В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Summary

Характер взаимодействия между гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) и ниш костного мозга еще плохо изучены. Пользовательские модификации аппаратных и протокол приобретение многоэтапным разрешить использование двухфотонного и конфокальной микроскопии имиджу экс естественных меченые HSPCs рогатый в районах костного мозга, отслеживание взаимодействий и движения.

Abstract

Через хрупкого баланса между покоя и пролиферации, самообновления и производства дифференцированного потомства, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) поддерживать оборот всех зрелых линий клеток крови. Координация сложных сигналов, ведущих к конкретным HSC судеб полагается на взаимодействие между ГСК и сложной микросреды костного мозга, который до сих пор мало изучены ^[1-2].

Мы опишем, как, комбинируя недавно разработанный держатель образца для стабильного позиционирования животных с многоступенчатой ​​конфокальной и двухфотонной в методов визуализации естественных, можно получить 3D стеки с высоким разрешением, содержащие HSPCs и окружающие свои ниши и отслеживать их в течение долгого времени через многоточечного покадровой съемки. Изображений высокой четкости позволяет обнаруживать Экс Vivo меченые гемопоэтические стволовые и клетки-предшественники (HSPCs) проживающих в костном мозге. Кроме того, многоточечный покадровой 3D визуализации, оbtained с более быстрыми настройками сбора, предоставляет точную информацию о движении HSPC и взаимных взаимодействий между HSPCs и стромальных клетках.

Отслеживание HSPCs по отношению к GFP положительные остеобластных клеток показано, как примерного применения этого метода. Этот метод может быть использован, чтобы отслеживать любое соответствующим образом меченый гемопоэтических стромальных клеток или интереса в пределах свода черепа мыши пространства костного мозга.

Introduction

Несмотря ниши стволовых клеток получив признание в течение десятилетий ³ и хорошо охарактеризованы во многих тканях, таких как обонятельной луковицы, мышечных волокон, волосяного фолликула выпуклость или ЦНС субвентрикулярной зоны ^4-7, взаимодействие между гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и микроокружения костного мозга ( БМ) до сих пор мало изучены в связи с трудностью непосредственно наблюдать отдельные клетки через кость, а также чрезвычайно жидкости природу самой ткани. Было показано, с помощью ряда функциональных исследований на основе абляции или гиперэкспрессией специфические гены в любом ГСК или стромальных клеток самого микросреды, что сложная сеть различных типов клеток и регуляторных сигналов отвечает за регулирование хрупкое равновесие между покоя , распространение, расширение и дифференциация ГСК ^1-2. Перекрестные помехи между ГСК и своих нишах можно понимать в глубине только путем прямого наблюдения. Это ACHievable благодаря развитию передовых протоколов изображений, сочетающих имеющейся технологии, не только с точки зрения микроскопии, но и с образцами держателя решений и программного обеспечения приобретения.

Разрешение одного сотового жить изображений пересаженных гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в БМ отсеке костей свода черепа мыши показали, что прививка HSPCs локализовать в непосредственной близости от SDF-1 и VCAM-1-положительных сосудов ^8-9 и что более незрелых клеток находятся в пределах 15 – 20 мкм от GFP-положительных клеток (остеобластические Col2.3-GFP трансгенной линии мыши, в котором остеобластов-ограничено коллагена 1α промотора управляет экспрессией GFP), а их потомство более дистально ^10. Аналогичные наблюдения были получены из расчлененных и трещиноватых бедренной кости ¹¹ и от утонченных tibeal костей ^12. Визуализация свода черепа костном мозге остается наименее инвазивный подход для достижения прямой визуализации HSPCs течение гоEIR родной микросреда.

С любым живого изображения образца существует внутреннее необходимости держать образец как можно более неподвижно, чтобы избежать ненужных артефактов из-за перемещением образца. Дыхание вызывает колебательные движения головы мыши, которые необходимо избегать при визуализации свода черепа костный мозг. Обычные стереотаксических держатели, используемые, например, для мозга визуализации и электрофизиологии, не подходят для работы с изображениями свода черепа, потому что они мешают лобные кости. Начиная с держателем мыши используется, чтобы минимизировать стресс во время живых изображений и электрофизиологических исследований ^13, держатель 2 компонент был разработан, с маленькой частью, закрепленной на голове мыши, чтобы создать окно визуализации, соединенный с большим руку, обеспечивая устойчивый захват с тяжелая плита основания, которые обеспечивает твердо в столике микроскопа. Закрепление головной убор к черепу мыши позволяет свободное дыхание, все еще иммобилизации голову на место и адекватно устранения мovements вследствие дыхания. "Замок-ключ, и" механизм связывания головного убора в корпусе мундштука позволяет размер окна, чтобы свести к минимуму, а также повышенной точности позиционирования, следовательно, упрощает операцию, и подходит опорной плиты в стадии позволяет точным выравниванием по микроскопом. Чтобы точно контролировать подвижные клетки, протокол промежуток времени многоточечный была разработана, чтобы позволить отслеживать клеток с течением времени с 5-минутными интервалами между моментами времени. Вот, сделал меченые ГСК вводятся в col2.3GFP osteoblasitc репортеров мышей ^10,14 и отображаемого примерно 20 часов спустя. Держатель мыши, который был разработан и параметры визуализации, необходимые для выполнения быстрого многоточечной покадровой изображений одних и тех же областей в течение часа множественного подробно описаны.

Protocol

Все процедуры, связанные с использованием животных осуществляется в соответствии с местным законодательством. Наша работа утверждается внутренних дел Великобритании, а также этической экспертизы панели Imperial College. Разрешенные процедуры описаны в документации лицензионного проект и следовать рекомендациям, которые обеспечивают благосостояние животного во все времена. Убедитесь, придерживаться законодательства о экспериментов на животных той страны, где выполняется работа. 1 Маркировка и Инъекция HSPCs: Урожай клетки, как описано Ло Селсу 14-15. Подготовка клеток в концентрации 10 6 клеток / мл в PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте гемоцитометра или информацию, предоставленную клеточной сортировщика рассчитывать клетки; количество ячеек, которые будут помечены и вводят варьируется в зависимости от типа клеток (пятно например 10000 – 20000 ГСК, 100000 – 300000 HPCS); Если работа с менее чем 10 5 клеток, ресуспендируют в 100 мкл PBS; важно, чтобы клетки в PBS без сыворотки, так как в сыворотке крови ингибирует окрашивание. Добавить сделал с клеточной суспензии до конечной концентрации 5 мкМ и сразу же вихрь подвеску для обеспечения краситель не выпадает в осадок из раствора и не маркировать клетки. Выдержите в течение 10 мин при 37 ° С, затем промыть, крутя при 500 мкг в течение 5 мин, отстаивают жидкость и ресуспендированием осадок в соответствующем объеме для IV инъекции (~ 100 – 150 мкл) Ресуспендируют клеток в 200 мкл PBS и собирают в шприц инсулина. Примечание: инсулиновый шприц рекомендуется сравнению с обычным шприцем, потому что он не имеет иглы мертвого пространства и, следовательно, позволяет введение Всю суспензию клеток на мышь. Введите клетки в смертельно облученных мышей в виде инъекции в хвостовую вену. ПРИМЕЧАНИЕ: Облучение известно, значительное влияние на микросреду костного мозга (как гемопоэтические и стромальные компоненты), которая развивается в течение Tiмне. Поэтому очень важно поддерживать последовательную синхронизацию для облучения, инъекции клеток (от 4 до 24 часами от облучения за лучший приживления) и изображений. Здесь облучение осуществляют 6 ч перед инъекцией и обработки изображений выполняется 20 ч после инъекции. Наведите в теплой камере (37 ° C), пока в хвостовую вену не появится vasodilated. Наведите указатель мыши на фиксатор и осторожно сдвиньте иглу в хвостовую вену. Введите клетки в вену – никакого сопротивления инъекции не должны встречаться. Оставьте мыши O / N для того, чтобы позволить клеткам мигрировать в пространствах костного мозга. 2 Подготовка Мышь для визуализации Автоклав одну пару тонких щипцов и одну пару тонких ножниц, а также головной убор перед использованием и хранить в стерильной среде. Макияж анестетик как свежие, как это возможно, (0,38 мл кетамина + 0,25 мл Медетомидин + 4,47 мл воды). ПРИМЕЧАНИЕ: OTее утвержденные анестетиков, включая изофлураном и других инъекционных, будет эффективным слишком. Коктейль описано должно быть вводили внутрибрюшинно в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела, с верхних окон 30 – 50 мкл, вводимых через каждые 45 мин до 1 часа. Включите двухфотонного лазера при необходимости запустите микроскоп и программное обеспечение, калибровки этап, когда будет предложено. Включите лазеров и дать им возможность прогрева и стабилизации при подготовке мышь для работы с изображениями. Обезболить мышь, используя подготовленную обезболивающий смесь (шаг 2.2) для выбранного анестетика через внутрибрюшинного введения. Монитор начало глубокой анестезии через педали рефлекс теперь и на регулярной основе в течение всего протокола. ПРИМЕЧАНИЕ: мышь должна находиться под тщательным наблюдением на протяжении всей процедуры, и если анестезия, кажется, осветления (обычно после 45 – 60 мин), затем администрировать пополнения дозу (как указано в 2.2). Ожидайте некоторое изменение между мышей разных возрастов и пола. Это важTant обсудить протокол анестезии с местным офицером ветеринарной обеспечить необходимые меры безопасности принимаются для обеспечения благосостояния мыши. Тампон верхней части головы с 70% этанола на ткани, обеспечивая, чтобы не получить любой этанол в глазах мыши. Использование стерильного пинцета и ножниц, осторожно удалите центральную часть кожи головы, чтобы подвергнуть район свода черепа для включения в образ: сделать небольшой надрез на затылке между ушами, подняв кожу с помощью пинцета. Удерживая кожи, слайд-ножницы под кожу и осторожно разрезают вдоль внешней стороне нужной области изображения. Протрите подвергаются кости стерильным ватным тампоном, смоченным стерильным PBS, чтобы держать его влажным. Прикрепите металлический головной убор с черепом мыши, готового к визуализации. Смешайте достаточное количество зубной цемента в лодке взвешивания пока она не станет пасты и быстро распространяется на нижней поверхности головного убора, который будет прикрепить к SКулл. Перед цементных наборов, разместить головной убор на черепе мыши, убедившись, что не получить любую стоматологического цемента на площади изображения, а затем ждать, пока она устанавливается. Нанесите небольшое количество внутриплощадочных гидрогеля, который держит череп влажная. Прикрепите заставку к держателю и зафиксировать с помощью винта, убедившись, что канавки вписываются в держателя вырезами. Снимите гидрогель из черепа с стерильных ватные палочки и чистый стерильной PBS до передачи в микроскоп. Вставьте держатель в столике микроскопа, расположите нагревательный мат под мышкой, вставьте ректального термометра зонда и обеспечить все на месте на сцене с помощью клейкой ленты. Поместите небольшую каплю глазной мази на глазах мыши, чтобы убедиться, что они не высыхают, находясь под наркозом. ПРИМЕЧАНИЕ: мышь не должны оставаться без присмотра в любое время в процессе формирования изображения под наркозом. <p cl. задницу = "jove_title"> 3 В естественных изображений: Стеки высокого разрешения и приобретение Покадровый Сосредоточьтесь на черепе через глаз штук. Заполните окно визуализации с очищенной, стерильной водой и с помощью погружения объектив воды, опустите его так, чтобы он касался капля воды. Сосредоточьтесь на верхней части черепа, используя микроскоп окуляры, используя внешнюю лампу в качестве источника света. Поместите в область переноса изображения на центральной шва и двигаться в направлении задней части головы, чтобы найти венечного шва, как исходное положение. Установите микроскоп, чтобы позволить эффективное возбуждение и обнаружение соответствующих флуорофорами указанных в таблице возбуждения и эмиссии. ПРИМЕЧАНИЕ: в то время как Leica SP5 вертикально конфокальной с общепризнанным руководителем гальванометра сканирования работает программной платформы LAS-AF используется здесь, процедура может быть легко использован в других микроскоп / программных платформ. Объектив используется здесь является Leica НСХ IRAPO L 25x W / 0,95 NA бут эквивалентные объективы других производителей доступны с подходящим увеличением и высокой числовой апертурой Поместите программного обеспечения в режиме захватить оба XY изображения, а также 3D-Z-стек и установить скорость формирования образа до 400 Гц и разрешение 512 х 512 пикселей. ПРИМЕЧАНИЕ: установка и аппаратные вот результат в поле зрения 620 мкм, и это может отличаться на других платформах. Установите программное обеспечение таким образом, чтобы несколько каналов / треков могут быть захвачены, а также обеспечение того, чтобы метод сбора устанавливается для изменения настроек между стеками, если это возможно, или между кадрами, по крайней мере. Настройка 3 независимых параметров извлечения, выключения лазера освещение в конце приобретения каждого стека. ПРИМЕЧАНИЕ: три канала будут необходимы для этой процедуры, чтобы уменьшить перекрестные помехи между каналами. Настройка настройки для первого последовательного просмотра для двух фотонов ГСП кости сигнала (840 нм возбуждения; 400 – 440 нм излучения); открыть затвор для лазера МП и обеспечить MP усиления и смещения правильно настроен, мощность лазера составляет 12,5 – 25% и лазер включается. Выберите подходящий PMT в качестве единственного детектора и измените цвет на белый. Примечание: NDD детекторы с соответствующими фильтрами должны использоваться для обнаружения костей, когда имеются для достижения более яркое, глубокое сигнал. Повторите процедуру настройки канала используется для GFP канала для комбинированной автофлуоресценции (возбуждения 543 нм; 560 – эмиссия 600 нм) и сделал (633 нм возбуждение; 650 – 720 нм эмиссия) под вторым настроек сканирования, используя два соответствующих ФЭУ. Измените цвет канала на зеленый для автофлуоресценции и красный для DiD. Примечание: используя зеленый, как авто-флуоресценции канал облегчает обнаружение сделал положительных клеток, когда два канала накладывается – autofluorescent клетки появляются как желтый / оранжевый связи, чтобы быть в обоих каналах время DiD клетки появляются только как красный, так как они появляются только в DiD канал. Авто-флуоресценции каналиспользуется только для этого сравнения, и не используется в любом конечном счете, однако, если пользователь желает, это может быть изменено, чтобы разные цвета для отображения, чтобы избежать путаницы с GFP канала. Наконец, установка третья и заключительная проверка для GFP (возбуждения 488 нм; 500 – 530 нм эмиссия); убедитесь, что затвор открыт, если требуется, и затем установите мощность лазера 488 нм лазерной линии до 15% или соответствующий уровень для лазера используется, выберите соответствующий ФЭУ в качестве единственного активного детектора и изменить его PseudoColor на зеленый. Активируйте "живую" режим отображения, чтобы начать предварительное сканирование выбранного канала и настроить детектор усиления и смещения для получения оптимальной экспозиции. Повторите эту процедуру для каждого сканирования в последовательном окне. Сохранить настройки этих многоканальных сканирования для простого использования. ПРИМЕЧАНИЕ: это позволяет пользователю перезагрузить настройки в последующих сессиях. Активируйте захват многопозиционное, называют "марка Ай Найти 'в продемонстрированной программного обеспечения, и сбросьте координаты точек. Сканирование площадь изображения костей, начиная от пересечения между центральным и венечного шва, сканировать глубину области костного мозга с использованием как аутофлюоресценция (псевдо цвета зеленый) и сделал (псевдо-цвета красный) с композитным зрения. Примечание: autofluorescent клетки будут присутствовать в обоих каналах, и появляется оранжевый / желтый в составном изображении, тогда как сделал меченые клетки будут выглядеть как красный-клеток только в комбинированном изображении. Когда клетка обнаруживается, отмечают это как новый координатой (х, у, г) в 'Марка и Найти ", щелкнув в окне" Добавить значок Позиция на левом стороне "Марка и Найти" . Когда ток поле зрения был рассмотрен, двигаться со сцены расстояние одного поля зрения либо влево / вправо / вниз / вверх. Повторите этот процесс для каждого поля зрения, постепенно работая вокруг всей площади окна изображения слева от гоэ центральный шов, двигаясь в направлении носа мыши. После того, как центральный шов раздвоение в глазах, перейти к правой стороне шва и повторите процедуру сканирования левую сторону в обратном направлении (т.е. в направлении венечного шва). Отметить координаты любых новых клеток, представляющих интерес, используя 'Mark и Найти "инструмент. После того, как сканирование окна изображения будет завершена, используйте 'Mark и Найти "инструмент для рассмотрения пунктов (выберите нужную точку и просмотреть все точки в отдельности). Установите верхнюю и нижнюю часть в Z-стека вокруг каждой ячейки для каждой позиции, (многие программные платформы позволит вам выполнять независимые Z-стеки для каждой позиции, которая уменьшает захвата пустое пространство). Для каждой точки, сосредоточиться вверх и вниз и установить верхние и нижние Z позиции для 3D захвата г-стека и обновить индивидуальную точку в «Марка и Найти". Установите интервал Z-Stack, чтобы 5 мкм и в среднем для каждого последовательного канала сканирования до соответствующего качества: линия ог Рама средняя. Примечание: Увеличение количества сканирований в среднем увеличивает продолжительность времени сбора данных. Получить ссылку стек высокого качества для каждой точки интереса, начиная всю процедуру сканирования (часто называют «Пуск», а не «захват»). ПРИМЕЧАНИЕ: это сканирование может выступать в качестве эталона для будущих изображений с высокой скоростью. После завершения сканирования высококачественной, активировать настройку покадровой для захвата. В настройках покадровой, установить временной интервал до 5 мин и общего времени выполнения до нужной длины (например, 5 ч). «Применить» эти параметры для общей проверки. ПРИМЕЧАНИЕ: для того, чтобы сократить это время сканирования, позволяющий в 5 мин интервал времени, по прошествии, один, возможно, потребуется сократить количество проверок, используемых для усреднения, ограничить разрешение до 512 х 512 пикселей, конвертировать сканирование для двунаправленного (с необходимой фазовой коррекции чтобы выровнять оба сканирования направления), и / или увеличить скорость сканирования до 600 Гц или более (более 600Гц вызовет увеличения площади изображения для демонстрируемой программной платформы). Кроме того, важно отметить, что в то время как последовательный режим формирования изображения был использован для получения стек изображения высокого качества первоначально, одновременный сбор используется для увеличения скорости во время покадровой обработки изображений – это может привести к некоторой небольшой перекрестных помех между каналами, которые ставит дополнительную Важность от начального захвата точно разделенных эталонных стеков. Начать визуализации (как и прежде, нажав на кнопку "Пуск" в демонстрируемой программного обеспечения). ПРИМЕЧАНИЕ: убедитесь, что для поддержания соответствующего уровня анестезии путем введения дальше, меньшие дозы при необходимости, стараясь не передозировка мыши, регулярно пополнить воду, чтобы обеспечить цели не высыхает и контролировать жизненно важные признаки и температуру нагрева-площадку во всем. Когда закончите, поднять объектив от держателя и снимите держатель из столике микроскопа, обеспечивая провода от ректального зонда и честь коврик не повреждены. Отвинтите головной убор из держателя стадии и осторожно удалите мышь. Cull мыши с помощью шейки дислокации и снять металлическую головного убора, захлопнув его черепа. Сохранение данных на диск и передать на сервер для последующего анализа. ПРИМЕЧАНИЕ: головной убор идеально очищены путем погружения в ацетон в течение нескольких часов и, наконец, потирая остаточного цемента офф.

Representative Results

Заказ, высокоточный держатель мыши в том числе окна изображения свод черепа позволяет длительное визуализации FACS очищенных, помеченных HSPCs введенных в смертельно облученных мышей-реципиентов (Рисунок 1А). Как правило, после инъекции между 15 – 20000 меченых клеток, от 8 до 15 клетки, как правило, узнаваемый в костном мозге области формирования изображения черепа на следующий день. Здесь показано, как получить одну резолюцию клеток 3D стеки HSPC содержащих области костного мозга примерно 90 – 120 толщиной мкм, (Рисунок 1В), с последующим 4D покадровой фильмов в HSPCs выявленных (Рисунок 1C и кино). Субоптимальные результаты получают, если зубная цемента не оптимально получены, например, вода может вытекать из не герметичных областей, и даже при том, что он может быть пополнен из верхней части держателя, любой период времени, в котором линза не погружают в воду приводит к черной F Рамеш. Некоторые дрейфа в изображениях неизбежно вследствие теплового расширения материалов держателя мыши, однако он может быть подчеркнуты субоптимальной цемента адгезии, что приводит к прогрессирующей отрыва мыши, а возмущений визуализации, созданной, что приводит к резким скачкам фокуса во время покадровой обработки изображений. Drift во многоточечного покадровой съемки также могут быть вызваны неточностями в движениях стадии, когда пересмотр ранее вошедшие позиции. Drift и заикаться артефакты в покадровой фильмов можно скорректировать с помощью алгоритмов совмещения изображений. Таблица 1 Возбуждение и настройки выбросов. Цвет Канал Возбуждение Эмиссия GFP 13px; "> 488 нм 500 – 530 нм Автофлуоресцентной 543 нм 560 – 610 нм DiD 633 нм 640 – 700 нм SHG 840 нм (МП) 400 – 450 нм Рис.1 В естественных 4D визуализации HSPCs в мыши свода черепа. (А) Схема эксперимента (B – C).. Примеры полученных результатов (B) 2D срезы 3D-стека (общая глубина составляет 114 мкм), содержащий сигнал от коллагена кости (белый), сделал меченые клетки (красные) , autofluorescent челLs (желтый) и остеобластические клетки (зеленые). Шкала баров:. 100 мкм (C) 2D ломтики от 4D покадровой фильм, показывающий сделал надписью HSC (красный), мигрирующих в непосредственной близости от остеобластов клеток (зеленые). Пунктирная линия указывает на смещение клетки. Шкала баров: 50 мкм (B) и 100 мкм (с). ПРИМЕЧАНИЕ:. Фильм, полученная от приобретения покадровой в (С) показан в ходе видеомоста статье Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Что было достигнуто?

Протокол использует многомерную покадровой обработки изображений для мониторинга миграции FACS очищали, Экс Vivo меченые, пересаженные HSPCs в мыши свода черепа костного мозга. Идентификация отдельных трансплантированных клеток был достигнут, и они были контролироваться в течение продолжительного периода времени (час) с высокой точностью. Дыхательные индуцированные артефакты движения были сведены к минимуму и клетки были неоднократно reimaged в течение длительного времени, конечно.

Каковы будущие направления?

Разработка методики может прогрессировать в сторону экспериментов восстановления для обеспечения визуализации на нескольких дней, в течение недели или более и использования газовых анестетиков, таких как изофлураном сократить и упростить процесс восстановления для мыши (Примечание: эксперименты восстановления требуют строго стерильные условия хирургия и администрация соответствующего анальгетиков). Development большего цветового палитрой красок в естественных условиях, а также эффективного генетического маркирования гемопоэтических клеток также облегчить мульти-маркировки экспериментов, обеспечить более глубокое межклеточных взаимодействий в костном мозге и способствуют созданию более сложных экспериментов в будущем. Кроме того, одновременное маркировка нескольких структур костного мозга и компонентов стромы обеспечит более полную картину событий, происходящих в HSPC ниш. Стабильность изображения из покадровой фильмов может быть улучшена путем стабилизации preacquisition микроскопа дополнительно, а также свести к минимуму температурные градиенты в образце и postacquisition с помощью алгоритмов регистрации изображений.

Ограничения:

Методика описана представлены некоторые ограничения. Выживание мышей после введения инъекций анестетиков непредсказуема, и это очень легко опыта осложнений в зависимости от индивидуальной реакциианестетик. Вообще, чем дольше сессия изображений, тем труднее для мыши, чтобы оправиться от наркоза и поэтому важно тщательно спланировать, если мышь, подлежащих возмещению, в идеале предельная продолжительность визуализации промежуток времени. Использование инъекций анестетиков ограничивает время каждого сеанса визуализации может длиться. Хотя вполне возможно, продлить анестезию readministering меньшую дозу анестетика, трудно выполнить это точно и передозировки мышь является одним из наиболее частых причин досрочного прекращения визуализации в естественных условиях. Газ анестезия является менее токсичным и позволяет для более начальной сессии изображений, однако быстрое восстановление мыши после> 2 ч долго администрация изофлураном редко успешным. Другим ограничением метода является ограниченное разрешение изображений, которые можно получить во время многоточечного покадровой съемки, в связи с необходимостью приобретения изображения быстро. Это, в сочетании с фокусным дрейфа или поле прыгает (дискussed выше), можно сделать отслеживание клеток трудно.

Сравнение с альтернативными методами:

HSPCs обычно помечены липофильном красителя сделал, но DIR и DiI красители являются эквивалентными альтернативы и другие красители клеток могут быть использованы до тех пор, достаточно яркий, как отзывы в ^[16]. Даже при том, что экс естественных маркировка клеток с сделал, как было показано, не влияет на долгосрочный функцию ГСК, он имеет ограничение, что сделал (или любой другой химический краситель) разбавляют при делении клеток. С ГСК размножаться в течение первых дней после трансплантации, отношение сигнал-шум для этих клеток быстро ухудшается. Эндогенный маркировки клеток с помощью генетических манипуляций и экспрессии флуоресцентных белков является хорошей альтернативой метод, при условии, что флуоресцентные белки экспрессируются при достаточно высоких уровнях, чтобы генерировать сигнал детектируемый через кости черепа. Есть ряд альтернативных технiques доступные для выполнения визуализации HSPCs в пространстве костного мозга, каждый со своими преимуществами и ограничениями. Размещение волоконно-оптических устройств на основе изображений позволило визуализации восстановления костного мозга в длинных костей ^[8], в то время как конфокальной микроскопии после хирургического воздействия на кости и истончение костной эмали с хирургической дрели ^[12] подготовил подробные изображения HSPCs проживающих в периферийные районы длинных костей. Однако эти методы являются гораздо более агрессивным, чем описанный здесь, и поэтому не позволяют повторить сеансы визуализации упором на той же самой области костного мозга в той же мыши. Более того, вполне возможно, что эти методы могут влиять на клетки, наблюдаемые с учетом неизбежно ответ на значительный ущерб в окружающие ткани. HSPCs были отображены в течение коротких периодов времени через покровные размещенных над подакцизным, сломанных бедер ^[11], однако влияние этой суровой подготовки ткани на HSPCs не Клеаг и техника использовалась однозначно получить единую точку наблюдения времени. Исправлены кости были подразделяются на серийных срезах, окрашенных, и полученные изображения реконструирован в 3D-модели, обеспечивая превосходное разрешение 3D, особенно когда сосудистые слепки используются ^[17], а в последнее время лазерного сканирования Cytometry (LASC) был использован для получения количественной меры около HSPCs в месте, подчеркнул иммуноокрашивания ^[18], но не в состоянии обеспечить любую временную информацию о поведении клеток. Методы, описанные в этой новой техники обеспечивают сочетание хорошим разрешением в 3D, достаточной временной выборки для мониторинга клеток в 4D и они относительно неинвазивным, поэтому предлагает идеальное подход для достижения долгосрочного мониторинга HSPCs взаимодействующий с костного мозга микросреда.

Materials

Ketamine (Narketan 100 mg/ml)	Vetoquinol	407575 0107 C	Other anesthetics may be used in place of this.
Medetomidine (Domitor 1 mg/ml)	Elanco	134800-2	Other analgesics may be used in place of this.
Vibrant DiD cell labeling solution	Roche Products Ltd.	V22887	Other colors are available and may be used if required.
Lacrilube ophtalmic ointment	Allergan	n/a	avaliable by prescription by the local vet
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement	Associated Dental Products Ltd. via Kemdent	SUN527	We use shade A3, but any shade of cement can be used.
PBS	multiple equivalent
Insulin syringes	Terumo Medical Corporation	SS10M3109	1 ml, 31 G
Mouse restrainer	Harvard Apparatus	340031	Cone type (small)
Autoclaved forceps and scissors	Agar Scientific	AGT577<br/> AGT5034	Iris scissors – 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip)
Weigh boat and cement stirrer	VWR	611-1996/231-0370	5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser	Leica Microsystems		Call for quote
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)	Leica Microsystems	11506323	HCX IRAPO L lens
Custom designed mouse holder	Imperial College Engineering Workshop		See Figure 1 for details
Heating pad with rectal thermometer probe	BASi Instrumentation	FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502	Heat mat/ Control box/ Thermometer probe