Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Роман микродиссекция подход к Восстановление

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51693

⸱

5 июня 2014 г.

 , 
1Bacteriology and Parasitology, Tulane National Primate Research Center, 2Microbiology and Immunology, Tulane National Primate Research Center

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Микродиссекция была широко используется для проведения экспертизы ДНК, РНК и белка в ткани. Лазерная захвата микроскопии (НОК) является наиболее часто используемым методом, но новая техника фрезерные, mesodissection, является недавно доступны. Мы демонстрируем выделения РНК из mesodissected формалина фиксированной парафин тканей горки микобактерий туберкулеза гранулемы.

Аннотация

Микродиссекция был использован для изучения тканей на ДНК, РНК и белка уровнях уже более десяти лет. Лазерная захвата микроскопии (НОК) является метод наиболее распространенным микродиссекции используется и сегодня. В этой технике, лазер используется для фокально расплава термопластичный мембраны, которое закрывает секцию обезвоженную ткань 1. Срез ткани композит затем поднимается и отделен от мембраны. Хотя этот метод может быть успешно использован для ткани экспертизы, это занимает много времени и дорого. Кроме того, успешное завершение процедур с использованием этой техники требует использования лазера, что ограничивает его применение. Новый, более доступным и практичным микродиссекции подход называется mesodissection является возможным решением для ловушек LCM. Эта техника использует систему MESO-1/MeSectr фрезеровать нужный ткань от слайд установлен образца ткани при одновременном дозирования и аспирации жидкости с целью выделения нужного образца ткани врасходным мельница немного. Перед началом процесса вскрытия, пользователь выравнивает фиксированных формалином парафин (FFPE) скользить с гематоксилином и эозином окрашенных (H & E) ссылка слайд. После этого, оператор комментирует нужную область рассечение и приступает к препарировать соответствующий сегмент. Программа генерирует архивный образ вскрытия. Главное преимущество mesodissection является короткая продолжительность необходимости препарировать слайд, принимая в среднем десять минут от настройки, чтобы пробовать поколение в этом эксперименте. Кроме того, система значительно более экономически эффективным и удобным для пользователя. Небольшое неудобство в том, что это не так точен, как лазерная захвата микроскопии. В этой статье мы показали, как mesodissection может быть использован для получения РНК из слайдов из FFPE гранулем, вызванных микобактериями туберкулеза (МТБ).

Введение

Образцы традиционно вручную микродиссекции либо из всей ткани или слайдов с помощью иглы и скальпеля. Это требует четкого разделения между среза ткани интереса и окружающих тканей разделах 2. При нынешних достижений в области технологий молекулярной профилирования, наблюдается растущая потребность для оценки ткани на клеточном уровне. В связи с ограничениями ручной микродиссекции, методов, включая LCM были созданы, чтобы позволить большую точность изоляции. Этот метод позволяет исследователю выделить отдельные клеточные популяции из различных типов клеток и скольжения, которые затем могут быть использованы для последующих анализов, таких как экспрессии генов профилирования. Хотя очень эффективным для последующих анализов, НОК не без ограничений. Во-первых, НОК является дорогим и трудоемким процессом. Кроме того, из-за нестабильного характера РНК, часто вызов, чтобы получить высокое качество РНК из образцов LCM 2. В связи с диsadvantages из LCM, новые достижения в микродиссекции технологии по-прежнему необходимы, чтобы сделать его более доступным для большего числа исследователей в доступной и срочной основе.

Одним из таких продвижение в микродиссекции технологии теперь доступны является метод, известный как mesodissection. В этой технике машина используется для мельницы разделе аннотированный ткани интерес и всасывает ее в расходных мельницы бит 3. Затем этот образец может быть атмосферный в пробирку и используется для последующих применений. Преимущества этой системы в том, что это значительно дешевле и чувствительным временем. По нашему опыту, система позволяет вскрытие участка ткани легких гранулемы в десять минут. С другой стороны, традиционные НОК, вероятно, потребует часов, чтобы завершить процесс. Система позволяет оператору загружать эталонный слайд использовать в качестве сравнения, а также инструмент для аннотации. Кроме того создается отчет с изложением тыс.э область слайда, который был расчлененный. Есть две основные недостатки в mesodissection. Хотя эффективны при извлечении несколько ячеек, это сложно выделить одну ячейку. Кроме того, точность изображение, формируемое не ясно, как при использовании других микроскопов визуализации.

Туберкулез (ТБ) является одним из основных инфекционное заболевание убийца человечества во всем мире и является результатом заражения MTB. В большинстве человека в результате воздействия аэрозолей Mtb, инфекция латентно ограничивается. По крайней мере в 10 миллионов человек в год, это приводит к активной формой туберкулеза 4. Во время латентной инфекции, Mtb содержится в патологических поражения легких, известных как гранулемы. Поэтому было высказано мнение, что исход Mtb инфекции на уровне гранулемы 5 решили.

Здесь показано, как mesodissection могут быть использованы для microdissect гранулемы, вызванные MTB. Слайды, используемыевзяты из FFPE легочной ткани от зараженных макак-резусов. Для этой демонстрации, мы будем рассекать гранулемы во всей их полноте. Мы также показали, что РНК может быть получена из восстановленной ткани. Этот метод может быть применен для образцов ткани из различных других образцов, а затем используется для различных последующих анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Калибровка Mesodissection Прибор с 2iD ПО для обработки изображений

ПО для обработки изображений 2iD будет называться либо программного обеспечения или программы на оставшуюся часть этой статьи. Этот шаг необходим, чтобы правильно отслеживать изображение, а также выровнять несколько слайд-кадры.

  1. Включите инструмент и компьютер.
  2. Открытое программное обеспечение и выберите пункт "калибровки прибора".
  3. Калибровка этап путешествия с помощью джойстика. Переместить сцену, чтобы левом верхнем положении. Нажмите "SET" в рамках этапа 1 в программе.
  4. Переместить сцену, чтобы снизить правильную позицию. Нажмите "SET" в рамках этапа 2 в программе.
  5. Калибровка стремление, сначала нажав "Z-кнопку" поднять головки. Нажмите кнопку "аспирации импульса" и кнопку "рассечение" на джойстике, пока управления поршневого штока не достигнет верхней позиции. Нажмите "SET" в рамках этапа 3 программы.
  6. Нажмите кнопку "сброс аспирации &# 8221; Кнопка. После того, как поршень останавливается в нижнем положении Нажмите "SET" в шаге 4.
  7. Нажмите на кнопку "шкалы вкладке".
  8. Поместите калибровочный правителя на чистой стороне.
  9. Фокус микроскопа, если необходимо.
  10. Нарисуйте линию между двумя масштабные линейки с помощью мыши.
  11. Введите расстояние в поле с названием кнопки шаг 2. Нажмите "вычислить".
  12. Нажмите на вкладку "перекрестье". Поверните скорость двигателя до 1.
  13. Вставьте xScisor в головки. Нижняя головка сборки в ось г готового позиции, нажав кнопку «ось г". ПРИМЕЧАНИЕ: головной узел является большое сооружение на вершине рассечение инструментов. XScisor будет называться как расходный мельницы бит для оставшейся части статьи.
  14. Нажмите кнопку "рассечение заниматься" кнопку на джойстике. ПРИМЕЧАНИЕ: Эта кнопка расположена в верхней части джойстика.
  15. Определение центр вращения визуально. Для этого переместите центр перекрестия над центром вращения с помощью определенияПараметр г в шаге 1 программы. Используйте стрелки вверх и вниз в "х" и "у-оси", чтобы отрегулировать пиксели выровнять прицел. Нажмите кнопку "Готово", вкладку.
  16. Нажмите на иконку «Дом». ПРИМЕЧАНИЕ: Это представлено дома, находящегося в правом верхнем углу.

2. Создать исходного образа

  1. Наведите H & E слайд на сцене. Наведите непрозрачный крышку на верхней части слайда. Привод прибор с помощью джойстика к нужной области H & E слайда. Сохранить изображение генерируется. ПРИМЕЧАНИЕ: В любом вкладка "захвата ссылка" или вкладке "рассекают" могут быть использованы для завершения этого шага.

3. Совместите Tissue для вскрытия

  1. Нажмите кнопку "рассекать ткани" на главном экране.
  2. Заполните форму «оператор», «рассечение инвентарный номер", "ссылка номер доступа", "xScisor число штрих-код," & #8220; рассечение номер партии жидкость "," размер xScisor "и" Описание "на вкладке" Настройка ".
  3. Перейдите на вкладку "найти ткань".
  4. Импорт ранее сохраненные эталонного изображения.
  5. Поставьте безупречной FFPE слайд 5 микронной толщины на сцене. Перемещение этап к той же области, что и тот, изображенный в опорном изображении. Нажмите на вкладке "Вставка изображения".
  6. Нажмите на вкладку "Выравнивание". С помощью мыши и связанные стрелки, чтобы выровнять опорного изображения в незапятнанной изображения.

4. Комментировать Slide

  1. Перейдите на вкладку "аннотирование".
  2. Используйте мышь, чтобы нарисовать круг вокруг нужной области слайда, который будет микродиссекции.

5. Загрузите Расходные Mill Bit

  1. Заполните расходных мельница немного с желаемой буфера, здесь ПКД буфера, потянув поршень вверх и вниз в движения жидкости в несколько раз. Убедитесь в том, чтобы исключить воздухпузыри.
  2. Поднимите Z-ось, нажав кнопку "Z-ось".
  3. Загрузите расходных мельница немного в машине. Сделайте это, сдвинув расходных мельница немного в верхней части машины так, чтобы белая линия на приборной линии с черной линией на расходуемого мельницы бит. Нажмите кнопку "сброс стремление", чтобы позволить поршень быть снижены в правильное положение. ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть легко скользить расходных мельница немного. Если это не так, убедитесь, что выемки располагаются правильно.
  4. Нижняя Z-оси, еще раз нажав кнопку "Z-ось".

6. Рассеките ткани (рис. 4)

  1. Откройте вкладку "препарировать".
  2. Включите двигатель и аспирационных скорости до 1.
  3. Флажок "Показать отслеживания". Примечание: Это позволяет пользователю визуализировать расчлененный область в процессе вскрытия.
  4. После того, как готов рассекать, продолжают удерживать кнопку "участвовать", а также "аспирации и #8221; Кнопка при перемещении джойстика в направлении против часовой стрелки, чтобы рассекать ткани.
  5. Продолжить рассекать в направлении против часовой стрелки, пока аспирации не "полный" вкладка становится красным.

7. Слейте и удаление Расходные Mill Bit

  1. Поместите 0,5 мкл пробирке под кончиком расходуемого мельницы бит.
  2. Пресс-контроль "стремление" стержень быстро, чтобы извлечь образец в пробирке.
  3. Пресс с повышенной силой, чтобы извлечь отработанные расходные мельница немного.
  4. Промыть тканей фрагмент, потянув поршень назад. Нажмите поршень вперед, чтобы выразить оставшееся образца в расходных мельницы бит. Фрагмент ткани теперь будет содержаться в пробирке.

8. Lyse Образец протеиназой К пищеварения с последующей термообработкой

  1. Добавить 70 мкл ТЕ рН 8,5, содержащий 5 мкг протеиназы К в восстановленный образец ткани.
  2. Поместите образец в программируемой отопителя-качалке.
  3. Полное переваривание с помощью программируемого нагреватель-шейкер в следующих условиях: 60 ˚ С в течение 30 мин при 1500 оборотов в минуту; 82 ˚ С в течение 15 мин при 1500 оборотов в минуту; и 25 ˚ С в течение 1 мин при 450 оборотах в минуту. Образец готов для последовательных применений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Вышеупомянутый протокол показывает, как использовать новую технику mesodissection извлечь РНК из FFPE ткани слайдов. Эффективность этого протокола проявляется через FFPE слайды легких гранулемы из НПЗ, инфицированных Mtb в различных инфекционных стадиях. Рисунках 1-3 образы инструмента. Рисунке 4 показано, как происходит процесс вскрытия и полученное изображение генерируется программным обеспечением. Таблица 1 показаны результаты экстракции РНК с гранулемы из N...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Mesodissection является метод, который может быть применен к экстракции РНК из патологических слайдов поражения, вызванные широкий спектр патогенных микроорганизмов. Это необходимость, чтобы пользователь отслеживает изображение и выравнивает изображение правильно. Чтобы достичь этого, прибор должен быть откалиброван в соответствии с указаниями на ПО для обработки изображений. При вскрытии, если слайд и область интересов будучи расчлененным не совпадают, пользователь должен откалибровать прибор. Другим важным шагом в про...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы раскрывают, что нет конкурирующие между собой финансовые интересы.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить следующих NIH награды / subawards за поддержку данного исследования: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, и P51OD011104.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
MeSectrAvanSci BioMesodissector
400 нм xScisorsAvanSci BioДругие доступные размеры
THORAvanSci BioПрограммируемый нагреватель-шейкер
NanoDrop2000ThermoScientificND-2000
RNeasy FFPE набор для экстракции Qiagen73504
Ovation RNA-Seq FFPE System Nugen7150
QIAquick Набор для очистки ПЦР Цягень28104

Ссылки

  1. Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
  2. Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
  3. Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
  4. Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
  5. Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
  6. Mesodissection of fibrous tissue. AvanSciBio. , (2013).
  7. Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
  8. Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
  9. Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
  10. Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
  11. Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
  12. Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
  13. Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.

The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:

Teresa A. Hudock

to:

Deepak Kaushal

Теги

FFPEMESO 1
Роман микродиссекция подход к Восстановление
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.