Методическая статья

Быстрое Выделение и очистка митохондрий Для трансплантации тканью диссоциации и дифференциальной фильтрации

39.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51682

⸱

6 сентября 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Способ быстрого выделения митохондрий из млекопитающих биопсии тканей описан. Печень крысы или скелетные мышечные препараты гомогенизировали с коммерческой диссоциатора ткани и митохондрии были изолированы с помощью дифференциальной фильтрацией через нейлоновое сито фильтров. Митохондриальная время изоляция <30 мин по сравнению с 60 - 100 мин с использованием альтернативных методов.

Аннотация

Ранее описанные способы митохондриальные выделения с использованием дифференциального центрифугирования и / или центрифугирование в градиенте Ficoll требуют от 60 до 100 мин, чтобы закончить. Опишем способ быстрого выделения митохондрий от биопсии млекопитающих с использованием коммерческого диссоциатор тканей и дифференциальный фильтрации. В этом протоколе, руководство гомогенизации заменяется стандартизированной цикла гомогенизации ткани диссоциатора в. Это позволяет единообразно и последовательно гомогенизации ткани, которая не легко достигается с ручным гомогенизации. После диссоциации ткани, гомогенат фильтруют через нейлоновое сито фильтров, которые устраняют повторяющиеся стадии центрифугирования. В результате, митохондриальная изоляция может быть выполнена менее чем за 30 мин. Этот протокол изоляция производится около 2 х 10 10 жизнеспособных и дыхания компетентные митохондрии от 0,18 ± 0,04 г (сырого веса) образца ткани.

Введение

Существуют Митохондрии в каждой клетке тела, кроме эритроцитов и участвуют в большом количестве важных клеточных и метаболических процессов 1-4. Из этих многих функций, повреждение митохондрий может иметь пагубные последствия 3. Для исследования митохондриальной функции и дисфункции несколько митохондриальных методы изоляции были описаны. Самые ранние опубликованные описания митохондриальной даты изоляции до 1940 5-8. Первый документально показано, попытка митохондриальной изоляцию путем измельчения ткани печени в ступке с последующим центрифугированием в солевом растворе с низкой скоростью 5,8. Позже, другие группы расширены оригинальной методике и продемонстрировал тканей фракционирования на основе дифференциального центрифугирования 6-8. Эти ранние методы легли в основу современных методов, которые часто включают гомогенизации и / или дифференциального центрифугирования 9-15. Количество homogenizatiна и центрифугирования шагов варьируется среди протоколов. Эти повторяющиеся стадии увеличить время для митохондриальной изоляции и в конечном итоге сократить жизнеспособность. Кроме того, руководство гомогенизации может привести к повреждению и противоречивые результаты митохондриальные если должным образом не контролируется 10,16.

В последнее время мы использовали гомогенизации и дифференциального центрифугирования изолировать митохондрии для трансплантации в ткани миокарда 17,18. Это длительная процедура изоляции требуется примерно 90 мин и клиническая применимость этого метода был поэтому ограничены. Для обеспечения острой терапевтического применения в клинической и хирургического лечения мы разработали быстрый митохондриальной процедуры выделения, которые могут быть выполнены в менее чем 30 мин.

Основные преимущества этого протокола, что стандартизированный ткани диссоциации позволяет единообразно и последовательно гомогенизации ткани, которая не легко достигается с ручным гомогенизации. В Additионный, использование дифференциального фильтрации вместо дифференциального центрифугирования устраняет много времени и повторяющиеся действия центрифугирования позволяет более быстрого выделения высокоочищенных, жизнеспособных и дыхания компетентных митохондрий.

Возможность изолировать жизнеспособные и дыхания компетентные митохондрии менее чем 30 мин позволяет клинической применимости. Этот протокол изоляция имеет потенциал для использования в аортокоронарное шунтирование операции (АКШ) и других лечебных процедур.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Подготовка

  1. Подготовьте 1 М К-HEPES исходного раствора (отрегулировать рН до 7,2 с КОН).
  2. Подготовить 0,5 М К-EGTA исходного раствора (отрегулировать рН до 8,0 с КОН).
  3. Подготовьте 1 М KH 2 PO 4 маточного раствора.
  4. Подготовьте 1 М MgCl 2 маточного раствора.
  5. Подготовка гомогенизации буфера (рН 7,2) 300 мМ сахарозы, 10 мМ HEPES, К-и 1 мМ К-EGTA. Хранить при 4 ° С.
  6. Подготовка дыхания буфера 250 мМ сахарозы, 2 мМ КН 2 РО 4, 10 мМ MgCl 2, 20 мМ К-HEPES буфера (рН 7,2) и 0,5 мМ К-EGTA (рН 8,0). Хранить при 4 ° С.
  7. Подготовка 10x PBS маточного раствора путем растворения 80 г NaCl, 2 г хлористого калия, 14,4 г Na 2 HPO 4 и 2,4 г KH 2 PO 4 в 1 л бидистиллированной H 2 O (рН 7,4).
  8. Приготовьте 1х PBS с помощью пипетки 100 мл 10x PBS в 1 л бидистиллированной H 2 O.
  9. Подготовьте Субтилизин запаса путем взвешивания 4 мг субтилизина А вв 1,5 мл пробирке. Хранить при -20 ° С до использования.
  10. Подготовьте BSA складе путем взвешивания 20 мг BSA в 1,5 мл пробирке. Хранить при -20 ° С до использования.

Митохондриальная Изоляция (Рисунок 1)

  1. Непосредственно перед изоляции, растворить субтилизина A в 1 мл буфера гомогенизации.
  2. Непосредственно перед изоляции, растворить БСА в 1 мл буфера гомогенизации.
  3. Соберите два образца свежей ткани на 6 мм удар образца биопсии и магазин в 1x PBS в 50 мл коническую центрифужную пробирку на льду.
  4. Передача этих двух 6 мм пуансонами ткани к диссоциации C пробирку, содержащую 5 мл охлажденного льдом буфера гомогенизации.
  5. Гомогенизируют ткани путем подгонки диссоциации C трубку на ткани диссоциатора и выберите предварительно установленный митохондриальную цикл изоляции (60 сек гомогенизации).
  6. Снимите диссоциации C трубку к ведерке со льдом.
  7. Добавить 250 мкл Субтилизин исходного раствора дляГомогенат, перемешать и инкубировать инверсии гомогената на льду в течение 10 мин.
  8. Поместите сетчатый фильтр 40 мкм на 50 мл коническую центрифужную пробирку на льду и предварительно влажного фильтра с гомогенизации буфера и гомогенат фильтруют в 50 мл коническую центрифужную пробирку на льду.
  9. Добавить 250 мкл свежеприготовленного BSA маточного раствора в фильтрат и перемешать с помощью инверсии.
    Примечание: Пропустите этот шаг, если требуется определение митохондриальной белок.
  10. Поместите 40 мкм фильтр на 50 мл коническую центрифужную пробирку на льду и предварительно влажного фильтра с гомогенизации буфера и гомогенат фильтруют в 50 мл коническую центрифужную пробирку на льду.
  11. Поместите 10 мкм фильтр на 50 мл коническую центрифужную пробирку на льду и предварительно влажного фильтра с гомогенизации буфера и гомогенат фильтруют в 50 мл коническую центрифужную пробирку на льду.
  12. Передача фильтрата до двух предварительно охлажденной 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и центрифугируют при 9000 х г в течение 10 мин при4 ° C.
  13. Удалить супернатант и повторно приостанавливать и объединить гранул в 1 мл охлажденного льдом буфера дыхания.

ATP Анализ

Примечание: Для определения метаболической активности митохондрий изолированного АТФ люминесценции анализ может быть выполнен с использованием набора для анализа АТФ. Протокол, реагенты и стандарты были поставлены в комплекте анализа. Краткое описание процедуры описан ниже.

  1. Равновесие реагенты до комнатной температуры.
  2. Подготовка 10 мМ АТФ маточного раствора путем растворения лиофилизированного АТФ осадок в 1170 мкл бидистиллированной воды. Храните ATP стандартного раствора со и подготовили митохондриальные образцы на льду.
  3. Добавить 5 мл раствора субстрата буфера в пробирку лиофилизированного раствора субстрата. Осторожно перемешать и поместить в темноте.
  4. Добавить 100 мкл дыхания буфера во все лунки черной непрозрачной нижней, 96-луночного планшета.
  5. Добавить 10 мкл митохондрий от приготовленных образцов в каждую лунку OFA черный, непрозрачный низ, 96-луночный планшет. Примечание: Образцы помещали в трех экземплярах. Включите строку для стандартов и трех скважин для отрицательного контроля (Дыхание буфера).
  6. Добавить 50 мкл млекопитающих раствора для лизиса клеток во все лунки, в том числе стандарты и управления.
  7. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 5 мин на орбитальном шейкере при 125 оборотах в минуту.
  8. Во время инкубации подготовить стандарты АТФ в концентрации 0,1 мм, 0,05 мм, 0,01 мм, 0,005 мм, 0,001 мм, а 0,0001 мМ АТР от 10 мм АТФ маточного раствора. Магазин стандартов на льду.
  9. После инкубации добавить 10 мкл стандартов СПС в соответствующие лунки, как указано на тарелке карте. Примечание: Стандарты выполняются в двух экземплярах.
  10. Добавить 50 мкл восстановленного раствора субстрата в каждую лунку.
  11. Инкубируйте планшет при 37 ° С на орбитальном шейкере в течение 5 мин при 125 оборотах в минуту.
  12. Открыть Gen5 1,11 программное обеспечение на компьютере, связанного с спектрофотометра.
  13. Под "Создать новый элемент ", нажмите на" Эксперимент ".
  14. Нажмите кнопку "По умолчанию протокола". Нажмите "Ok".
  15. В левом столбце, выберите "Протокол", затем "Порядок".
  16. Выберите "Delay". Установите в 00:10:00. Нажмите "Ok".
  17. Выберите "Read". Выберите "Люминесценция" из выпадающего меню. Отрегулируйте другие настройки на следующее: Читать типа конечной точки, времени интегрирования 0: 01,00 MM: ss.ss, наборы фильтров 1, отверстие выбросов, оптика Позиция Лучшие, чувствительность 100, Топ зонд Смещение по вертикали 1,00 мм.
  18. Когда пластина готова быть проанализированы, нажмите на значок "Read Plate" в верхнем ряду. Нажмите "Read". Когда откроется спектрофотометр, поместите пластину в лоток а A1 в верхнем левом углу. Коробка с температурой откроется. Нажмите "Read". Примечание: Более высокие значения коррелируют с повышением уровня АТФ и высшего метаболической активности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Фигура изложением процедурные шаги в изоляции митохондрий с помощью ткани диссоциации и дифференциальное фильтрацию показано на рисунке 1. Всего процессуальное время меньше 30 минут.

Образцы тканей были получены с использованием 6 мм биопсии удар. Вес ткани была 0,18 ± 0,04 г (сырой вес). Количество митохондрий, выделенных как определяли путем подсчета частиц по размерам было 2,4 х 10 10 ± 0,1 х 10 10 митохондрии для скелетных мышц и 2,75 х 10

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Чтобы успешно изолировать митохондрии, используя этот протокол, его необходимо держать все решения и образцы тканей на льду, чтобы сохранить митохондриальную жизнеспособность. Даже тогда, когда поддерживается на льду, изолированные митохондрии будут демонстрировать уменьшение функциональной активности с течением времени 19. Мы рекомендуем, чтобы все решения и дополнения предварительно подготовлены. Мы заранее взвесить и хранить субтилизина А в 4 мг аликвоты в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и хранить их пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все животные были обработаны в соответствии с действующими институциональных принципов. У нас нет никаких конкурирующих финансовых интересов раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным сердца, легких и крови институт Грант HL- 103542, и заслуженный Trailblazer Award МПБ Анестезия Фонда Исследования к CAP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
СахарозаСигма Олдрич84100
HEPESСигма ОлдричH4034
EGTAСигма ОлдричE4378
Субстильсин АСигма ОлдричP5380
BSA Сигма ОлдричA7906
KH2PO4Sigma AldrichP5379
MgCl2Sigma AldrichM8266
NaClSigma AldrichS6191
KClFisher ScientificP2173
Na2HPO4Fisher ScientificS374
ATPlite Люминесцентная система анализа,
1,000 Набор для анализа		Perkin Elmer
50 мл конические тубыBD352098
40 μ m Нейлоновые фильтрыBD 352340
GentleMACS C пробиркаMiltenyl Biotech120-005-331
1,5 мл Eppendorf tubeFisher Scientific05-408-129
6 мм биопсийный пунксMiltex33-36
10 μ m PluristrainerPluriselect43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415CMarshall ScientificEP-5415C 
Диссоциатор GentleMACS Miltenyl Biotech130-093-235
96-луночные планшеты, обработанные культурой тканейVWR82050-732
Rotomax 120 орбитальный шейкерHeidolph544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode
  Считыватель микропланшетов		BioTek
Multisizer 4 Coulter CounterBeckman CoulterA63076
Oxytherm SystemHansatech Instruments Гемацитометр
Fisher Scientific267110
6016941

Ссылки

  1. van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
  2. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
  3. Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317(2011).
  5. Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
  6. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  7. Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  8. Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  9. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  10. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
  11. Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  12. Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
  13. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
  16. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
  17. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
  18. McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
  19. Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
  20. Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
  21. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление


Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 1/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

Теги

Похожие статьи