Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экстракорпоральное поджелудочной железы Organogenesis от дисперсных мышиных эмбриональных прародителей

13.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51725

⸱

19 июля 2014 г.

 ,  ,  , 
1Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, School of Life Sciences, Swiss Institute for Experimental Cancer Research, 2DanStem, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Трехмерная способ культивирования описано в данном протоколе повторяет развитие поджелудочной железы от дисперсных эмбриональных клеток-предшественников мышь поджелудочной железы, включая их существенного расширения, дифференцировки и морфогенеза в разветвленной органа. Этот метод поддается визуализации, функциональной вмешательства и манипуляции нише.

Аннотация

Поджелудочная железа является важным органом, который регулирует гомеостаз глюкозы и выделяет пищеварительные ферменты. Исследования эмбриогенеза поджелудочной железы привели к разработке протоколов производства клеток поджелудочной железы из стволовых клеток 1. Весь эмбриональный орган может быть культивирован на нескольких стадиях развития 2-4. Эти методы культивирования оказались полезными для тестирования лекарств и визуализации процессов проявки. Тем не менее, расширение органа очень ограничено, и морфогенез не может быть точно воспроизведен, поскольку орган уплощен.

Мы предлагаем трехмерные (3D) условия культивирования, которые обеспечивают эффективную экспансию диссоциированных эмбриональных предшественников поджелудочной железы мыши. Манипулируя составом питательной среды, можно получить либо полые сферы, состоящие в основном из предшественников поджелудочной железы, расширяющихся в своем исходном состоянии, либо сложные органоиды, которые развиваются до более зрелых расширяющихся предшественников и дифференцируются в эндокринные, ацинарные и протоковые клетки и которые спонтанно самоорганизуются, напоминая эмбриональную поджелудочную железу.

Мы показываем здесь, что процесс in vitro повторяет многие аспекты естественного развития поджелудочной железы. Эта система культивирования подходит для исследования того, как клетки взаимодействуют друг с другом для формирования органа, уменьшая его первоначальную сложность до нескольких предшественников. Это модель, которая воспроизводит трехмерную архитектуру поджелудочной железы и поэтому полезна для изучения морфогенеза, включая поляризацию эпителиальных структур и ветвление. Также целесообразно оценить реакцию на механические сигналы ниши, такие как жесткость и влияние на тенсегрити клетки.

Введение

Органная культура предоставляет полезную модель, мосты разрыв между комплекса, но весьма актуальны в естественных условиях исследований и удобный, но приблизительное моделирование моделей клеточных линий. В случае поджелудочной железы, нет клеточной линии совершенно эквивалентна поджелудочной железы предшественников хотя преобразуются клеточных линий, имитирующих эндокринных и экзокринных клетках. Весь поджелудочной железы взрослых не могут культивироваться; изолированные эндокринные островки может поддерживаться в течение нескольких недель без клеточной пролиферации и Срезы ткани могут быть сохранены в пробирке в течение нескольких часов 5. Эмбриональные поджелудочной железы культура была широко используется не только для изучения ее развитие, но и исследовать эпителиальные-мезенхимальных взаимодействия 4,6,7, чтобы изображение обрабатывает 8 или химически мешать них 9. Два органа способы культивирования в основном используются: первый заключается в культивировании поджелудочной рецепторы на фибронектина покрытием пластин 2, что является удобnient для целей визуализации; Второй вариант заключается в культуре органы на фильтрах на воздух и жидкой фаз 3,4, который наилучшим образом сохраняет морфогенез. Хотя очень полезно, эти методы приводят к определенной степенью выравнивания; расширение предшественников очень ограничено по сравнению с нормальным развитием и исходного население комплекс, включающий все типы клеток поджелудочной железы и клеток мезенхимы.

Возможность культуры и расширить распределенных первичных клеток является ценным для изучения клональные отношения и раскрыть внутренние свойства изолированных типов клеток 10. Сугияма и др. 11. Может поддерживать поджелудочной железы предшественников и эндокринные клетки-предшественники, которые сохранили некоторые функциональные символы в течение 3-5 дней в культуре на фидерных слоях. Pancreatospheres, сродни нейросферы 12 и mammospheres 13, были расширены от взрослых островков и протоков клеток хотя природа прародителей / стволовых клеток, которые генерируют эти сферы не ясно. Кроме того, в отличие от физиологического развития, pancreatospheres содержится некоторые нейроны 14,15. Сферы были также недавно получены из эмбриональных поджелудочной железы предшественников 16,17 и регенерации поджелудочных желез 18 с хорошим расширением предшественников и последующего дифференцирования, но не повторять морфогенез.

3D модели от дисперсных и часто определенных клеток, которые самоорганизуются в миниатюрных органов в последнее время процветала и имитации развития или взрослых оборот нескольких органов, таких как кишечник 19,20, желудка 21, печень 22 простаты 23 и трахеи 24. В некоторых случаях, морфогенез развития и дифференциации были обобщены в 3D от ЭС клеток, как это имеет место в оптических чашек 25, 26 кишечник или головного мозга 27.

Здесь мы десывают способ расширить диссоциированные мультипотентные поджелудочной предшественники в эшафот 3D Matrigel, где они могут дифференцироваться и самоорганизовываться.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол направлен расти поджелудочной органоиды, полученные из мышиных E10.5 диссоциирован эпителиальные клетки поджелудочной железы.

Протокол требует этического одобрения экспериментов на животных.

1. Препарирование спинной поджелудочной Bud от E10.5 эмбрионов мыши

  1. Жертвоприношение приурочена-беременных мышей в эмбриональный день (E) 10,5 откройте живота с ножницами, удалите два рога матки и разместить их в блюдо 10 см Петри заполнены холодной растворе фосфатного буфера (PBS) или Дульбекко изменение поддерживающая среда (DMEM), держится на льду. Общая эксперимент от жертвы, чтобы посева клеток делается в 60-90 мин, чтобы предотвратить повреждение клеток.
  2. Отделите матку на отдельные сегменты эмбрионов с использованием маленькие ножницы. Трансфер одного эмбриона, чтобы блюдо 35 мм чашки с холодной PBS и визуализировать его под микроскопом рассекает с подсветкой сверху. С рассечение пинцетом удалить окружающий мышцы, децидуальной и желток сас и подвергать эмбрион. Поместите эмбриона обратно в холодную DMEM среде. Эмбрионы могут быть легко переданы с помощью 3 мл пластик передачи пипетки / капельницу. Изолировать каждого отдельного эмбриона таким же образом, прежде чем продолжить.
  3. Наведите эмбрион в чистую 35 мм чашки Петри в PBS.
    1. Используйте тонкие щипцы (0,05 мм ширины), чтобы удалить переднюю конечность. Аккуратно вставьте щипцы в открытии отделить пищеварительный тракт от региона спинного мозга (рис. 1). ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Чтобы удобнее видеть желудок, снять верхнюю часть тела эмбриона, до сердца и хвостовой области ниже желтка стебля.
    2. Найдите желудка, печени и кишечника. Используя щипцы, изолировать желудочно-кишечный тракт от желудка до кишечника и поместите его в холодную DMEM на льду (рис. 1). Спинной поджелудочной бутон крепится на спинке, кзади от желудка (рис. 1).
    3. Изолировать каждого отдельного желудочно-кишечного тракта в СимиЛар образом, прежде чем продолжить. Если эмбрионы должны быть генотипированы, собирать хвост в момент вскрытия и сохранить каждый индивидуальный желудочно-кишечного тракта в другом лунку в 24-луночный планшет с холодной DMEM на льду.
  4. Поместите один желудочно-кишечного тракта в чистом 35 мм чашки Петри в холодной PBS. Теперь использовать подсветку снизу в светлом поле, чтобы визуализировать и анализировать спинной поджелудочной бутон под микроскопом рассечение. Эти условия будут оптимизировать визуализацию объемов. Использование электролитическим-заточенные иглы вольфрама или 20 г шприц иглы, изолировать поджелудочной бутон с минимальными мезенхимы, как это возможно вокруг эпителия (рис. 1).
    1. Передача изолированный почка в чашку Петри, содержащую холодный раствор диспазы (1,25 мг / мл) в течение 2-3 мин. С этой точки, передача может наиболее удобно делать с пламенем вытащил 50 мкл стеклянных капилляров, прикрепленных к ротовой управлением гибкой трубки. В качестве альтернативы, но с более RISK потерять почку, использовать 10 мкл автоматической пипетки (Pipetman) с соответствующими пластиковыми наконечниками.
    2. Выполните поджелудочной бутон стремление и выброс под микроскопическим контролем. Поставьте поджелудочной бутон назад в ФБР. Далее очистить изолированный поджелудочной бутон из мезенхимы с иглами и нежным стремление с помощью стеклянный капилляр (рис. 1).
    3. Когда весь мезенхимы удаляется, промойте поджелудочной бутон в холодной PBS; передавать каждый бутон в холодной среде DMEM в отдельные лунки (60-луночные лотки мини-заполнены 10 мкл холодной DMEM). Важно, чтобы не удалить мезенхиму в диспазы, что делает ткань очень липким.

2. Покрытие и культура дисперсных клеток

  1. Перенести расчлененный эпителий от всех эмбрионов с пламенем вытащил стеклянный капилляр в конических скважин 60-а мини-ящиках с 10 мкл PBS для полоскания.
    1. Перенести бутон в 10 мкл трипсина 0,05% ай пусть это инкубируют при 37 ° С в течение 4 мин. Инактивации трипсина путем передачи бутон в скважину с 10 мкл DMEM + 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS).
    2. Диссоциируют клеточной суспензии стремлением через тонкий капилляр вытащил с пипетки съемник. Важно, чтобы избежать пузырьков на этой стадии в то время как пипетки вверх и вниз для диссоциации клеток. Поджелудочная железа органоиды оптимально начинать с небольших групп по 5-15 клеток и, следовательно, частичное диссоциации рекомендуется (рис. 1).
  2. Бассейн клетки от нескольких эмбрионов в пробирку Эппендорфа с целью минимизации изменений, возникающих из-за индивидуальной обработки. Развести клеточной суспензии в охлажденном Матригель в соотношении 1:03. Аликвоты этой смеси в 96-луночный планшет, 8 мкл / лунку или в пластине оптимизированной для работы с изображениями (см. ниже).
  3. Инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин, позволяя Матригель сгущаться. Заполните лунки 70 мкл среды выбора (Органоид или сфера, см. таблле 1 и 2) и оставить в увлажненной среде, содержащей 5% СО 2 и 95% воздуха при 37 ° С
  4. Замените носитель каждый 4-й день. Ежедневно следить за укреплением поджелудочной колонии и документировать процесс визуализации.
  5. Малые молекулы или белки интереса может быть добавлен в среду на этой стадии для интерференционных экспериментов, как сообщалось ранее 28.

Таблица 1: Органоид среда.

Название материала Фото со Концентрация Концентрация в конечном среды Объем складе
Пенициллин-стрептомицин 100% 1% 50 мкл
Замена Сыворотка KnockOut (дополнение) 100% 10% 500 мкл
2-меркаптоэтанол 14.3 М 0,1 мм 1 мкл
Форболмиристатацетата (РМА) 16 мкМ 16 нМ 5 мкл
Y-27632 (ингибитор ROCK) 50 мМ 10 мкм 1 мкл
EGF 50 мкг / мл 25 нг / мл 2,5 мкл
Рекомбинантного человеческого R-spondin 1 250 мкг / мл 500 нг / мл 10 мкл
- Или -
Рекомбинантный мышь R-spondin 1 250 мкг / мл 500 нг / мл 10 мкл
Рекомбинантного человеческого FGF1 (кФРФ) 100 мкг / мл 25 мкг / мл 1,25 мкл
Гепарин (Liquemin) 2500 ед / мл 2,5 Ед / мл 2 мкл
Рекомbinant человека FGF10 100 мкг / мл 100 нг / мл 5 мкл
DMEM/F-12 4,412.25 мкл
Общий 5000 мкл

Таблица 2: Сфера среднего.

Название материала Фото со Концентрация Концентрация в конечном среды Объем складе
Пенициллин-стрептомицин 100% 1% 50 мкл
B27 x50 (дополнение) 100% 10% 100 мкл
Рекомбинантного человеческого FGF2 (оФРФ) 100 мкг / мл 64 нг / мл 3.2 мкл
Y-27632 (ингибитор ROCK) 50 мМ 10 мкм 1 мкл
DMEM/F-12 4845,8 мкл
Общий 5000 мкл

3. Визуализация Прогрессирование развития Органоид

  1. Органоиды изображения либо в день или по промежуток времени микроскопии с использованием флуоресцентного покадровой микроскоп. Для визуализации промежуток времени, использовать XY (Z) автоматизированные перевернутый флуоресцентный микроскоп.
  2. Депозитные маленькие капельки 3 мкл в 4-луночных планшетах или стеклянным дном пластин, заполненных 2-5 мл среды. Изображение с 10-кратным дальней цели. Примечание: Трансгенные мыши, экспрессирующие люминесцентные индикаторов могут быть использованы. Фильм 1 показывает например первоначальное расширение органоидов от Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + мышей 4. Ядерный GFP позволяет пользователю отслеживать клетки как отдельные объекты, но аналогичные принципы могут быть применены для отслеживания клетки с флуоресценции мембран, такихкак мТл / мг мышей 29.
  3. Начните покадровой визуализации 3 ч после посева клеток, чтобы избежать фокус заносы и установить программное обеспечение, контролирующее автоматизации принять 1 изображения / час в течение 3 и более дней в течение определенных вручную позиций. Для каждой позиции, приобрести дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображения, а также сигнал GFP, отчетности флуоресцентный выражение маркер.

4. Восстановление органоидов для гистологии

  1. Поместите 96-луночного планшета на льду и удалить среды, заменив его льдом PBS. Это частично depolymerizes Матригель.
  2. Осторожно аспирации каждого отдельного Органоид, удаляя окружающую Матригель помощью чаевых 1000 мкл для того, чтобы не нарушить общую архитектуру. Трансфер друг Органоид в колодец с ледяной холодной PBS. Держите тарелку на льду. Прямая фиксация в Матригель также возможно.
  3. Закрепить Органоид в течение 15 мин в 4% параформальдегида (PFA), криоконсервированием его в сахарозе и вставлять его в желатин. Процесс другОрганоид для cryosectioning и гистологии как описано ранее (Johansson и соавт., 2007) 4.

5. Восстановление органоидов для ПЦР и биохимии

  1. Поместите 96-луночного планшета на льду и удалить среды. Добавить 60 мкл на лунку RNAlater того, чтобы стабилизировать и защищать клеточную РНК.
  2. Лишить гель в каждую лунку механически частично деполимеризующим его на льду. Либо восстанавливать отдельные органоиды помощью чаевых 1000 мкл для того, чтобы не нарушить общую архитектуру или восстановить весь колодец (с Матригель), нарушая гель механически с мкл кончика 200. С помощью наконечника с 1000 мкл для передачи содержания также в РНКазы свободной нелипкой пробирку Эппендорфа хранили на льду.
  3. Вымойте скважин с 60 мкл RNAlater и добавить оставшийся контент к той же трубки Эппендорф.
  4. Спин пробирки в течение 5 мин при 500-1000 мкг при 4 ° С.
  5. Удалить супернатант, оставив только 20-30 мклиз RNAlater в трубке вместе с осадком. Для биохимии, хранить образцы как можно более сухой.
  6. Не стоит сразу же заморозить образцы в RNAlater; хранить при 4 ° CO / N (чтобы RNAlater тщательно проникают в ткани). Ткань можно хранить при -20 ° С в течение длительного хранения и в дальнейшем могут быть обработаны для разрушения ткани и извлечения небольшого количества РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

E10.5 спинной поджелудочной предшественники диссоциированные и высевают в 3D Матригель резюмировать развитие поджелудочной железы. Предшественники легче всего следуют с люминесцентными журналистами. В нашем случае мы использовали трансгенных мышей, которая выражает ядерного GFP белка контролируется Pdx1 промоутер (Pdx1-Ngn3-ER ТМ-nGFP) (фильм 1) в отсутствие тамоксифена и, таким образом, не активируя Neurog3 4 (рис. 2).

С Органоид сред...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Крупномасштабное производство функциональных бета-клеток в пробирке остается неэффективной 1. В этом сложном контексте, развития биологические исследования могут помочь расшифровать точные сигналы, которые необходимы для дифференциации функциональных бета-клеток. Этот протокол позволяет для поддержания, расширения и дифференциации эмбриональных панкреатических клеток-предшественников в пробирке. Это включает в себя формирование производящих инсулин бета-клеток, которые не со-выражать других ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа финансировалась последовательно на НКРС границ в генетике пилотного премии, в отношении несовершеннолетних диабета исследовательский фонд Гранта 41-2009-775 и Грант 12-126875 от Det Фри Forskningsråd / Sundhed ог Sygdom. Авторы благодарят лабораторию Spagnoli за проведение видеосъемки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пенициллин-стрептомицинGibco15070-063Запас при -20 °°; C
Замена сыворотки KnockOut (добавка)Gibco10828-028Запас поддерживается при -20 °°; C
2-меркаптоэтанолSigma Aldrich3148-25MLЗапас держится на уровне 4 ° C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)Calbiotech524400-1MGЗапас поддерживается при -20 °°; C
Y-27632 (ингибитор ROCK)Sigma Aldrichab120129Запас при -20 °C. Внимание! Стабильность/источник является частым источником проблем.
ЭФРSigma AldrichE9644-2MGStock держится на уровне -80 ° C
Рекомбинантный человеческий R-спондин 1R& D4645-RS-025/CFЗапас держится на уровне -80 °°; C
Рекомбинантная мышь R-спондин 1R& D3474-RS-050Запас держится при -80 °°; C
Рекомбинантный человеческий FGF1 (aFGF)R& D232-FA-025Складские запасы хранятся при температуре -80 °°; С - не включать для увеличения выработки бета-клеток
Гепарин (Ликемин)ДроссафармСток держать при 4°С; C
Рекомбинантный человек FGF10R& D345-FG-025Складской запас при -80 °°; C
DMEM/F-12Gibco21331-020
Пенициллин-стрептомицинGibco15070-063На складе -20 ° C
B27 x50 (дополнение)Gibco17504-044Запас поддерживается при -20 °°; C
Рекомбинантный человеческий FGF2 (bFGF)R& D233-FB-025Запас держится при -80 °°; C
MatrigelCorning356231Stock держится на уровне -20 ° C
Трипсин 0,05%Gibco25300-054Запас держится на уровне 4 ° C
RNAlater - РНК-стабилизирующий реагентQiagen76104Хранить в RT
Dispase Sigma AldrichD4818-2MGРабочая концентрация: 1,25 мг/мл. Запас держится при -20 °°; C
BSA для восстановленияMilipore81-068Для восстановления цитокинов  - запас поддерживается при -20 ° C
Фетальная телячья сыворотка (FCS)Gibco16141079Поголовье поддерживается на уровне -20 °°; C
60-луночные лотки MicroWellSigma AldrichM0815-100EA
4-луночные планшетыThermo Scientific176740
95-луночные пластины F дноGreiner Bio6555180
Glas донные пластиныIbidi81158
Утилизационные стеклянные микропипеткиBlaubrand708745
микроскопCell® Станция формирования изображений (моторизованная перевернутая стойка Olympus IX81), оснащенная камерой Hamamatsu ORCA ER B7W и кубом и коробкой Лудина.
Стенд Leica DMI6000 B в окружении куба и коробки Ludin, оснащенной камерой Leica DFC365 FX и программным интерфейсом AF6000 Expert/Matrix.
ОбъективOlympus UPLAN FL NA 0,30 воздушный 9,50 мм 10X дальний дистанция;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0,30 воздух 11,0 мм 10X большое расстояние

Ссылки

  1. Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
  2. Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
  3. Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
  4. Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
  5. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
  6. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
  7. Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , 3979(2012).
  9. Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
  10. Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
  11. Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
  12. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  13. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
  14. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
  15. Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
  16. Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
  17. Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
  18. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. , (2013).
  19. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. , (2009).
  20. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  21. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
  22. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
  23. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
  24. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
  25. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  26. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
  27. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
  28. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
  29. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D-культивированиематриксный скаффолд Matrigelдиссоциация клетокизоляция зачатков поджелудочной железыформирование органоидовтаймлапс-микроскопиягистологический анализдифференцировка клеток
Экстракорпоральное поджелудочной железы Organogenesis от дисперсных мышиных эмбриональных прародителей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.