Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

Трансплантация твердых органов, таких как кожа, сердце и почки в настоящее время является стандартной процедурой в медицинской практике во всем мире ^1. Успешно пересаженные органы могут быть отвергнуты активации получателя иммунной системы, в которой признается основные антигены гистосовместимости донора. Поэтому пересаженные пациентам необходимо лечение с иммуносупрессивных препаратов ^2. Аллогенная трансплантация кожи у мышей было установлено Medawar и коллегами в 1955 году и был полезен для выявления целевых молекул позже описаны как главный комплекс гистосовместимости (МНС) класса I и II. С тех пор модель пересадка кожи была постоянно модифицировать и адаптировать для изучения роли Т-клеток подмножеств и актуальность химической и биологической вмешательства в подавлении отторжение трансплантата ^2-4. Кожа из уха и туловища труднее подготовить и более восприимчивы к гипоксии и некроза, чем хвостовой кожи ^5; ОднакоПроцедура трансплантации аналогично. Кроме того, мониторинг трансплантации кожи хвоста легко из-за характерной текстурой волос кожи.

Эта статья предусматривает подробную процедуру для МНС класса II несоответствия трансплантации хвост кожи, что позволяет для изучения различных аспектов CD4 ⁺ Т-клеточного отторжения трансплантата и толерантности у мышей. Естественный трехточечный мутации в МНС класса II молекул IA ^B (называемая IA ^{BM12) 6-9} достаточно, чтобы вызвать отказ от аллотрансплантатов кожи в C57BL / 6 мышей ^{8. BM12} молекула IA активирует CD4 ⁺ Т-клеток с различными αβ-Т-клеточного рецептора (TCR) цепи от мышей C57BL / 6, среди которых Vα2Vβ8-TCR-специфические Т-клетки, выявленные в того, чтобы генерировать TCR-трансгенной мыши ^10. Адоптивный перенос Vα2Vβ8-TCR-специфических Т-клеток был использован для создания модели отказ в иммунодефицитных C57BL / 6 RAG2 ^{- / -} мыши пересаженные с И.А. ^BM12 кожи.

Генетические различия между донором и реципиентом повлиять на исход принятия трансплантации и отвержения. Существуют различные типы трансплантатов: аутотрансплантаты являются трансплантации, изъятых у самого человека-реципиента; syngrafts и аллотрансплантаты являются трансплантации от генетически идентичных и генетически неродственных индивидуумов соответственно. Принятие различных аллогенных трансплантаций органов было продемонстрировано химической и биологической вмешательства у пациентов и мышиных моделях ^11,3,4. В основной подход, анти-CD3 антитела обработанных мышей C57BL / 6 показали длительное выживание И.А. ^BM12 хвостовой кожи (неопубликованные данные). Истощение CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток перед трансплантацией у мышей-реципиентов в результате принятия МНС класса I и II несогласованных трансплантатов (Откр. в ^12). Интересно, отторжение трансплантатов кожи зависит от присутствия CD4 ⁺ 12). В этой модели, ориентированные на конкретные взаимодействие между различными иммунных клеток, блокируя костимулирующие молекулы с антителами или подавления с регуляторных Т-клеток может индуцировать толерантность (неопубликованные данные). В самом деле, блокируя как CD40 и CD28 привело к долгосрочной толерантности аллотрансплантата кожи ^13,14.

Трансплантация Хвост-кожа легко выполнить и легко контролировать по сравнению с трансплантацией других органов. Кроме того, пересадка хвост кожи легко приготовить и менее восприимчивы к ишемии, чем другие ткани кожи. В отличие от вводимых анестетиков, использование анестезирующего газа (изофлуораном) во время трансплантации сокращает как порядок и время восстановления получатель. Curling трансплантата хвост кожи, что может привести к неполному заживления ран и отторжения трансплантата, предотвращается путем нанесения клея ткани. Кроме того, хвост-кожа трансплантации модель И.А. ^BM12 исключительно активизирует CD4

Этот протокол описывает надежный, воспроизводимый и легко контролируется модель мыши, которая позволяет химической и биологической вмешательства. Модель предназначена для исследования отказ и терпимости индукцию трансплантации хвост кожи.

В этом видео-публикации и протокола, все процедуры животных были проведены в соответствии с протоколом животных, утвержденной Кантональная администрации Базель-Штадт, Швейцария. Выполните все процедуры в стерильных условиях, где возможно.

1. Подготовка хирургии

1. Автоклав все хирургические инструменты и марлевые перед использованием.
2. Нагрейте теплый коврик и организовать хирургические инструменты на столе (табл. материалов / Методы).
3. Откройте палец полосы повязки. Применить вазелин на рану площадку с помощью ватного тампона (убедитесь, что марля полностью покрыта).
4. Взвесьте мышей и управлять обезболивания бупренорфин 0,05 мг / кг массы тела. Примечание: это обеспечит обезболивание сразу же после трансплантации.

2. Подготовка Tail-кожи для трансплантации

1. Усыпить мышей-доноров (например, И. А. ^BM12) за CO ₂ удушья и гisinfect хвосты с дезинфицирующим раствором до удаления.
2. Расположите хвост с черной полосой вниз на чистую пластиковую доску и разрезать его продольно по всей средней линии, что делает поверхностный разрез с участием только слой кожи.
3. Снимите кожу с хвоста, используя захватывающие щипцы.
4. Положите хвост шкуру в блюдо культуры 10 см клеток, наполненный 10 мл HBSS.

3. Хирургическая процедура

1. Обезболить мышей-реципиентов (например, C57BL / 6) при вдыхании 3% раствором изофлуораном в прозрачной индукционного поля. Примечание: Время 3-5 мин для мыши для достижения хирургического самолет анестезии. Используйте ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
2. Наведите курсор на теплой подушки и применять 1,5% изофлуораном через маску рта и ослов каждое животное рефлекс на носок щипать.
3. Бритье спинной сайт мышей-реципиентов (например, C57BL / 6) и удаления загрязняющих волоски с помощью сухой марлевой SWAB.
4. Лечить бритая трансплантации сайт с асептической решения.
5. Зажмите кожу щипцами в средней / вправо сайте тыльной и использовать изогнутые ножницы, чтобы сделать круглое разрез около 1 х 0,6 см.
6. Если кровотечение происходит, то очистить рану стерильным ватным тампоном.
7. Оцените размер разрез и вырезать трансплантат предполагаемого размера от хвостовой кожи с помощью скальпеля.
8. Обрезать углы закруглить пересадку.
9. Загрузите пересадку на скальпель, сухой свыше ССРХ на стерильной ватной палочкой и поместить его в привитой кровати мыши-реципиента.
10. Избегайте дублирования донора и принимающей кожи и нанести клей ткани на зоне контакта исключительно.
11. Нанесите штукатурку без складки вокруг талии мыши.
12. Применить клей не-эластичный бинт для фиксации пластыря к мыши (3 мм смещается).
13. Надрезать с ножницами около 3 мм в верхней брюшной сайте повязку. Примечание: Это позволит избежать трapping зубов мыши на этапе восстановления.
14. Снимите наркозно-рот-маска и держать пересаженных мышей на грелку, пока бодрствует.
15. Вернуться пересаженные мышам в их клетки только тогда, когда полностью восстановился и оценить их подвижность для того, чтобы повязка не слишком туго.
16. Прежде чем приступить к следующему хирургии Стерилизовать все хирургические инструменты с 70% этанола.

4. Послеоперационный уход

1. Добавить парацетамол, содержащего сироп в питьевую воду (4 мг / мл) и вводить его в течение 7 дней.
2. Вернуться мышь в комнату животных, как только он выздоровел.
3. Внимательно следить мышей для клинических признаков, включая депрессию или других поведенческих изменений (в еде или неподвижности), нарушение внешнего вида (отсутствие ухода) или позы (Pilo-монтажных или сгорбившись осанки) в течение времени, повязка на месте (1 неделя).

5. Бинты Удаление (6-7 дней после трансплантации)

1. Anesthetize мышей при вдыхании 3% изофлураном раствора в прозрачном окне индукции (см. выше).
2. Вырезать повязку и штукатурки с ножницами артерии и осторожно удалите их. Примечание: во избежание растяжения сайта трансплантации.
3. Монитор пересаженных мышам наличие клинических признаков (см. 4.3) и забил отторжение трансплантатов кожи (табл. 1). Примечание: Система оценка трансплантат пользуется различными волос текстур на хвостовой кожи по сравнению с спинной-кожи. Появление трансплантата и его отклонения относится к категории в 3 классах. Аллогенная кожи (МНС II несоответствие, например, И. А. ^BM12) трансплантаты C57BL / 6 иммунокомпетентных мышей, как правило, отклоняются в течение 12-15 дней после трансплантации (собственные данные и ^15-20).

В первом подходе C57BL / 6, были пересажены с IA BM12 аллотрансплантатами и IA б syngrafts. После удаления повязки, трансплантатов заметных признаков заживления ран без закрытия зоны контакта в мышей C57BL / 6 (фиг. 1а). После удаления повязки, клеточный воспаление CD4 + Т привело к появлению некротических участков (красные точки) и отказ от IA BM12 аллотрансплантатами в C57BL / 6 мышей в течение 13 дней после трансплантации (рис. 1В-C, заполненные символы), в то время как syngrafts терпели до 100 дней (рис. 1В-C, открытые символы). Эти данные показывают, прогрессирование острого отторжения ИА BM12 трансплантатов у иммунокомпетентных мышей C57BL / 6.

Различные исследования показывают, что отказ от МНС класса II несогласованной хвостовой кожи зависит от наличия аллогенных CD4 + Т-клеток (Откр. в 12). Действительно, Т-клеточный дефицит CD3ε - / - </ SUP> мыши и Т-и В-клеток с дефицитом RAG2 - / - мышей показали полное заживление раны и переносится И.А. BM12 прививает до 100 дней (рис. 2), в то время как мышей C57BL / 6 отклонил трансплантатов в течение 13 дней (рис. 2) . Принятие И.А. BM12 несогласованной хвостовой кожи позволяет для изучения аллогенных CD4 + Т-клеток и их функций эффекторных в мышиной модели без серьезных патологий заболеваний.

Чтобы разорвать сложившийся толерантности в CD3ε - / - и RAG2 - / - мыши, CD4 + Т-клетки восприимчиво переданы: 2 х 10 4 поликлональные C57BL / 6 CD4 + Т-клетки были достаточны, чтобы вызвать отказ от IA BM12 трансплантатов в течение 14 дней ( данные не представлены). Передача 50000 до 100000 C57BL / 6 CD4 + Т-клеток не ускорить процесс отторжения трансплантата в CD3ε - / - и RAG2 - / - мышей. Эти данные подчеркивают роль allogenЭПК CD4 + Т-клеток в острого отторжения трансплантата кожи модели.

Преимущество этого фрагмента кожи трансплантации модели является то, что функциональный анализ CD4 + Т-клеток можно легко сделать с помощью приемных передачи антиген-специфических CD4 + Т-клеток. Трансгенной мыши ПРО 9 считается идеальным инструментом для очерчивания активацию и фенотипическую поведение населения без влияния неспецифических CD4 + Т-клеток. Передача 2 х 10 4 антиген-специфичных клеток ПРО было достаточно, чтобы вызвать отказ от IA BM12 трансплантатов в RAG2 - / - мыши в течение 13 дней (рис. 3А-B). Кроме того, клетки ПРО легко выделить и можно отслеживать с помощью экспрессии цепей TCR-Vα2Vβ8 (фиг. 3C). Распространение ПРО клеток и производство цитокинов в IA BM12 пересадить RAG2 - / - были исследованы мышей. Клетки ПРО распространение extensiVely как определено eFluor670 разбавления анализа (рис. 3D) и до 30% клеток ПРО производства IFN-γ после PMA-стимуляции (рис. 3Е).

Взятые вместе, эти данные показывают, что относительно небольшое число аллогенных CD4 + Т-клетки необходимы, чтобы вызвать неприятие И.А. BM12 пересадке кожи, что делает эту модель идеальной для анализа аллогенных Т-клеток с минимальным тяжелой патологии.

Рисунок 1. Трансплантация мышей с аллогенной и сингенной хвостовой кожи. (A) C57BL / 6 мышей были пересажены с аллогенной (IA BM12) и сингенных (IA б) фрагмента кожи (N = 5 на группу). Фотографии иллюстрируют аллотрансплантаты (слева) и syngrafts (справа) после удаления повязки на 7-й день. (В) Заброшенные и (С)выживание кожи не прививает с 7 дня до дня отклонения или окончательного контроля (день 100). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

. Рисунок 2 Аллотрансплантаты допускаются при отсутствии Т-клеток у мышей Выживание RAG2 -. / - И.А. BM12 - мыши пересадка кожи пересаженные в C57BL / 6, CD3ε - / - и RAG2 - / - мышей (N = 4-6 на группу) и иллюстрация отклоненных и принятых трансплантатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Конкретные CD4 + Т-клетки против И.А. BM12 размножаются и производят IFN-γ в ходе отторжения трансплантата (А) Заброшенные и (Б) выживание И.А. BM12 трансплантатов хвост кожи в RAG2 -. / - Мыши (N = 5) адаптивно переданы с 2 х 10 4 антиген-специфических клеток ПРО. (C) Vα2Vβ8-окрашивание клеток, выделенных из ПРО лимфатических узлов мышей трансгенных ПРО. (D) eFluor670 разбавление пролиферирующих клеток ПРО и (E) IFN-γ производство PMA- стимулировали клетки ПРО, выделенные из лимфатических узлов И.А. BM12 кожи привиты RAG2 - / -. мышей на 9-й день после приемный ПРО клеточный перенос (п = 5 мышей) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобыпосмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Прививка система оценка. Появление трансплантата и его отказа является катеgorized в 3 классах, пользуясь различными текстурами волос на хвост-и спинной-кожи.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.