Стабилизация Гепатоцеллюлярной Фенотип используя оптимизированные синтетические покрытия

Summary

Эта статья будет сосредоточена на разработке полимерных покрытием поверхностей для долгосрочного, стабильного культура стволовых клеток получены человеческие гепатоциты.

Abstract

В настоящее время одним из основных ограничений в клеточной биологии является поддержание дифференцированного клеточного фенотипа. Биологические матрицы обычно используются для культивирования и поддержания гепатоцитов, полученных из первичных и плюрипотентных стволовых клеток. Несмотря на то, что биологические матрицы полезны, они позволяют в короткие сроки культивировать гепатоциты, ограничивая их широкое применение. Мы попытались преодолеть эти ограничения с помощью синтетического полимерного покрытия. Полимеры представляют собой один из самых широких классов биоматериалов и обладают широким спектром механических, физических и химических свойств, которые могут быть точно настроены по назначению. Важно отметить, что такие материалы можно масштабировать в соответствии со стандартами гарантированного качества и демонстрировать постоянство от партии к партии. Это важно, если клетки должны быть расширены для высокопроизводительного скрининга в фармацевтической индустрии тестирования или для клеточной терапии. Полиуретаны (ПУ) являются одной из групп материалов, которые показали многообещающие результаты в клеточных культурах. Представлены и обсуждены наши последние достижения в оптимизации поверхности с полиуретановым покрытием для долгосрочного культивирования гепатоцитов человека со стабильным фенотипом.

Introduction

Биологические материалы широко используются в поддержании и дифференциации плюрипотентных стволовых клеток ^1. В то время как позволяет, эти биологические субстраты часто содержат множество неопределенных компонентов. Матригель является широко используемым субстратом для культуры и дифференциации стволовых клеток. К сожалению, его переменный состав влияет функцию клеток и фенотип. Хотя разнообразие альтернативных, более определенные биологические матриц были использованы ^2-7, их животного происхождения или плохой масштабируемости делает их непригодными кандидатов для промышленного производства. Поэтому идентификация синтетические альтернативы, с определенным составом и надежной работы, являются ключевыми целями в исследовании стволовых клеток.

В попытке преодолеть ограничения неопределенных культивирования клеток субстратов, междисциплинарное сотрудничество между химией и биологией определили синтетические материалы со способностью поддерживать фенотип клеток. SynthEtic субстраты являются масштабируемыми, экономически эффективным, и могут быть изготовлены в сложных 3D структур, имитируя в естественных условиях окружающей среды. Благодаря этим свойствам синтетические субстраты были широко используются для поддержки и привод дифференцировку многих типах клеток ^8-10.

Расширенный и высокой пропускной анализы способствовали оперативно провести проверку синтетических материалов, из крупных библиотек, и доставлены новые материалы с гибкими свойствами с широкого применения в биомедицинских исследованиях и разработках ^11-13. Используя высокую пропускную способность, полимерной технологии скрининга микро-массив, мы быстро определили простой полиуретан (PU134), подходит для поддержания человека стволовых клеток, полученных гепатоцитов. Этот полимер был найден, чтобы быть выше на животных, полученных подложек в отношении дифференцировки гепатоцитов и функции ^14-16. Мы впоследствии оптимизировать процесс при нанесении покрытий, топографии и стерилизации для доступа эффектына полимерной производительности в стабилизации функцию гепатоцитов и продолжительность жизни. Это имеет важные последствия в отношении понимания основ гепатоцитов биологии для основе моделирования клеток и регенеративной медицины приложений.

Технология здесь описано представляет собой пример того, как поверхность из синтетического полимера могут быть оптимизированы, чтобы сохранить фенотип клеток. Мы считаем, что сочетание этой технологии с протоколом дифференцировки бесплатно гепатоцитов эффективность сыворотки имеет потенциал, чтобы обеспечить масштабируемое производство гепатоцитов для использования в моделировании в пробирке и регенеративной медицины.

Protocol

1. Синтез PHNGAD (поли [1,6-hexanodiol / неопентил гликоль / ди (этиленгликоль)--alt адипиновой кислоты] диол)

Схема 1: Синтез PHNAGD Схематическое представление синтеза PHNAGD.. PHNAGD готовили по реакции 1,6-Hexanodiol, диэтиленгликоль, neoppentyl гликоля и адипиновой кислоты. PHNAGD, поли [1,6-hexanodiol / неопентил гликоль / ди (этиленгликоль)--alt адипиновой кислоты] диол.

1. Применение термической обработки для мономеров 1,6-гександиол, ди (этиленгликоль) и неопентилгликоля при 40 ° С в течение 48 ч в вакуумной печи, чтобы удалить остатки воды. Разрешить к холоду до комнатной температуры под вакуумом.
2. Добавить 22 ммоль каждого мономера и адипиновой кислоты (55 ммоль) в два-горлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой бар и соединен с ловушкой Дина-Старка.
3. Поместите весь узел в вакууме и осторожно нагреть GLAssware при 40 ° С в течение 6 часов, с тем чтобы избежать поглощения влаги во время добавления химических в колбу.
4. Добавить с помощью шприца, по капле, 0,0055 моль катализатора титана (IV) бутоксиду.
5. Реакционную смесь перемешивают при 180 ° С, под _{атмосфере} N2 в течение 24 ч, и собирают остаточной воды в ловушке Дина-Старка. Дать продукту остыть до комнатной температуры.

2 Синтез PU134

Схема 2: Синтез PU134 Схематическое представление синтеза полиуретана PU134 134 был подготовлен в результате реакции 1,0 экв о PHNGAD с 2,0 экв в 4,4'-метиленбис (фенилизоцианат), с последующим добавлением 1,0. экв из 1,4-бутандиол удлинителя цепи.

1. Смешайте один эквивалент полиола PHNGAD (Mn ~ 1800 Да, 3,2 ммоль) с двумя эквивалентами 4«4-метилен (фенил изоцианат) (6,4 ммоль) в безводном N, N-диметилформамиде (12 мл).
2. Реакционную смесь перемешивают при 70 ° С, под _{атмосфере} N2.
3. Добавить с помощью шприца по каплям титанового катализатора (IV) бутоксид (0,8% мас).
4. После 1 часа, добавляют один эквивалент удлинитель цепи 1,4-бутандиол (3,2 ммоль). Увеличение температуры на 90 ° С и перемешивают в течение 24 ч под N ₂ атмосфере.
5. После реакции, собирают осаждением из полиуретана добавлением диэтилового эфира (гексан или воды также может быть использован) по каплям в реакционный раствор до тех пор, осаждение не происходит.
6. Центрифуга решение в 5300 мкг в течение 5 мин.
7. Декантировать супернатант и не высохнуть при 40 ° С в вакуумном сушильном шкафу до испарения растворителя.
   Примечание: Для того чтобы гарантировать, что конечный продукт реакции обладает правильные параметры в отношении к молекулярно-массовым распределением, функциональный ГроуPS полимера и температур плавления и стеклования, различные аналитические методы и методы могут быть использованы, например, гель-проникающей хроматографии или Fitr спектроскопии.

3 Получение PU134 Solutions

1. Взвешивают 200 мг PU134 в стеклянный флакон.
2. Развести PU134 до конечной концентрации 2% в ряде растворителей: хлороформ, комбинации хлороформа и толуола в соотношении 1: 1, тетрагидрофуран и комбинация тетрагидрофурана и дихлорметана в соотношении 1: 1.
   Примечание: Избрание правой растворителя варьируется в зависимости от полимера, чтобы использовать. Различные растворители обладают разные температуры кипения, что может повлиять на растворение полимера.
3. Встряхнуть раствор энергично в течение 20 мин при комнатной температуре с использованием шейкера со скоростью 200 мот / мин, до тех пор пока раствор не станет однородным и не наблюдается осадок.

4 Покрытие стеклах с PU134

1. Поставьте Rouй 15 мм ² покровное на спин нанесения покрытий.
2. Применение 50 мкл раствора PU134 друг с помощью пипетки. Регулировка громкости на PU134 решения соответственно для необходимого размера покровного сохраняя объем на поверхность соотношение пропорциональный.
3. Спин каждый покровное на 7 сек при 23 х г.
4. Воздух сухой покровное при комнатной температуре в течение по крайней мере 24 часов перед стерилизацией.

5 Облучение покровное

1. Гамма-облучение покровное с покрытием полимера с применением дозы 10 Грейс с помощью лабораторной облучатель в течение 12 мин.
2. УФ облучение с полимерным покрытием покровное использованием 30 Вт, УФ лампы в течение 16 минут с каждой стороны.
3. Поместите полимерным покрытием покровное в подходящем планшет для тканевых культур в соответствии с размером слайдов.

6 сканирующей электронной микроскопии

1. Золото слой полимера покровное путем напыления на 200 сек в атмосфере 5 х 10 ^-1 миллибар давления.
2. Захват мкгraphs из полимерной покрытием покровное использованием сканирующего электронного микроскопа при ускоряющем напряжении 20 кВ в режиме вторичной электронной визуализации.

7. атомно-силовой микроскопии Наблюдения

1. Сканирование площадью 20 х 20 мкм от поверхности полимера.
2. Настройте скорость сканирования от 1,32 Гц до 1,60 Гц.
3. Настройте разрешение 512 х 512 пикселей в отсканированном регионе.
4. Рассчитать среднеквадратичное (RMS или Rq) покрытия с использованием средних отклонениях по высоте, взятых из средней плоскости данных изображения, выражена следующим образом:
   
   Где Zi является текущее значение Z, и N является число точек в пределах данной области.
5. 7.5 Рассчитайте отклонение или среднее шероховатость поверхности (Ra) изображения с использованием,
   
   Где Z (х) является функцией, которая описывает тон поверхности профиля проанализированы с точки зрения высоты (Z) и в положении (х) образца по длине оценки "L". Ra представляет собой среднее значение поверхности по отношению к центральной плоскости.

8 Культура клеток и дифференцировки

1. Культура и дифференцировать человеческие эмбриональные линии стволовых клеток (чЭСК) H9, как описано в Hay ^17.
2. Отделить клеток с использованием диссоциации реагента и replate их на предметные стекла, покрытые PU134 на 9 день процесса дифференцировки, в присутствии бессывороточной среде, как описано в Szkolnicka ^18,19.
   Примечание: Использование ферментативной диссоциации клеток предпочтительно физической отряда клеток.

9. цитохрома Р450 функциональный анализ

1. Измерьте CYP3A деятельность в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Выдержите чЭСК полученных гепатоциты на 13-й день или День 19, и средства массовой информации без клеток - в качестве отрицательного контроля, с соответствующим подстрокаели в течение 5 ч при 37 ° С.
3. Соберите супернатанатах клеток и СМИ, проводить анализ в соответствии с инструкциями изготовителя.
4. Измерьте уровень CYP деятельности и нормализованного по отношению к площади поверхности (см ^2).

10. Иммуноокрашивание

1. Промыть чЭСК полученных гепатоциты с PBS, в течение 1 мин, повторить два раза.
2. Добавить ледяным 100% метанола, чтобы исправить клетки, место в -20 ° С в течение 10 мин.
3. Промыть клеток с PBS в течение 5 мин и повторяют дважды.
4. Инкубируйте клетки с PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. Аспирируйте PBST раствор и добавить соответствующее первичного антитела, разбавленного в PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, инкубируют при 4 ° С и при мягком помешивании O / N.
6. Промыть клетки с PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA в течение 5 мин и повторяют три раза.
7. Развести соответствующего антитела в PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, добавить к клеткам и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч при осторожном перемешивании.
8. Промыть клеток с PBS в течение 5 мин и повторяют три раза.
9. Добавить Mowiol 488 (DAPI, содержащий 1: 1000) в каждую лунку, добавить покровное осторожно, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха. Магазин фиксированной клеток при 4 ° С в темноте. Соблюдайте окрашивания с помощью микроскопа с соответствующим фильтром и люминесцентных ламп. Оптимизированные первичные и вторичные антитела, перечислены в таблице 1.

Results

Растворителя полимера влияет на топографию поверхности с полимерным покрытием

Полиуретан 134 солюбилизировали в хлороформе, либо по отдельности, либо в сочетании с толуол или тетрагидрофуран или дихлорметан, и предметные стекла с покрытием по спину с различных составов. Сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и атомно-силовой микроскопии (AFM), были использованы для характеристики физических свойств полимерных покрытий (фиг.1). Покрытие получается при испо...

Discussion

Многие из существующих методов, используемых для генерации гепатоциты из стволовых клеток зависят от неопределенных матриц животного происхождения. Эти субстраты могут быть дорогостоящими и весьма неоднородно, затрагивая функции клеток и стабильности, что представляет собой значительное препятствие для применения. Поэтому, мы провели экран для синтетических материалов, которые поддерживают культуру стволовых клеток, полученных гепатоцитов. Мы определили, простой полиуретан (PU134), образованный в результате полимеризаци...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Синтез, получение, нанесение покрытий и определение характеристик полимерных покровных стекол с покрытием PU134
Shaker	Edmun Bü hler	KS-15
Облучатель	CIS Biointernational	IBL 637
Spin Coater	Специальная система покрытий	P-6708
Сканирующий электронный микроскоп	Philips	XL30CPSEM
Атомно-силовой микроскоп	DimensionV Наноскоп, VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
УФ-лампа	ESCO
NanoScope программное обеспечение для анализа	VEECO		версия 1.20
Флуоресцентный микроскоп	Olympus	TH45200	использовать программное обеспечение Volocity 4
Планшеты для культивирования тканей	Corning, Великобритания	3527
стеклянные слайды	Научные лабораторные принадлежности	MIC3308
диэтиленгликоль	Sigma– Олдрич	93171
1,6-гександиол	Сигма&ндаш; Олдрич	240117
неопентилгликоль	Sigma– Олдрич	408255
Адипиновая кислота	Sigma– Aldrich	9582
безводный N,N-диметилформамид	Sigma– Олдрич	227056
Диэтиловый эфир	Sigma– Олдрич	676845
титана (IV) бутоксид	Сигма&nдаш; Олдрич	244112
1,4-бутандиол	Сигма&nдаш; Aldrich	493732
Вакуумная печь	Thermoscientific
4,4'-метиленбис(фенилизоцианат)	Sigma– Олдрич	101688
Тетрагидрофуран	Сигма&ндаш; Aldrich	401757
Sputter Coater Coater	Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate буферный физиологический раствор (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	Хранить при комнатной температуре
PBST, PBS состоит из 0,1% TWEEN 20	Научное лабораторное снабжение ООО	EC607
Метанол	Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
Сыворотка крупного рогатого скота Альбумин	Sigma-Aldrich, Великобритания	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	Содержит Tris HCl и глицерин в соответствии с инструкциями
Cell Culture and Functional Assay
CYP3A activity pGLO kit	Promega	V8902
Гепатозим	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013