Микродиссекция была широко используется для проведения экспертизы ДНК, РНК и белка в ткани. Лазерная захвата микроскопии (НОК) является наиболее часто используемым методом, но новая техника фрезерные, mesodissection, является недавно доступны. Мы демонстрируем выделения РНК из mesodissected формалина фиксированной парафин тканей горки микобактерий туберкулеза гранулемы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Роман микродиссекция подход к Восстановление
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Микродиссекция был использован для изучения тканей на ДНК, РНК и белка уровнях уже более десяти лет. Лазерная захвата микроскопии (НОК) является метод наиболее распространенным микродиссекции используется и сегодня. В этой технике, лазер используется для фокально расплава термопластичный мембраны, которое закрывает секцию обезвоженную ткань 1. Срез ткани композит затем поднимается и отделен от мембраны. Хотя этот метод может быть успешно использован для ткани экспертизы, это занимает много времени и дорого. Кроме того, успешное завершение процедур с использованием этой техники требует использования лазера, что ограничивает его применение. Новый, более доступным и практичным микродиссекции подход называется mesodissection является возможным решением для ловушек LCM. Эта техника использует систему MESO-1/MeSectr фрезеровать нужный ткань от слайд установлен образца ткани при одновременном дозирования и аспирации жидкости с целью выделения нужного образца ткани врасходным мельница немного. Перед началом процесса вскрытия, пользователь выравнивает фиксированных формалином парафин (FFPE) скользить с гематоксилином и эозином окрашенных (H & E) ссылка слайд. После этого, оператор комментирует нужную область рассечение и приступает к препарировать соответствующий сегмент. Программа генерирует архивный образ вскрытия. Главное преимущество mesodissection является короткая продолжительность необходимости препарировать слайд, принимая в среднем десять минут от настройки, чтобы пробовать поколение в этом эксперименте. Кроме того, система значительно более экономически эффективным и удобным для пользователя. Небольшое неудобство в том, что это не так точен, как лазерная захвата микроскопии. В этой статье мы показали, как mesodissection может быть использован для получения РНК из слайдов из FFPE гранулем, вызванных микобактериями туберкулеза (МТБ).
Введение
Образцы традиционно вручную микродиссекции либо из всей ткани или слайдов с помощью иглы и скальпеля. Это требует четкого разделения между среза ткани интереса и окружающих тканей разделах 2. При нынешних достижений в области технологий молекулярной профилирования, наблюдается растущая потребность для оценки ткани на клеточном уровне. В связи с ограничениями ручной микродиссекции, методов, включая LCM были созданы, чтобы позволить большую точность изоляции. Этот метод позволяет исследователю выделить отдельные клеточные популяции из различных типов клеток и скольжения, которые затем могут быть использованы для последующих анализов, таких как экспрессии ген....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Калибровка Mesodissection Прибор с 2iD ПО для обработки изображений
ПО для обработки изображений 2iD будет называться либо программного обеспечения или программы на оставшуюся часть этой статьи. Этот шаг необходим, чтобы правильно отслеживать изображение, а также выровнять несколько слайд-кадры.
- Включите инструмент и компьютер.
- Открытое программное обеспечение и выберите пункт "калибровки прибора".
- Калибровка этап путешествия с помощью джойстика. Переместить сцену, чтобы левом верхнем положении. Нажмите "SET" в рамках этапа 1 в программе.
- Переместить сцену, чтобы снизить правильную позицию. Нажм....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Вышеупомянутый протокол показывает, как использовать новую технику mesodissection извлечь РНК из FFPE ткани слайдов. Эффективность этого протокола проявляется через FFPE слайды легких гранулемы из НПЗ, инфицированных Mtb в различных инфекционных стадиях. Рисунках 1-3 образы инструмента. Рисунке 4 показано, как происходит процесс вскрытия и полученное изображение генерируется программным обеспечением. Таблица 1 показаны результаты экстракции РНК с гранулемы из N.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Mesodissection является метод, который может быть применен к экстракции РНК из патологических слайдов поражения, вызванные широкий спектр патогенных микроорганизмов. Это необходимость, чтобы пользователь отслеживает изображение и выравнивает изображение правильно. Чтобы достичь этого, прибор должен быть откалиброван в соответствии с указаниями на ПО для обработки изображений. При вскрытии, если слайд и область интересов будучи расчлененным не совпадают, пользователь должен откалибровать прибор. Другим важным шагом в про.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы раскрывают, что нет конкурирующие между собой финансовые интересы.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить следующих NIH награды / subawards за поддержку данного исследования: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, и P51OD011104.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 нм xScisors | AvanSci Bio | Другие доступные размеры | |
| THOR | AvanSci Bio | Программируемый нагреватель-шейкер | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE набор для экстракции | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick Набор для очистки ПЦР | Цягень | 28104 |
Ссылки
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer spe....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
