Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка противогрибковое действие изолированных альвеолярных макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

10.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51678

⸱

9 июля 2014 г.

 ,  , 
1Department of Medicine, Roswell Park Cancer Institute, 2Department of Medicine, School of Medicine and Biomedical Sciences, University of Buffalo

В этой статье

Краткое содержание

Метод оценки способности изолированных мыши альвеолярных макрофагов контролировать рост фагоцитирующих спор Aspergillus с помощью конфокальной микроскопии.

Аннотация

Легких является интерфейсом, где клетки-хозяева регулярно подвергается микробов и микробных продуктов. Альвеолярные макрофаги являются первой линии фагоциты, которые сталкиваются ингаляционных грибки и другие микробы. Макрофаги и другие иммунные клетки распознают Aspergillus мотивы рецепторами распознавания патогена и инициировать вниз по течению воспалительных реакций. Фагоцитов НАДФН оксидазы генерирует реактивные промежуточные кислорода (Rois) и имеет решающее значение для защиты организма. Хотя NADPH оксидаза имеет решающее значение для нейтрофилов-опосредованной иммунной защиты 1 - 3, важность НАДФН-оксидазы в макрофагах не определена. Целью данного исследования было очертить конкретную роль НАДФН-оксидазы в макрофагах в посредничестве иммунную защиту против А. fumigatus. Мы обнаружили, что NADPH оксидазы в альвеолярных макрофагов контролирует рост фагоцитированы А. fumigatus споры 4. Здесь мы опишем метод для оценки способности мышьlveolar макрофаги (AMS), чтобы контролировать рост фагоцитированы Aspergillus спор (конидий). Альвеолярные макрофаги окрашивают в естественных условиях и десять дней спустя изолированы от мышей бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Макрофаги высевали на покровные стекла, затем вносят затравку зеленого флуоресцентного белка (GFP), экспрессирующих A. fumigatus споры. В определенные моменты, клетки фиксируют и количество интактных макрофагов с фагоцитирующих спор оценивают с помощью конфокальной микроскопии.

Введение

Альвеолярные макрофаги являются первой линии фагоциты, которые сталкиваются ингаляционных микробы. Макрофаги признать Aspergillus мотивы рецепторами распознавания патогена, глотать и ограничить рост ингаляционных спор (конидий), и инициировать воспалительные реакции. Фагоцитов НАДФН оксидазы преобразует молекулярный кислород к супероксиданиона и вниз по течению реактивных промежуточных кислорода (Rois). Хроническая гранулематозная болезнь (КГД) является наследственным расстройством НАДФН-оксидазы характеризуется тяжелых бактериальных и грибковых инфекций и чрезмерными воспалительных реакций.

Хотя NADPH оксидаза имеет решающее значение для нейтрофилов-опосредованной иммунной защиты 1 - 3, важность НАДФН-оксидазы в макрофагах не определена. Предыдущие исследования показали, что альвеолярные макрофаги поглощают и убивают Aspergillus споры, в то время как нейтрофилы главным целевой этап гиф 5. Тем не менее, были противоречивыми Resulц как на роль НАДФН-оксидазы в макрофагов в борьбе с ростом А. fumigatus споры 6, 7.

Цель этого метода в том, чтобы очертить конкретную роль НАДФН-оксидазы в макрофагах в посредничестве иммунную защиту против А. fumigatus споры. Мы обнаружили, что NADPH оксидазы в альвеолярных макрофагов контролирует рост фагоцитированы А. fumigatus споры 4. Чтобы наиболее точно смоделировать реакцию хозяина к ингаляционных грибов, мы использовали альвеолярных макрофагов собирают бронхоальвеолярного лаважа с нестимулированных мышей сразу после жертвоприношения. Использование изолированных альвеолярных макрофагов позволило нам сосредоточиться на своей противогрибковой активности в отсутствие других иммунных клеток (например, завербованные нейтрофилов), которые защищают против Aspergillus в естественных условиях. В этом методе, альвеолярных макрофагов окрашивали в естественных условиях до сбора таким образом, чтобы свести к минимуму количество послеуборочной манипуляции.

Еще одно преимущество этого протокола является использование GFP-экспрессирующих А. fumigatus штамм. Этот гриб выражает GFP из конидиального этапе через стадию гиф и не имеет необходимость дальнейшего окрашивания. Для получения изображения с более подробно, мы выбрали конфокальной микроскопии, который позволит реконструкцию трехмерных структур из полученных изображений. Трехмерная реконструкция дает возможность различать гифы растет во всем, а не в или через макрофагов. Конидии также может быть точно различают как внутриклеточный против внеклеточного.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, проводимые на животных в этом исследовании были утверждены Комитетом уходу и использованию животных в Roswell Park института рака в общем и отвечает всем требованиям государства, федерального, и Национальные институты медико-санитарных правил.

1. В естественных условиях макрофагов Маркировка

Примечание: PHK26 является липофильным краситель, который будет рассмотрен фагоцитами как в обращении и в тканях при внутривенном введении (IV). PKH26 был использован для маркировки в естественных условиях, чтобы свести к минимуму количество послеуборочной манипуляции макрофагов. PKH-26 имеет то преимущество, стабильно накапливаются в альвеолярных макрофагов в течение длительных периодов. Ожидание 10 дней после введения позволяет урегулирования всех меченых клеток из обращения, оставляя только альвеолярных макрофагов стабильно помечены PKH26 8, 9. PKH26 является красный флуорохромом, что имеет возбуждение (551 нм) и выбросов (567 нм) характеристики совместимыеродамином или обнаружения фикоэритрин систем. Любая процедура маркировки можно ввести артефакт, в том числе потери жизнеспособности. Однако, так как мы используем тот же подход для маркировки макрофагов в различных генотипов мыши (например, WT против NADPH-оксидаза-дефицитных), эффекты этих артефактов будет равномерным.

  1. Развести исходного раствора PKH26 (1 × 10 -3 М в этаноле) 1:05 в разбавителе C, предоставленной изготовителем.
  2. Нагрузка 100 мкл разбавленного PKH26 в 1/2 мл инсулиновый шприц (29 G х 1/2 ") для каждой мыши.
  3. Администрирование для мышей внутривенной инъекции (либо в хвостовую вену или ретро орбитальной) минимум за 10 дней до сбора урожая.

2. Сбор альвеолярных макрофагов по бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ)

Количество мышей, чтобы использовать для эксперимента могут варьироваться. Типичный выход из нестимулированной мыши находится в диапазоне 3-5 × 10 5 альвеолярных макрофагов, однако это число может значительно варьироваться барельефред от таких факторов, как размер мыши, опыта человека, выполняющего промывание, и количество инстилляции промывной жидкости и объемом отводимой из легких. В этом протоколе легких промывание выполняется с закрытой грудной полости, которые наряду с повторными 1 мл промываний помогает увеличить доходность клеток.

  1. Усыпить мышь путем введения смертельную дозу анестетика AVERTIN (12,5 мг) внутрибрюшинно (IP) с использованием асептических условий для поддержания стерильного раствора.
  2. Спрей мышь полностью с 70% этанола.
  3. Удалить кожу по передней части животного подвергая грудную клетку (рис. 1А).
    1. Сделайте небольшой надрез в коже только под диафрагмой.
    2. Вставьте палец в разрез и потяните кожу от черепной конце животного (рис. 1А).
    3. Поднимите слегка по голове, расширяя брюшной стороне шеи (рис. 1А).
  4. Вырезать небольшое отверстие через грудную клеткув правой стороне грудной клетки выкачать легкие, а также позволит визуализацию легких во время следующих шагов.
  5. Найдите трахею, и тщательно отсечь окружающие ткани.
    1. Удалите слюнных желез, грудинно-подъязычный мышцы и гортань, и т.д. с изогнутыми щипцами.
    2. Осторожно поднимите с изогнутым пинцетом и отрезать ножницами тонкую ткань, покрывающую трахею (адвентиции) выявления основной кольцами структуру хряща.
  6. Вставьте катетер в трахею.
    1. Использование изогнутых щипцов, место шва за (от спины к) трахеи и тянуть длину 10 см через отверстие.
    2. Начиная выше перстневидным (утолщенной кольца хряща) тщательно направлять 22 г катетер вниз трахеи остановки, где трахея исчезает за грудиной.
    3. Плотно связать нить вокруг трахеи и катетера для плотного прилегания. Удалить иглу из катетера.
  7. Соберите 4-ходовой кран.
    1. Заполнятьодин 6 мл шприц с DPBS, 1% FBS и приложить к 4-ходовой кран, как указано на рисунке 1b.
    2. Прикрепите пустую 6 мл шприц по указанной позиции на 4-ходовой кран (рис. 1В).
    3. Прикрепите открытый порт на 4-ходовой кран к катетера (рис. 1В). Будьте осторожны, чтобы не сместить катетер из трахеи.
  8. Сбор промывной жидкости из легких.
    Примечание: Следователи могут решить использовать более низкие объемы промывной жидкости, чтобы свести к минимуму возможность повреждения ткани. Важно, что такой же подход применяться последовательно во всех группах мышей.
    1. Поверните ручку на кран так пустой шприц закрыт и медленно вдохнуть ~ 1 мл DPBS, 1% FBS раздувать легкие. Соблюдайте инфляции легких через разрез дырок в шаге 2.4.
    2. Будьте осторожны, не overinflate легкие.
    3. Поверните ручку на кран так, чтобы полный шприц закрыт, и тщательно снять грипп ID из легких.
    4. Соблюдайте легкие выкачать через разрез дырок в шаге 1.4. Катетер может должны быть перемещены немного назад или вперед, чтобы получить хорошую ничью. Соблюдайте особую осторожность, чтобы сохранить катетер в трахею.
    5. Повторяйте шаги 2.8.1-2.8.4 5-6х, пока все DPBS, 1% FBS была введена и выведены из легких. Примечание: восстановление легких жидкости не будет 100% от вводимой жидкости.
  9. Пустой шприц с промывной жидкости в 50 мл коническую трубку. Сохранить клетки при комнатной температуре.
  10. Гранул клетки центрифугированием при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и слейте супернатант. Это при желании могут быть сохранены для анализа цитокинов.
  11. Ресуспендируют клеток в 1-5 мл RPMI 1640 с 10% FBS и рассчитывать на гемоцитометре. В нестимулированной мыши,> 95% клеток, полученных путем BAL, как ожидается, макрофаги, которые могут быть подтверждены цитологии.

3. Культивирование и сбор урожая Гриб

"> Aspergillus fumigatus используется в данном протоколе выражает GFP на всех этапах его жизненного цикла:. Споры, germlings и гифы Это грибковая штамм предоставлены доктором Марго Мур, Университета Саймона Фрейзера, Барнаби, Британская Колумбия, Канада.

  1. Тарелка конидии из fumigatus штамма Aspergillus, выражающей GFP на Сабуро мозга и сердца инфузии (BHI) скошенный агар с хлорамфеникол (0,05 г / л) и гентамицин (0,5 г / л).
  2. Инкубируют в темноте в течение неплотно закрывают 7 до 10 дней при комнатной температуре.
  3. Урожай конидии по стиральной уклоном с 10 мл 0,01% Tween 20 в DPBS. Слегка очистить грибок с stripette, чтобы ослабить. Промыть наклонной несколько раз увеличить выход.
  4. Pass конидий суспензии через сито 100 мкм клеток в 50 мл коническую.
  5. Гранулы конидии центрифугированием при 400 х г в течение 10 мин.
  6. Ресуспендируйте конидии в 50 мл DPBS и считать с помощью гемоцитометра.
  7. Мыть два раза с DPBS и разбавляют до требуемых концентрацийцентрации.

4. Грибковые вызов и конфокальной микроскопии

Чтобы исследовать роль макрофагов НАДФН-оксидазы в защите хозяина, способность изолированных альвеолярных макрофагов мышей трех генотипов по контролю рост фагоцитированы Aspergillus спор оценивали. Генотипы используемые в этом исследовании, включают; 1) мышей дикого типа, 2) Ncf1 * / * Mn-мыши с природной Ncf1 мутации (Ncf1 кодирует p47 phox, требуемом компоненте фагоцитов НАДФН-оксидазы), оставляя им НАДФН оксидазы недостаточным, и 3) Ncf1 * / * Mn + трансгенных мышей (MN обозначает трансген, несущего дикого типа Ncf1 под контролем промотора человеческого CD68), где NADPH-оксидаза активность была восстановленного в популяции моноцитов / макрофагов 10, 11.

Конфокальной микроскопии лучше всего подходит для этого анализа в связи с наличиеми рост не фагоцитированы конидий на слайдах. Конфокальный микроскоп позволит для визуализации отдельных плоскостях в пределах Z-оси, и позволяют дифференцировать гриба растущего вокруг, а не внутри макрофагов. Все конфокальные изображения получены с помощью масла погружения объектив 63x. Z-стеки приобретаются с электронным коэффициент увеличения 2,5. Толщина Z-стека определяется с использованием DAPI и изображения в светлом поле, чтобы определить верхний и нижней части поля. Z-стеки колебалась от 14 до 24 мкм с отдельными кусочками толщиной ~ 1 мкм. Для количественного макрофагов, одиночные сканы 1X электронного масштабирования проводились на 10 полей, на генотип. Интактные макрофаги были определены на основе PKH26 и DAPI окрашивания мембраны и ядра соответственно. Конидии были определены на основе FITC выражения и яркого поля изображения.

  1. Подготовить стерильные покровные и тарелки
    1. Под Кабинетом биологической безопасности, смочите 22 х 22 мм покровные стекла в 70% этанол в течение 5-10 мин.
    2. Промыть покровные в стерильной PBS.
    3. Использование стерильного пинцета, осторожно поместить одну покровное в нижней части каждой лунки стерильного упакованного отдельно 6-луночный планшет.
  2. Семя ~ 1 х 10 6 собирают PKH26 помечены альвеолярных макрофагов, взвешенные в 300 мкл RPMI 1640, 10% FBS на каждую покровное. Точное количество может варьироваться в зависимости от урожайности.
  3. Разрешить макрофагов придерживаться путем инкубации при 37 ° С с 5% CO 2 в течение ночи.
  4. На следующее утро, добавить ~~~HEAD=iobj 1 х 10 7 GFP-экспрессирующих A. fumigatus конидии суспендируют в 100 мкл предварительно нагретого (37 ° C) RPMI 1640, 10% FBS.
  5. Вернуться пластину до 37 ° С инкубатор с 5% CO 2.
  6. Клетки должны быть закреплены в течение минимум 2 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° С. Через 3, 7 и 14 час исправления клеток добавлением равного объема 2% формальдегида в каждую лунку (конечная концентрация 1% формальдегид). Место пластины дляточки в начале времени при 4 ° С в течение ночи. Для окончательного момент времени (14 ч), зафиксировать клетки при комнатной температуре в течение 2 часов.
  7. После фиксации аккуратно удалить покровные с помощью щипцов и промойте в DPBS.
  8. Удаление избытка жидкости, поместив край покровного стекла в сложенном Kimwipe.
  9. Применить 6 флуоресценции мкл монтажную среду с DAPI в предметное стекло микроскопа.
  10. Lay один край покровного стекла на предметном стекле и осторожно падение с стороне клеточной вниз в монтажную среду. Монтаж среду будет распространяться и образуют ровный слой под покровное. Там нет необходимости нажимать на покровное.
  11. Уплотнение края покровного стекла с прозрачным лаком для ногтей и дайте высохнуть на воздухе.
  12. Магазин не подготовлены слайды в слайд-коробки (защищенном от света месте) при комнатной температуре до готовности анализировать с помощью конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сбор альвеолярных макрофагов на BAL из стимулированных мышей приведет к чистота> 95% населения на основе цитологии. 3 и 7 ч (рис. 2) моменты времени предшествовать этап гиф роста грибов и позволяют для сравнения эффективности фагоцитарной конидий между генотипами. Момент времени 14 ч, где генотипы можно сравнить с точки зрения способности ингибировать переход фагоцитированы конидий к ткани-инвазивной стадии гиф (рис. 3). Неповрежденными макрофагов может быть идентифицирован по ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Используя этот подход для экс естественных анализа противогрибковой активности макрофагов вместе с в естественных грибковой вызов, мы ранее показали, что NADPH оксидазы в макрофагах играет важную роль в защите от А. fumigatus 4. Использование изолированных альвеолярных макрофагов позволяет нам сосредоточиться на их противогрибковой активности в отсутствие других иммунных клеток (например, на работу нейтрофилы), которые защищают против Aspergillus в естественных условиях...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Грант R01AI079253 (к BHS) и Национальным институтом рака онкологический центр поддержки Грант CA016056 в Roswell Park института рака.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PKH26 Набор для красного флуоресцентного клеточного линкера для общего мечения клеточных мембранSigmaPKH26GL-1KT
2,2,2 ТрибромэтанолSigmaT48402Используется для изготовления авертинаАнестетик
2-метил-2-бутанолSigmaA-1685Используется для изготовления авертинаАнестетик
Дульбекко' s Фосфатно-солевой буфер (без кальция и магния)Corning21-031-CV
NH4ClSigmaA0171Используется для изготовления буфера для лизиса эритроцитов ACK
KHCO3SigmaP91444Используется для изготовления буфера для лизиса эритроцитов ACK
EDTASigmaE6758Используется для изготовления буфера для лизиса эритроцитов ACK
22 G x 1,00 дюйма внутривенно. катетерBD381523Insyte Autoguard Winged
Инсулин шприцы
6 мл Шприцы
4-ходовой стопкранFisher Scientific50-700-077
Шовная нить
50 мл конические центрифужные пробирки
марлевые губки (4 дюйма квадратные)
RPMI 1640 с L-глутаминомCorning10-040-CV
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаHycloneSH30396.03Термоинактивированный
Hema 3 Набор красителейFisher Scientific22-122-911
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Агар с хлорамфениколом и наклонным гентамициномBD297252
Aspergillus fumigatous штамм, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок, предоставлен доктором Марго Мур, Университет Саймона Фрейзера, Бернаби, Британская Колумбия, Канада
100; m Клеточные фильтрыBD Falcon64753-00
Ножницы
Щипцы
Шкаф биологической безопасности II класса
Sorval ST40 Центрифуга с качающимся ведром Ротор
Leica DM1000 Световой микроскоп
Гемоцитометр
Центрифуга Cytospin 2Thermo Scientific
Инкубатор для клеточных культур37° С, 5%  CO2
22 x 22 мм микрозащитное стеклоVWR48366-227стеклянные покровные стекла
6-луночные планшеты для клеточных культурCorning3506
10% нейтральный буферный формалинVWRBDH0502-1LP
Vectashield монтажная среда с DAPIVector LaboratoriesH-1200
Leica TCS SP2 система с лазерным сканером точекУстановлен на флуоресцентный микроскоп DMIRE2
Leica DM1000

Ссылки

  1. Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
  2. Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
  3. Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
  4. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
  5. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
  6. Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
  7. Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
  8. Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
  9. Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
  10. Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
  11. Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
  12. Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
  13. Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
  14. García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
  15. Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
  16. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
  17. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
  18. Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Бронхоальвеолярный лаважНАДФН-оксидазаAspergillus fumigatusGFP-экспрессирующие спорыоценка фагоцитозамаркировка PKH 26контроль роста грибкаиммунитет легких мыши
Оценка противогрибковое действие изолированных альвеолярных макрофагов с помощью конфокальной микроскопии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.