Методическая статья

Руководство по В естественных условиях Регистрация отдельных единиц из Optogenetically Идентифицировано корковых ингибиторной интернейронов

18.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51757

⸱

7 ноября 2014 г.

 , 
1Institute of Neuroscience, University of Oregon

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем нашу стратегию получения стабильных, хорошо изолированных одноединичных записей от идентифицированных тормозных интернейронов в коре мыши, находящейся под наркозом. Нейроны, экспрессирующие ChR2, идентифицируются по их реакции на синий свет. Метод использует стандартное оборудование для внеклеточной записи и служит недорогой альтернативой визуализации кальция или визуальному наложению патчей.

Аннотация

Одна из основных задач в области нейрофизиологии в том, чтобы охарактеризовать свойства реагирования и функции многочисленных видов ингибирующее клеток в коре головного мозга. Мы здесь поделиться нашим стратегии получения устойчивых, хорошо изолированные единичные записи с определенных ингибирующих интернейронов в наркозом коры мыши с помощью метода, разработанного Лиме и 1 коллегами. Записи выполняются в мышей, экспрессирующих Channelrhodopsin-2 (ChR2) в конкретных нейронных групп населения. Члены населения идентифицируются по их реакции на короткой вспышке синего света. Эта техника - называют "PINP", или Фотостимуляция-помощь идентификации нейрональных популяций - могут быть реализованы с помощью стандартного оборудования внеклеточной записи. Она может служить в качестве недорогой и доступной альтернативы визуализации кальция или визуально-управляемой коммутации, с целью ориентации внеклеточные записи на генетически определенных клеток. Hпрежде чем мы предоставляем набор руководящих принципов для оптимизации метода в повседневной практике. Мы усовершенствовали нашу стратегию специально для таргетинга парвальбумина-положительным (PV +) клеток, но обнаружили, что это работает для других типов интернейронов, а, например, соматостатин-выражающей (SOM +) и calretinin-выражения (CR +) интернейронов.

Введение

Характеристика мириад типов клеток, составляющих мозг млекопитающих, была центральной, но долгое время ускользающей целью нейрофизиологии. Например, свойства и функции различных типов тормозных клеток в коре головного мозга представляют большой интерес, но до сих пор относительно неизвестны. Отчасти это связано с тем, что обычные методы слепой записи in vivo ограничены в своей способности различать различные типы клеток. Ширина внеклеточного шипа может быть использована для отделения предполагаемых парвальбумин-положительных ингибирующих нейронов от возбуждающих пирамидальных клеток, но этот метод подвержен ошибкам как I, так и II типа2,3. В качестве альтернативы записанные нейроны могут быть заполнены, восстановлены и окрашены, чтобы впоследствии подтвердить их морфологическую и молекулярную идентичность, но это кропотливый и трудоемкий процесс. В последнее время генетически идентифицированные популяции тормозных интернейронов стали доступны с помощью визуализации кальция или визуально контролируемых записей патчей. В этих подходах вирусная или трансгенная экспрессия кальциевого репортера (такого как GCaMP) или флуоресцентного белка (такого как GFP) позволяет идентифицировать и охарактеризовать типы клеток, определяемые экспрессией промотора. Эти подходы используют двухфотонную микроскопию, которая требует дорогостоящего оборудования, а также ограничены поверхностными слоями коры головного мозга из-за светорассеивающих свойств тканей мозга.

Недавно Лима и коллеги1 разработали новое приложение оптогенетики для нацеливания электрофизиологических записей на генетически идентифицированные типы нейронов in vivo, названное "PINP" - или фотостимуляция с помощью идентификации нейронных популяций. Запись проводилась у мышей, экспрессирующих Channelrhodopsin-2 (ChR2) в определенных субпопуляциях нейронов. Члены популяции идентифицируются по их реакции на короткую вспышку синего света. В отличие от многих других оптогенетических приложений, цель состоит не в том, чтобы манипулировать функцией цепи, а в том, чтобы просто идентифицировать нейроны, принадлежащие к генетически определенному классу, которые затем могут быть охарактеризованы во время нормальной работы мозга. Метод может быть реализован с помощью стандартного оборудования для внеклеточной записи и, следовательно, может служить доступной и недорогой альтернативой кальциевой визуализации или визуальному наложению коммутаций. В данной статье мы описываем подход к ПИНФингу конкретных типов клеток в анестезируемой слуховой коре, исходя из предположения, что более общие точки могут быть с пользой применены в других препаратах и областях мозга.

В коре головного мозга PINP имеет особые перспективы для исследования свойств реакции ингибирующих интернейронов in vivo. ГАМКергические интернейроны включают в себя небольшое, гетерогенное подмножество корковых нейронов4. Недавно было показано, что различные подтипы, отмеченные экспрессией определенных молекулярных маркеров, выполняют различные вычислительные роли в корковых цепях5-9. По мере совершенствования генетических инструментов в конечном итоге станет возможным различать морфологически и физиологически разделяемые типы, которые попадают в эти широкие классы. В этой статье мы поделимся нашей стратегией получения стабильных, хорошо изолированных одноединичных записей от идентифицированных тормозных интернейронов в коре головного мозга мыши, находящейся под наркозом. Эта стратегия была разработана специально для нацеливания на парвальбумин-положительные (PV+) клетки, но мы обнаружили, что она работает и для других типов интернейронов, таких как интернейроны, экспрессирующие соматостатин (SOM+) и кальретинин-экспрессирующие (CR+). Несмотря на то, что PINPing концептуально прост, на практике он может оказаться удивительно непреклонным. Методом проб и ошибок мы узнали ряд советов и приемов, которые могут быть полезны тем, кто пытается использовать этот метод.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: следующий протокол в соответствии с Национальными Институтами принципов здравоохранения, утвержденным университета штата Орегон уходу и использованию животных комитета.

1. Острый хирургии

  1. Обезболить животное смесью кетамина-медетомидин коктейль, с помощью внутрибрюшинного (IP) инъекции (Таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, используемые в этих экспериментах генерируются путем скрещивания CRE-зависимых ChR2-EYFP трансгенной LINE10 к интернейрон линии драйверов (Pvalb-iCre11, PV +; SST-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Вирусный доставка ChR2 или смежных опсинов должен одинаково хорошо работать, предполагая аналогичные уровни экспрессии получаются.
  2. Перед началом операции убедитесь, что экспонаты животных не реагирует на нежной пальца щепоткой. Повторно вводить обезболивающие в течение всего эксперимента по мере необходимости, чтобы поддерживать эту глубину анестезии. При использовании инъекционных анестетиков, возможно имплантировать IP катетер для инъекций обслуживания.
  3. Держать животное гидратированный физиологическим раствором или раствором лактата Рингера в течение всего эксперимента (примерно 3 мл / кг / час), например, с помощью соответствующим образом разбавленного обезболивающий коктейль для инъекций обслуживания (таблица 1).
  4. Поместите животное в стереотаксической или другой головной холдинговой аппарата. Убедитесь, что череп хорошо закреплены. Это очень важно для поддержания стабильных записи одной ячейки.
  5. Применить opthalamic мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость. Поддерживать температуру тела в 36.5-37 ° C.
  6. Выполните цистерн для слива дополнительной устойчивости записи. Используя лезвие скальпеля, удалить ткань от задней поверхности черепа, чтобы выставить большой цистерны. Сделайте небольшой ник в твердой мозговой оболочке, чтобы слить спинномозговую жидкость. Используйте только самый кончик лезвия, и избежать контакта мозжечка или ствола мозга.
  7. Используя скальпель, выполнить небольшую трепанацию черепа (~ 2 мм 2) по сравнению с кортикальной области, представляющей интерес (для слуховогокора, примерно -2,3 мм кзади от темени, 4,5 мм сбоку от средней линии).
  8. Удалить твердую мозговую оболочку и покрытия подвергаются кору со слоем теплой агарозы 0,5 - 1 мм (1,5% агарозы в физиологическом растворе, 0,9% NaCl; применяют при ~ 37 ° C). Держите агарозном влажной в течение эксперимента, периодически применяя несколько капель физиологического раствора.

2. Запись Set-до

  1. Подготовьте вольфрамовым электродом (7-14 МОм, 127 мкм в диаметре, 12 ° коническая наконечник, с эпоксидным покрытием). Суперклей электрод к стеклянной капиллярной трубки и добавить термоусадочной трубки для захвата (рисунок 1).
  2. Установите электрод на моторизованной (или гидравлического) микроманипулятором, установите путешествовать ортогональна поверхности коры. Слайд проволочную основу под кожу, против черепа. Избегать контакта с мышц на стороне головы и задней части шеи, поскольку они могут генерировать электромиографические артефакты.
  3. Amplify электрический сигнал, используя внеклеточный усилительЛи фантастические э подходит для одной единицы записи, предпочтительно оснащен режиме проверки сопротивления. Монитор постоянный пики активности (полосовой 300 - 5000 Гц) с двумя осциллографов и набор активных акустических систем. Здесь, записанные данные оцифрованы постоянно с частотой дискретизации 10 кГц; шипы извлекаются форума.
  4. Предварительный электрод через агарозы, пока наконечник достигает поверхности коры. Соблюдайте этот шаг через микроскоп. "Ноль" эта позиция на микроманипулятором.
  5. Чтобы лучше аппроксимируют глубину записи, визуально подтвердить, что кончик электрода выходит из поверхности коры на глубине нулю при снятии электрода в конце проникновения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: несоответствие между показаниями манипулятора и наблюдаемого положения электрода указывает, что он дрейфовал по отношению к ткани. Это может быть вызвано нестабильностью мозга или животного или манипулятора дрейфа.
    1. В качестве дополнительной проверки, чтобы обеспечить, чтоэтот нуль уставка соответствует поверхности коры, контролировать стимул-вызывала потенциалов поля при продвижении через первые несколько сотен микрометров ткани. При мониторинге полевых потенциалов, опустите нижнюю полосовой фильтр отсечки внеклеточной усилителя 10 Гц. Подтверждение, что полярность локального потенциала поля вокруг изменяет глубину ~ 100 мкм, вблизи слоя I / II пограничного 13. Это является надежным ориентиром для слуховой коры, но она может отличаться для других областей коры.
  6. Установите оптического волокна, соединенный с источником света синего (рисунок 2) на ручном микроманипулятором. Использование микроскопа, позиционировать кончик волокна как можно ближе к поверхности агарозы, как это возможно. Сосредоточьте луч, где электрод будет проникать в ткань.
  7. Регулировать выход источника света с блоком управления, способным обеспечить доставку TTL (транзисторно-транзисторной логики) импульсов указанной ширины и ДлительностиN- например, Ардуино (фиг.3), компьютер ввода / вывода карты (как показано), или коммерчески доступным генератор импульсов.
    1. Контролировать сигнал на обоих осциллографов.
  8. Измерение полной мощности света (Mw) на конце оптического волокна с использованием измерителя мощности. Используйте это значение для расчета освещенности (мВт / мм 2) путем деления на площади поперечного сечения сердечника волокна. Начинают с величиной интенсивности в диапазоне 10 - 15 мВт / мм 2 и отрегулировать вниз, если это необходимо, до тех пор, артефакты не будут устранены.
  9. Проверка на легких артефактов с электродом в агарозы, на пороге ткани. Начните поиск импульсов (например, 30 мс импульсы света, 500 мс межстимульный интервал (ISI)).
    1. Исключите переходные легкие артефакты (рисунок 4) путем перестановки оптического волокна по отношению к электроду для изменения угла падающего света. Если артефакты сохраняются, попробуйте уменьшить силу света. В гое редкий случай, что артефакты не могут быть полностью устранены (только свести к минимуму), продлить срок поисковой импульса. Это может помочь в выявлении истинных нервных шипы.

3. Прямо ПИЯФ-в "

  1. Предварительный электрод медленно через мозг со скоростью примерно 1 мкм / сек. Используйте один осциллограф для контроля текущей деятельности. С другой стороны, провоцировать лазерных импульсов.
  2. Прислушайтесь к слабым "хэш" легких-вызвала шипами на звуковой монитор, который показывает, что электрод приближается ячейку ChR2 + и часто могут быть восприняты задолго до того, электрический сигнал очевидно на экране осциллографа. Медленная скорость заранее.
    Примечание: Если ячейка находится непосредственно на пути электрода, светло-вызывала активность будет расти больше (и громче). Как электрод приближается один интернейрон, хэш будет решить в небольших, но четко определенных шипы размером единой и формы.
  3. Как только LiGHT-вызывала всплески являются достаточно большими, чтобы вызвать офф индивидуально на экране осциллографа, начинают это делать. Регулировка масштабирования на горизонтальной оси, чтобы наблюдать точную форму шипа сигнала.
  4. Остановитесь и ждите ткани урегулировать. Не поддавайтесь искушению, чтобы переместить электрод ближе к камере. Этот шаг является критическим для стабильной записи. Если через несколько минут отношение сигнал-шум не улучшилась - то есть, ткани осела, но это не принесло клетку ближе к кончику электрода - продвижение 5 мкм дальше и ждать снова.
    1. Повторите этот процесс, пока либо пик или впадина потенциала действия не может быть достоверно захватили с порога напряжения, установленным значительно выше уровня шума (например, +/- 300 мкВ или более).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Там мало риск ложных срабатываний или двусмысленности, когда PINPing ингибирующие интернейроны. Большинство клеток может легко следовать серию импульсов с длительностью 30 мс и интер-Пульсебе интервал 500 мс, или быстрее, с надежным первой задержки шип 2-5 мс (рисунок 5). Большинство PV + клеток, в частности, может выдержать стрельбу на полный 1 сек (рисунок 6). Потому что эти тормозящие нейроны, disynaptic (косвенные) активация не является основной проблемой.
  5. Во время записи, контролировать текущую деятельность на первом осциллографа. Следите от размера и формы шипов с помощью второй осциллограф. Обратите внимание на качество их звука на динамик.
    1. Слушайте внимательно к резким изменениям, которые указывают, что клетка либо рисунок слишком близко к электроду (где он рискует пронзил или поврежденного), или отходит. Если шипы становятся большими и искажены, отступать; если они растут меньше, продвигать электрод. Двигайтесь медленно в 2 мкм шагов.
    2. Подтвердите качество записи ретроспективном путем наложения все шипованные сигналов, выравнивание по пик или впадина. Вары Thres напряжениядержать. В широком диапазоне пороговых значений, не должно быть только когда один шип соответствует форма одинаковой высоты (рис 5а).
  6. Если в любой момент сигнал становится загрязненной с шипами из соседнего нейрона, двигаться дальше. Авансовые медленно, на всякий случай, что электрод пройдет вне зоны соседней камере, но остаются в пределах целевого нейрона. (Это, как правило, неудачными.)
  7. Перемещение электрода через всю глубину коры (900 + мкм) в каждой проникновения. Если нет света проблематику нейроны не встречаются через много проникновений или, наоборот, записи обычно загрязненных с шипами из соседних ChR2- клеток, попробовать новый электрод.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Даже в пределах одной партии, импеданс и наконечник геометрия отдельных электродов могут значительно различаться. Оба фактора способствуют эффективному "прослушивания радиуса» электрода, который должен быть достаточно большим, чтобы обнаружить легкие, вызвали шипы белыйИль поиск, пока ограничивается достаточно для того, чтобы записи одного интернейрон в изоляции.
  8. Испытание на сопротивление электродов, как требуется. Во избежание повреждения ткани, сделать это с кончиком электрода в верхней части слоя агарозы, а вне мозга. В диапазоне 7-14 МОм, точное сопротивление не уверен предсказатель эффективности или доходности, для этого приложения. Тем не менее, это разумный прокси для радиуса прослушивания: меньше импеданса электродов подобрать более единиц; выше импеданс, меньше.
  9. В конце эксперимента, эвтаназии животных по организационно-одобренных средств, таких как анестезирующего передозировки, или цервикальной дислокации под глубокой анестезией плоскости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы здесь поделиться нашей стратегии для получения одной единицы записи с генетически-секретных тормозных интернейронов в наркозом коры мыши, с помощью optogenetic метод, разработанный Лиме и др. Таблица 1 детали предложил анестетик коктейль, кетамин-Медетомидин-ацепромазина (1 ». КМА "). На рисунке 1 показана вольфрама микроэлектрода, приготовленные для записи. Рисунок 2 содержит схему для простого блока управления СИД. Рисунок 3 сод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя ПИЯФ концептуально проста, он может быть сложным на практике. Основным фактором, определяющим успех, является выбор электрода. Электрическая радиус прослушивания является критическим параметром. Он должен быть достаточно большим, чтобы обнаружить светло-вызывала всплески, когда кончик еще некоторое расстояние от клетки ChR2 +, так что можно регулировать скорость заранее, соответственно. В то же время, оно должно быть ограничено настолько, чтобы позволить хорошую изоляцию одного блока. То есть, электрод не должен та...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Фондом Уайтхолла и NIH. Мы благодарим Клиффорда Дакса (Clifford Dax) (Управление технической поддержки Университета штата Орегон) за его помощь и опыт в проектировании схемы для доставки света.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ChR2-EYFP ЛинияJackson Colonies12569
Pvalb-iCre (PV) ЛинияJackson Colonies8069
Sst-iCre (SOM) ЛинияJackson Colonies13044
Cr-iCre (CR) ЛинияJackson Colonies10774
AgaroseSigma-AldrichA9793Type III-A, High EEO
Micro Point (dural крючок)FST10066-15
Хирургические ножницыFST14084-09
СкальпельFST10003-12 (ручка), 10011-00 (лезвия)
Офтальмологическая мазь PuralubeFoster & Smith9N-76855
Гомеотермическое одеялоHarvard Apparatus507220F
Вольфрамовые микроэлектродыA-M Systems57720012 MΩ Сопротивление переменному току, 127 мкм; диаметр м, 12&�; конический наконечник,
трубка из капиллярного стеклаWarner InstrumentsG150TF-3
Термоусадочная трубкаDigiKeyA332B-4-ND
Zapit AcceleratorDVASKU ZA/ZAAИспользуйте со стандартным суперклеем.
Микроэлектродный усилитель переменного тока 1800AM Systems700000
MP-285 Моторизованный микроманипуляторSutterMP-285
4-канальные цифровые осциллографыTektronixTDS2000C
Активные акустические системыHarmanМодель JBL  Дуэтный
ручной манипуляторScientificaLBM-7
800 & m Оптоволоконный патч-кабельThorLabsFC/PC BFL37-800
Измеритель мощностиThorLabsPM100D (измеритель мощности), S121C (стандартный датчик мощности)
475 нм Cree XLamp XP-EDigiKeyXPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-NDLED мощность и эффективность постоянно растут, поэтому мы рекомендуем проверять последние продукты (www.cree.com).
Arduino UNODigiKey1050-1024-ND
с эпоксидным покрытием

Ссылки

  1. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
  2. Moore, A. K., Wehr, M. Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency. J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).
  3. Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals. Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).
  4. Markram, H., et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).
  5. Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli. Neuron. 73, 159-170 (2012).
  6. Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo. Nature. 488, 343-348 (2012).
  7. Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480, 331-335 (2011).
  8. Pi, H. J., et al. Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature. 503, 521-524 (2013).
  9. Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. A neural circuit for spatial summation in visual cortex. Nature. 490, 226-231 (2012).
  10. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  11. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159(2005).
  12. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  13. Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
  14. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи