Разработан подход к определению оптимальных условий концентрации вируса для проб воды небольшого объема с использованием шипов аденовируса человека. Описанные здесь методы используются для определения параметров концентрации для других вирусных мишеней и применяются для крупномасштабных экспериментов по концентрации вируса.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Малый Порядок громкости для концентрации вируса из воды
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мелкомасштабная концентрация вирусов (объем образца 1-10 л, здесь моделируется с помощью образцов воды с шипами 100 мл) - это эффективный и экономичный способ определения оптимальных параметров концентрации вирусов. Вирусы могут быть концентрированы из воды с помощью фильтрации (электроположительной, электроотрицательной, стекловаты или исключения размера), затем вторичное концентрирование говяжьим экстрактом для высвобождения вирусов с фильтрующих поверхностей и, наконец, третичное концентрирование, в результате которого получается концентрат вирусов объемом 5-30 мл. Для определения оптимальных процедур концентрации были оценены два различных электроположительных фильтра (стеклянный/целлюлозный фильтр [1MDS] и нанооксид алюминия/стеклянный фильтр [NanoCeram]), а также различные методы вторичного концентрирования; Метод Celite, в котором оценивались три различных размера частиц Celite (мелкие, средние и крупные) с последующим сравнением этого метода с установленным методом органической флокуляции. Различные элюирующие добавки также оценивались на предмет их способности усиливать высвобождение частиц аденовируса (AdV) с поверхностей фильтра. Мелкодисперсные частицы цэлита восстанавливали уровни AdV40 и 41, аналогичные уровням при использовании установленного метода органической флокуляции, когда вирусные шипы добавлялись во время вторичной концентрации. Фильтр из стекла и целлюлозы восстанавливал более высокие уровни AdV40 и 41 по сравнению с фильтром из нанооксида алюминия и стекловолокна. Хотя это и не является статистически значимым, добавление 0,1% элюанта говяжьего экстракта полифосфата натрия восстановило на 10% больше частиц AdV по сравнению с неизмененным экстрактом говядины.
Введение
Человека кишечные вирусы являются важными возбудителями заболеваний, переносимых водой 1-3, но, как правило, присутствуют в небольших количествах в загрязненных вод окружающей среды, что делает их обнаружение трудно без концентрации. Процедуры, используемые, чтобы сконцентрироваться вирусы, как правило, включать в себя стадию фильтрации с последующим элюированием фильтра, и вторичную концентрацию фильтра элюата. Общая процедура фильтрации основан на использовании заряженных мембран, таких как электроположительных фильтров (недавно рассмотренных в 4,5). Эти фильтры полагаться на захвате вирусы, взвешенные в воде, используя электростатические взаи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка посуды и корпусов фильтров
- Если не указано иное, стерилизовать все стекла, корпуса фильтров и решения при 121 ° С в течение 15 мин. Для обеспечения стерильности, охватывают все отверстия или открытые поверхности с обеих алюминиевой фольги или ленты обеспеченных бумаги перед стерилизацией.
- Соберите фильтрационного аппарата путем присоединения корпус фильтра (диаметр 47 мм) до 1 л плече колбу Эрленмейера. Соберите фильтры, необходимые: диаметр 47 мм электроположительных / электроотрицательным фильтры дисков.
- Подготовка 1 л 1,5% говяжьего экстракта (флокулянты, производит FLOC частицы, когда рН раст....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Выбор целит
Три различных типа целит были испытаны до выбора самых эффективных варианта. Celites с тонкой и средних частиц, образующихся самые высокие аденовирусные восстановления. Использование больших celites привело к снижению извлечения как для AdV40 и 41 (диапазон 32% -100%) (рисунок 1). Средние восстановление аденовируса 40 были на 144% ± 52% (штраф), 115% ± 28% (средняя) и 82% ± 53% celites (большой) частицы и AdV41, 132% ± 39% (Хорошо), 83% ± 25% (средний) и 50.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Электроположительные фильтры могут быть использованы в концентрации вирусов из воды; Однако эти фильтры могут отличаться по своей структуре и композиции, которая, в свою очередь изменяют их эффективность. Усугубляет эту проблему, капсида структуры и сборы варьироваться в зависимости от штаммов вируса, требующих техники концентрации быть адаптированы для обеспечения оптимального восстановления 15. Через простых модификаций существующих методов концентрации (например, электроположительные фильтры, говя.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Отсутствие конкурирующих финансовых интересов.
Мнения, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не обязательно отражают взгляды или политику Агентства по охране окружающей среды США. Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов не является одобрением или рекомендацией к использованию.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить доктора Николаса Эшболта и доктора Г. Шея Фаута за их рецензирование рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Аденовирус 40 сток | ATCC | VR-931 | |
| Аденовирус 41 сток | ATCC | VR-930 | |
| Тиосульфат натрия | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 мм | Аргонид | N/A | |
| 1MDS 47 мм | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Предфильтр 47 мм | Millipore Corp. | ||
| Глицин | Sigma | 50046-1KG | |
| Полифосфат натрия | Acros Organics | 390930010 | |
| трипсин | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Соляная кислота | Fisher | A481-212 | |
| BBL Экстракт говядины | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Экстракт говядины | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Система для ПЦР в реальном времени | ABI | N/A | |
| Корпус фильтра из нержавеющей стали | Millipore Corp. | ||
| Набор для экстракции ДНК крови | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Калькулятор | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
Ссылки
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
- Westrell, T., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
