Методическая статья
Способ быстрого выделения митохондрий из млекопитающих биопсии тканей описан. Печень крысы или скелетные мышечные препараты гомогенизировали с коммерческой диссоциатора ткани и митохондрии были изолированы с помощью дифференциальной фильтрацией через нейлоновое сито фильтров. Митохондриальная время изоляция <30 мин по сравнению с 60 - 100 мин с использованием альтернативных методов.
Ранее описанные способы митохондриальные выделения с использованием дифференциального центрифугирования и / или центрифугирование в градиенте Ficoll требуют от 60 до 100 мин, чтобы закончить. Опишем способ быстрого выделения митохондрий от биопсии млекопитающих с использованием коммерческого диссоциатор тканей и дифференциальный фильтрации. В этом протоколе, руководство гомогенизации заменяется стандартизированной цикла гомогенизации ткани диссоциатора в. Это позволяет единообразно и последовательно гомогенизации ткани, которая не легко достигается с ручным гомогенизации. После диссоциации ткани, гомогенат фильтруют через нейлоновое сито фильтров, которые устраняют повторяющиеся стадии центрифугирования. В результате, митохондриальная изоляция может быть выполнена менее чем за 30 мин. Этот протокол изоляция производится около 2 х 10 10 жизнеспособных и дыхания компетентные митохондрии от 0,18 ± 0,04 г (сырого веса) образца ткани.
Существуют Митохондрии в каждой клетке тела, кроме эритроцитов и участвуют в большом количестве важных клеточных и метаболических процессов 1-4. Из этих многих функций, повреждение митохондрий может иметь пагубные последствия 3. Для исследования митохондриальной функции и дисфункции несколько митохондриальных методы изоляции были описаны. Самые ранние опубликованные описания митохондриальной даты изоляции до 1940 5-8. Первый документально показано, попытка митохондриальной изоляцию путем измельчения ткани печени в ступке с последующим центрифугированием в солевом растворе с низкой скоростью 5,8. Позже, другие группы расшире....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Подготовка
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Фигура изложением процедурные шаги в изоляции митохондрий с помощью ткани диссоциации и дифференциальное фильтрацию показано на рисунке 1. Всего процессуальное время меньше 30 минут.
Образцы тканей были получены с использованием 6 мм биопсии удар. Вес ткани была 0,18 ± 0,04 г (сырой вес). Количество митохондрий, выделенных как определяли путем подсчета частиц по размерам было 2,4 х 10 10 ± 0,1 х 10 10 митохондрии для скелетных мышц и 2,75 х 10
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Чтобы успешно изолировать митохондрии, используя этот протокол, его необходимо держать все решения и образцы тканей на льду, чтобы сохранить митохондриальную жизнеспособность. Даже тогда, когда поддерживается на льду, изолированные митохондрии будут демонстрировать уменьшение функциональной активности с течением времени 19. Мы рекомендуем, чтобы все решения и дополнения предварительно подготовлены. Мы заранее взвесить и хранить субтилизина А в 4 мг аликвоты в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и хранить их пр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все животные были обработаны в соответствии с действующими институциональных принципов. У нас нет никаких конкурирующих финансовых интересов раскрывать.
Это исследование было поддержано Национальным сердца, легких и крови институт Грант HL- 103542, и заслуженный Trailblazer Award МПБ Анестезия Фонда Исследования к CAP.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Сахароза | Сигма Олдрич | 84100 | |
| HEPES | Сигма Олдрич | H4034 | |
| EGTA | Сигма Олдрич | E4378 | |
| Субстильсин А | Сигма Олдрич | P5380 | |
| BSA Сигма Олдрич | A7906 | ||
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Люминесцентная система анализа, 1,000 Набор для анализа | Perkin Elmer | ||
| 50 мл конические тубы | BD | 352098 | |
| 40 μ m Нейлоновые фильтры | BD | 352340 | |
| GentleMACS C пробирка | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1,5 мл Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 мм биопсийный пункс | Miltex | 33-36 | |
| 10 μ m Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| Диссоциатор GentleMACS | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-луночные планшеты, обработанные культурой тканей | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 орбитальный шейкер | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Считыватель микропланшетов | BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments Гемацитометр | ||
| Fisher Scientific | 267110 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешениеA correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.