтей и дайте высохнуть на воздухе.
12. Магазин не подготовлены слайды в слайд-коробки (защищенном от света месте) при комнатной температуре до готовности анализировать с помощью конфокальной микроскопии.

Сбор альвеолярных макрофагов на BAL из стимулированных мышей приведет к чистота> 95% населения на основе цитологии. 3 и 7 ч (рис. 2) моменты времени предшествовать этап гиф роста грибов и позволяют для сравнения эффективности фагоцитарной конидий между генотипами. Момент времени 14 ч, где генотипы можно сравнить с точки зрения способности ингибировать переход фагоцитированы конидий к ткани-инвазивной стадии гиф (рис. 3). Неповрежденными макрофагов может быть идентифицирован по конфокальной микроскопии на основе PKH26 и DAPI окрашивания мембраны и ядра, соответственно (фиг. 2 и 3). Конидии и гифы определены на основе GFP выражения (рис. 2 и 3).

iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Анатомический Направленные Ссылки и 4-ходовой кран.) Анатомические направленного ссылки для мыши показаны. Cranial в направлении головы, в то время как хвостовой находится в направлении хвоста. Брюшная сторона четвероногого является к животу или нижней поверхности животного, в то время как спинной стороны обращена к задней или верхней поверхности животного. B) 4-позиционный кран имеет три LUER соединения и ручкой, что вращается 360 °, чтобы направить поток жидкости через кран. Размещение пустой шприц, полный шприц и катетер указаны. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2. Фагоцитоз А. fumigatus споры похожа между генотипами на 7 часов. Чтобы оценить способность изолированных альвеолярных макрофагов с NADPH оксидазы деятельности ограничить рост фагоцитированы конидий, (А) дикого типа, (Б) Ncf1 * / * Mn + и (С ) Ncf1 * / * Mn - мышам вводили внутривенно PKH26. Альвеол рные макрофаги собирали BAL через 10 дней и высевают с конидий GFP-экспрессирующих А. fumigatus. Клетки фиксировали через 3, 7 и 14 ч после добавления конидий. На 3 (данные не показаны) и 7 ч и общее количество макрофагов и макрофагов с ≥ 1 фагоцитированы конидии (стрелки) были подобны среди этих трех генотипов, что отражает аналогичную эффективность фагоцитоза. Интактные макрофаги определены на основе PKH26 (красный) и DAPI (синий) окрашивания мембраны ай ядра соответственно. Флуоресцентные изображения из одного Z-плоскости накладываются с яркой поля изображения. Яркое изображение поля состоит из света, прошедшего через весь образец и поэтому, когда перекрываются на флуоресцентном Z-равнине позволяет визуализировать клеток и конидий в пределах всего Z-стека. Шкала бар, 19 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3. Макрофагов NADPH-оксидаза требуется, чтобы контролировать рост A. . fumigatus споры конфокальной микроскопии (A, D) дикого типа, (В, Е) Ncf1 * / * Mn + и (C, F) Ncf1 * / * Мп - < / SUP> альвеолярных макрофагов в 14 часов после посева с GFP + A. fumigatus конидии. Интактные макрофаги определены на основе PKH26 (красный) и DAPI (синий) окрашивание мембран и ядер, соответственно. Твердые стрелки показывают нетронутыми макрофаги как минимум с одним фагоцитирующих конидий и полые стрелки указывают на гиф. Многочисленные AMs с по меньшей мере 1 фагоцитированы конидии наблюдались с дикого типа и Ncf1 * / * Mn + клеток, но не с НАДФН-оксидазы-дефицитных клеток. GFP сигнал в гиф был переменная основана на плоскости г стеками показаны на рисунке. AC) флуоресцентные изображения из одного Z-плоскости с яркой поля изображения позволяют наблюдать клетки и гифы в пределах всего Z-стека. DF) Флуоресцентные изображения из одного Z-плоскости без ярком фоне поля позволяют идентифицировать клетки, но не пространственное соотношение клеток и грибов в разных Z-плоскостей. Шкала бар, 19 мкм..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Авторы не имеют ничего раскрывать.