Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

Краткое содержание

Трансплантация кожи хвоста является мощной моделью для изучения зависимого от Т-клеток отторжения и индукции толерантности во время аллогенных иммунных реакций у мышей. Преимуществами этого протокола являются незначительная инвазивная хирургия и простота мониторинга без необходимости жертвовать мышью-реципиентом.

Аннотация

Изучение реакций Т-клеток и их последствий во время распознавания аллоантигена требует модели, которая позволяет различать донорские и хозяйские Т-клетки, легко контролировать трансплантат и адаптировать систему для ответа на различные иммунологические вопросы. Медавар и его коллеги установили аллогенную трансплантацию кожи хвоста у мышей в 1955 году. С тех пор модель трансплантации кожи постоянно модифицировалась и адаптировалась для ответа на конкретные вопросы. Использование кожи хвоста делает эту модель легкой для оценки отторжения трансплантата, не требует ни обширной подготовки, ни глубокой анестезии, применима к животным с любым генетическим фоном, препятствует ишемическому некрозу и позволяет проводить химическое и биологическое вмешательство.

В общем, аллогенные Т-клетки CD4⁺ и CD8⁺ ответственны за отторжение аллотрансплантатов, поскольку они распознают несовпадающие основные антигены гистосовместимости из разных линий мышей. Было описано несколько моделей активации аллогенных Т-клеток у мышей, которым пересадили кожу. Идентификация молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) классов I и II у различных линий мышей, включая мышей C57BL/6, стала важным шагом на пути к пониманию и изучению Т-клеточных аллореакций. В описанной здесь модели трансплантации кожи хвоста трехточечной мутации (I-A^bm12) в антигенпрезентирующей борозде молекулы MHC класса II (I-A^b) достаточно, чтобы индуцировать сильную аллогенную активацию CD4⁺ Т-клеток у мышей C57BL/6. Кожные трансплантаты от мышей I-A^bm12 на мышах C57BL/6 отторгаются в течение 12-15 дней, в то время как сингенные трансплантаты принимаются в течение 100 дней. Отсутствие Т-клеток (у мышей CD3^-/- и Rag2^-/-) позволяет кожному трансплантату приживаться до 100 дней, что может быть преодолено путем переноса 2 x 10⁴ диких или трансгенных Т-клеток. Адоптивно перенесенные Т-клетки пролиферируют и продуцируют ИФН-γ у мышей, трансплантированных^{I-A bm12} Rag2^-/-.

Введение

Трансплантация твердых органов, таких как кожа, сердце и почки в настоящее время является стандартной процедурой в медицинской практике во всем мире ^1. Успешно пересаженные органы могут быть отвергнуты активации получателя иммунной системы, в которой признается основные антигены гистосовместимости донора. Поэтому пересаженные пациентам необходимо лечение с иммуносупрессивных препаратов ^2. Аллогенная трансплантация кожи у мышей было установлено Medawar и коллегами в 1955 году и был полезен для выявления целевых молекул позже описаны как главный комплекс гистосовместимости (МНС) класса I и II. С тех пор модель пересадка кожи была постоянно модифицировать и адаптировать для изучения роли Т-клеток подмножеств и актуальность химической и биологической вмешательства в подавлении отторжение трансплантата ^2-4. Кожа из уха и туловища труднее подготовить и более восприимчивы к гипоксии и некроза, чем хвостовой кожи ^5; ОднакоПроцедура трансплантации аналогично. Кроме того, мониторинг трансплантации кожи хвоста легко из-за характерной текстурой волос кожи.

Эта статья предусматривает подробную процедуру для МНС класса II несоответствия трансплантации хвост кожи, что позволяет для изучения различных аспектов CD4 ⁺ Т-клеточного отторжения трансплантата и толерантности у мышей. Естественный трехточечный мутации в МНС класса II молекул IA ^B (называемая IA ^{BM12) 6-9} достаточно, чтобы вызвать отказ от аллотрансплантатов кожи в C57BL / 6 мышей ^{8. BM12} молекула IA активирует CD4 ⁺ Т-клеток с различными αβ-Т-клеточного рецептора (TCR) цепи от мышей C57BL / 6, среди которых Vα2Vβ8-TCR-специфические Т-клетки, выявленные в того, чтобы генерировать TCR-трансгенной мыши ^10. Адоптивный перенос Vα2Vβ8-TCR-специфических Т-клеток был использован для создания модели отказ в иммунодефицитных C57BL / 6 RAG2 ^{- / -} мыши пересаженные с И.А. ^BM12 кожи.

Генетические различия между донором и реципиентом повлиять на исход принятия трансплантации и отвержения. Существуют различные типы трансплантатов: аутотрансплантаты являются трансплантации, изъятых у самого человека-реципиента; syngrafts и аллотрансплантаты являются трансплантации от генетически идентичных и генетически неродственных индивидуумов соответственно. Принятие различных аллогенных трансплантаций органов было продемонстрировано химической и биологической вмешательства у пациентов и мышиных моделях ^11,3,4. В основной подход, анти-CD3 антитела обработанных мышей C57BL / 6 показали длительное выживание И.А. ^BM12 хвостовой кожи (неопубликованные данные). Истощение CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток перед трансплантацией у мышей-реципиентов в результате принятия МНС класса I и II несогласованных трансплантатов (Откр. в ^12). Интересно, отторжение трансплантатов кожи зависит от присутствия CD4 ⁺ Т-клетки (rev. в ^12). В этой модели, ориентированные на конкретные взаимодействие между различными иммунных клеток, блокируя костимулирующие молекулы с антителами или подавления с регуляторных Т-клеток может индуцировать толерантность (неопубликованные данные). В самом деле, блокируя как CD40 и CD28 привело к долгосрочной толерантности аллотрансплантата кожи ^13,14.

Трансплантация Хвост-кожа легко выполнить и легко контролировать по сравнению с трансплантацией других органов. Кроме того, пересадка хвост кожи легко приготовить и менее восприимчивы к ишемии, чем другие ткани кожи. В отличие от вводимых анестетиков, использование анестезирующего газа (изофлуораном) во время трансплантации сокращает как порядок и время восстановления получатель. Curling трансплантата хвост кожи, что может привести к неполному заживления ран и отторжения трансплантата, предотвращается путем нанесения клея ткани. Кроме того, хвост-кожа трансплантации модель И.А. ^BM12 исключительно активизирует CD4 ^{+ Т-клетки в обоих иммунокомпетентных и иммунодефицитных мышей (одного и того же генетического фона) содействие интерпретацию результатов.}

Этот протокол описывает надежный, воспроизводимый и легко контролируется модель мыши, которая позволяет химической и биологической вмешательства. Модель предназначена для исследования отказ и терпимости индукцию трансплантации хвост кожи.

Протокол

В этом видео-публикации и протокола, все процедуры животных были проведены в соответствии с протоколом животных, утвержденной Кантональная администрации Базель-Штадт, Швейцария. Выполните все процедуры в стерильных условиях, где возможно.

1. Подготовка хирургии

1. Автоклав все хирургические инструменты и марлевые перед использованием.
2. Нагрейте теплый коврик и организовать хирургические инструменты на столе (табл. материалов / Методы).
3. Откройте палец полосы повязки. Применить вазелин на рану площадку с помощью ватного тампона (убедитесь, что марля полностью покрыта).
4. Взвесьте мышей и управлять обезболивания бупренорфин 0,05 мг / кг массы тела. Примечание: это обеспечит обезболивание сразу же после трансплантации.

2. Подготовка Tail-кожи для трансплантации

1. Усыпить мышей-доноров (например, И. А. ^BM12) за CO ₂ удушья и гisinfect хвосты с дезинфицирующим раствором до удаления.
2. Расположите хвост с черной полосой вниз на чистую пластиковую доску и разрезать его продольно по всей средней линии, что делает поверхностный разрез с участием только слой кожи.
3. Снимите кожу с хвоста, используя захватывающие щипцы.
4. Положите хвост шкуру в блюдо культуры 10 см клеток, наполненный 10 мл HBSS.

3. Хирургическая процедура

1. Обезболить мышей-реципиентов (например, C57BL / 6) при вдыхании 3% раствором изофлуораном в прозрачной индукционного поля. Примечание: Время 3-5 мин для мыши для достижения хирургического самолет анестезии. Используйте ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
2. Наведите курсор на теплой подушки и применять 1,5% изофлуораном через маску рта и ослов каждое животное рефлекс на носок щипать.
3. Бритье спинной сайт мышей-реципиентов (например, C57BL / 6) и удаления загрязняющих волоски с помощью сухой марлевой SWAB.
4. Лечить бритая трансплантации сайт с асептической решения.
5. Зажмите кожу щипцами в средней / вправо сайте тыльной и использовать изогнутые ножницы, чтобы сделать круглое разрез около 1 х 0,6 см.
6. Если кровотечение происходит, то очистить рану стерильным ватным тампоном.
7. Оцените размер разрез и вырезать трансплантат предполагаемого размера от хвостовой кожи с помощью скальпеля.
8. Обрезать углы закруглить пересадку.
9. Загрузите пересадку на скальпель, сухой свыше ССРХ на стерильной ватной палочкой и поместить его в привитой кровати мыши-реципиента.
10. Избегайте дублирования донора и принимающей кожи и нанести клей ткани на зоне контакта исключительно.
11. Нанесите штукатурку без складки вокруг талии мыши.
12. Применить клей не-эластичный бинт для фиксации пластыря к мыши (3 мм смещается).
13. Надрезать с ножницами около 3 мм в верхней брюшной сайте повязку. Примечание: Это позволит избежать трapping зубов мыши на этапе восстановления.
14. Снимите наркозно-рот-маска и держать пересаженных мышей на грелку, пока бодрствует.
15. Вернуться пересаженные мышам в их клетки только тогда, когда полностью восстановился и оценить их подвижность для того, чтобы повязка не слишком туго.
16. Прежде чем приступить к следующему хирургии Стерилизовать все хирургические инструменты с 70% этанола.

4. Послеоперационный уход

1. Добавить парацетамол, содержащего сироп в питьевую воду (4 мг / мл) и вводить его в течение 7 дней.
2. Вернуться мышь в комнату животных, как только он выздоровел.
3. Внимательно следить мышей для клинических признаков, включая депрессию или других поведенческих изменений (в еде или неподвижности), нарушение внешнего вида (отсутствие ухода) или позы (Pilo-монтажных или сгорбившись осанки) в течение времени, повязка на месте (1 неделя).

5. Бинты Удаление (6-7 дней после трансплантации)

1. Anesthetize мышей при вдыхании 3% изофлураном раствора в прозрачном окне индукции (см. выше).
2. Вырезать повязку и штукатурки с ножницами артерии и осторожно удалите их. Примечание: во избежание растяжения сайта трансплантации.
3. Монитор пересаженных мышам наличие клинических признаков (см. 4.3) и забил отторжение трансплантатов кожи (табл. 1). Примечание: Система оценка трансплантат пользуется различными волос текстур на хвостовой кожи по сравнению с спинной-кожи. Появление трансплантата и его отклонения относится к категории в 3 классах. Аллогенная кожи (МНС II несоответствие, например, И. А. ^BM12) трансплантаты C57BL / 6 иммунокомпетентных мышей, как правило, отклоняются в течение 12-15 дней после трансплантации (собственные данные и ^15-20).

Результаты

В первом подходе C57BL / 6, были пересажены с IA ^BM12 аллотрансплантатами и IA ^б syngrafts. После удаления повязки, трансплантатов заметных признаков заживления ран без закрытия зоны контакта в мышей C57BL / 6 (фиг. 1а). После удаления повязки, клеточный воспаление CD4 ⁺ Т привело к появлению некротических участков (красные точки) и отказ от IA ^BM12 аллотрансплантатами в C57BL / 6 мышей в течение 13 дней после трансплантации (рис. 1В-C, заполн...

Обсуждение

Трансплантация кожи является широко используемым методом изучения неприятие и зависимость от Т-клеток терпимости. Так была создана модель пересадка кожи, несколько адаптации и изменения были применены. В описанной выше процедуре, IA ^BM12 трансплантации кожи хвоста осуществляется с помощью анестезирующего газа (изофлураном). Использование газа анестезии уменьшает время исполнения и мышей восстановления, что снижает нагрузку на трансплантированных мышей. Процедура использует клей ткани, чтобы зафиксировать хвос...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бетадин стандартный раствор	Mundipharma
Ватный тампон	Carl Roth GmbH	31025060
Dafalgan, UPSA	Bristol Myers Squibb UPSA
Полоски для пальцев Hansaplast	Beierdorf AG	REF.76861
Клей для гистоакриловой ткани	Braun	REF.1050052
Leukotape classic, 2 см x 10 м	BSN Medical SAS	REF.02204-00
PBS, фосфатно-солевой буфер, pH 7,4	Invitrogen	10010015	GIBCO
Стерильная марля, 5 x 5 см, 8 слоев	MaiMed GmbH	21010
Узкие щипцы	FST	11003-12
Ножницы тонкой радужной оболочки изогнутые	FST	14095-11
Ножницы тонкой радужной оболочки	FST	14094-11
Ножницы Майо	FST	14010-15
Ножницы для артерий шариковый наконечник 11,5 см	FST	14080-11
Щипцы для тканей	FST	11021-14
Лезвие хирургическое No 20	Swann-Morton LTD	3006	Углеродистая сталь
Ручки хирургических лезвий	Swann-Morton LTD
Шприц, 1 мл	ARTSANA		Одноразовый
темгезик, бупренорфин	ESSEX Chemie AG		0,3 мг/мл
Тарелка для культуры тканей 10 см, 60,1 см2	TPP
Vaseline	Vifor SA
Теплая прокладка	Solis		Type 223