Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение РНК от мыши поджелудочной железы: Рибонуклеаза богатых тканей

27.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51779

⸱

2 августа 2014 г.

 ,  , 
1Pharmaceutics & Pharmaceutical Chemistry, The Ohio State University

В этой статье

Краткое содержание

Мы сообщаем о процедуре выделения РНК с высокой целостностью из богатой рибонуклеазой поджелудочной железы мыши.

Аннотация

Выделение высококачественной РНК из богатых рибонуклеазой тканей, таких как поджелудочная железа мыши, представляет собой сложную задачу. Поскольку основной функцией поджелудочной железы является помощь в пищеварении, поджелудочная железа мыши может содержать до 75 мг рибонуклеазы. Мы сообщаем об изменениях стандартных протоколов лизиса фенола/гуанидина тиоцианата для выделения РНК из поджелудочной железы мыши. Гуанидинтиоцианат является сильным белковым денатурантом и эффективно нарушает активность рибонуклеазы при большинстве условий. Тем не менее, для успешной изоляции РНК из тканей, богатых рибонуклеазой, необходимы критические изменения в стандартных протоколах. Ключевые этапы включают в себя высокое соотношение реагентов к тканям лизиса, удаление непереваренной ткани до разделения фаз и включение ингибитора рибонуклеазы в раствор РНК. Используя эти и другие модификации, мы обычно выделяем РНК с числом целостности РНК (RIN) больше 7. Выделенная РНК имеет качество, подходящее для рутинного анализа экспрессии генов. Адаптация этого протокола для выделения РНК из богатых рибонуклеазой тканей, помимо поджелудочной железы, должна быть легко достижима.

Введение

Выделение РНК с высокой целостности требуется для обычных экспериментов молекулярной биологии, таких как северной блоттинга 9 Qrt-ПЦР 1 или экспрессии генов профилирования 5. Большинство современных методов выделения РНК основаны на модификаций тиоцианата гуанидина протоколов 2, 3. Гуанидин тиоцианат является сильным белок денатурирующего и эффективно разрушают активность рибонуклеазы при большинстве условий. Популярный метод Chomczynski и Сакки 3 в сочетании фенола в гуанидинтиоцианата лизирующим раствором, сокращая время изоляции около 4 часов. Многие коммерчески доступные реагенты экстракции РНК основаны на Chomczynski и Sacchi метода 3.

Рибонуклеазы богатые ткани, такие как человека или мыши поджелудочной железы представляет собой дополнительную проблему для выделения РНК. Мышь поджелудочной железы может содержать до 75 мг рибонуклеазы 6 некоторые из которых выйдет Даринаг разрушение ткани поджелудочной железы, что приводит к ткани автолиза. Модификации протоколов гуанидинтиоцианата успешно используются для изоляции РНК из поджелудочной железы с высокой целостности 2, 4, 7, 10. Настой РНК стабилизации реагента в мышь поджелудочной железы способствовало изоляции РНК с высокой целостности 4, 7, 10, однако настой решения в поджелудочную железу требует большого мастерства, может потребоваться специализированные инструменты, такие как вскрытии микроскопом и нарушая архитектуру ткани во время процедуры может привести к лизису клеток. Перфузии ткани со стабилизацией РНК реагента может помешать с другими приложениями, включая изоляции белка и гистологического окрашивания. Кроме того, этот метод не подходит для выделения РНК из поджелудочной железы человека. Другие протоколы требуют подготовки конкретных решений следователем 2.

Мы сообщаем протокол для изоляции РНК с высокой целостности от мыши поджелудочной железы. Чтэ протокол использует элементы ранее опубликованных методов и в значительной степени основаны на стандартных фенол / гуанидинтиоцианата основе лизиса протоколов реагентов. Она не требует подготовки специализированных решений и не требует вливания реагентов в поджелудочную железу. Критические шаги для успешного выделения РНК включают высокую фенол / гуанидина на основе лизиса реагента соотношение тканей, удаления непереваренной ткани предварительного разделения фаз и включение ингибитора рибонуклеазы к полученному раствора РНК. Используя эти и другие модификации, мы обычно изолировать РНК с RIN больше, чем 7, который будет использоваться для рутинного анализа экспрессии генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

Следующие примеры из практики придерживаться политики, описанных уходу и использованию животных комитета Учреждения (IACUC) на.

  1. Рекомендуется изолировать не более 6 поджелудочная железа мыши в любой день. Есть все хирургические инструменты чистые и автоклавного, один комплект на одно животное.
  2. Этикетка все микроцентрифужных пробирок. Четыре 2 мл трубки на животное.
  3. Поместите 8 мл лизирующего реагента в 50 мл центрифужные пробирки на льду. Примечание: В то время как набор для очистки поставляется с гуанидин тиоцианат фенола реагентом, который подходит для изоляции поджелудочной железы, лизис Реагент используют из-за больших объемов, которые необходимы в изоляции.
  4. Внесите около 10 мл следующих растворов в 15 мл центрифужные пробирки для очистки лезвия гомогенизатор в. Этанол, 70% (2 трубки), ВЭЖХ воды (1 туба) и ВЭЖХ вода, содержащая около 200 мкл РНКазы далеко или эквивалентную инактиватор рибонуклеазы.

    5. 2. Хирургия, поджелудочная железа Вскрытие и усреднении

    1. Поместите 1-2 мл изофлураном в банку, содержащей хлопок марлевые или бумажные полотенца. Мышей помещали на платформе, которая не позволяет им достичь источник изофлураном. Добавить свежий изофлурана в банку до обезболивающее каждой мыши.
    2. Аккуратно поместите мышь в банку, содержащую изофлурана. Закройте банку и мониторинг последствий наркоза, осторожно вращая банку и обратно. Животное находится под наркозом, когда он будет в состоянии стоять в его 'самостоятельно.
    3. Для подтверждения анестезии, удалить животное из банки и применять твердую ног щепотку. Если мышь не реагирует на носочной крайнем случае, перейдите к шагу 2.5.
    4. Если мышь реагирует на носок крайнем случае, повторите шаги 2,2 до 2,3.
    5. Поместите наркозом животного на скамейке верхней в положении лежа. Вывихнуть шейки матки мышки по плотно размещения левую руку на шейку матки мыши. НамING правая рука понять хвост мыши и быстро потянуть вверх примерно под углом 45 ° вывихнуть шейку матки.
    6. Закрепите каркас к поверхности (уровень кусок пенопласта покрыты бумажными полотенцами), прокалывая каждый из четырех лапах животного в плоской поверхности с помощью 25 калибра иглы для подкожных инъекций.
    7. Использование стерильных хирургических инструментов, сократить животик мыши открытым и быстро удалить поджелудочную железу от мыши. Используйте пинцет, чтобы удерживать поджелудочную железу и сократить его из селезенки и тонкой кишки с помощью пружинных ножниц. Будьте осторожны, чтобы не растянуть поджелудочную железу при снятии с помощью мыши. Срыв ткани могли выпустить рибонуклеазу. Примечание: Время, необходимое для удаления поджелудочной железы от мыши имеет решающее значение. Специалист должен уметь анализировать поджелудочную железу в 1 мин или менее.
    8. Поместите целые поджелудочной железы в 50 мл пробирку, содержащую 8 мл охлажденного льдом лизиса реагента. Закройте пробирку крышкой и кратко встряхнуть, чтобы погружать тиы п в реагент и перейти к следующей стадии без задержки. Отношение лизиса реагента в ткани имеет решающее значение. См. раздел Результаты для сравнения целостности РНК, выделенной с помощью различных объемов реактива для лизиса.
    9. Гомогенизации в течение 5 сек. Важно, чтобы нажать лопасти гомогенизатора в нижней части центрифужную пробирку, чтобы позволить ткани втягиваться в лопастей для эффективного гомогенизации.

    3. Удаление непереваренной ткани

    Примечание: После гомогенизации, небольшие кусочки ткани будет оставаться в реактива для лизиса. Это более важно, чтобы быстро лизировать ткани, оставляя некоторые ткани непереваренной, а не по гомогенизации и деградации риска РНК.

    1. Передача 2 мл реактива для лизиса, содержащие лизированных поджелудочной железы в 2 мл трубки микроцентрифужных. Соберите два микроцентрифужных трубки гомогената на изоляции. Откажитесь от оставшегося гомогената или хранить при температуре -80 ° С для будущих исследований.
    2. Центrifuge при 4 ° С, 12 000 × г в течение 5 мин для осаждения непереваренной ткани. Это очень важный шаг, так как переносу непереваренной ткани в последующих решений РНК, скорее всего, загрязнять образец рибонуклеазой (шаг 5,13).
    3. Передача 1 мл супернатанта в 2 мл микроцентрифужных трубки. Перейдите с изоляцией сразу и хранить репликации трубку при -80 ° С для дальнейшего использования. Поместите все пробирки, содержащие гомогената на льду в то время как перейти к следующему шагу.
    4. Утилизацию оставшегося реактива для лизиса в соответствующую емкость химических отходов.

    4. Очистка Гомогенизатор Лезвия

    1. Прежде чем перейти к следующему изоляции, очистить лопасти гомогенизатора, помещая их в 10 мл 70% этанола. Активируйте гомогенизатора для о в течение 20 сек, чтобы удалить любые куски ткани, которые могут быть захвачены ножами.
    2. Используйте наконечника 200 мкл пипетки, чтобы удалить любые части, которые остаются в лезвий гомогенизатора.
    3. Повторите шаг 4.1 в воде, генеральный РНКазы инактиватора и 70% этанола. Высушите гомогенизатор вал с чистой Ким протрите.
    4. Повторите шаг 2.1 для выделения поджелудочной железы оставшихся животных, сохраняя РНК, выделенной из каждого животного отдельно, а не объединения РНК.

    5. Выделение РНК

    В следующем разделе идентичен протоколу набора для очистки. Преимущество набора для очистки является то, что он будет изолировать общей РНК в том числе малых РНК.

    1. При использовании замороженного раствора гомогената оттаивать на льду и выдержать при комнатной температуре в течение 5 мин.
    2. Добавить 200 мкл хлороформа, колпачок трубки и энергично встряхивают вручную в течение 15 сек. Оставьте пробирку при комнатной температуре в течение 2-3 мин.
    3. Центрифуга в течение 15 мин при 12000 х г, 4 ° С.
    4. Передача верхний водный слой в микроцентрифужных трубки. Добавить 1,5 объемы изопропанола и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
    5. Трансфер до 700 мкл образца в колонке спина, который помещен в 2 мл пробирку. Закройте крышку и центрифуги при 8000 мкг в течение 15 сек при комнатной температуре.
    6. Откажитесь от проточные.
    7. Повторите этапы 5,5-5,6, используя оставшуюся часть образца.
    8. Добавить 700 мкл буфера RWT к колонке спина. Центрифуга в течение 15 сек при 8000 х г. Откажитесь от проточные.
    9. Внесите 500 мкл буфера НПП в колонну спина. Центрифуга в течение 15 сек при 8000 мкг в мыть столбец. Откажитесь от проточные.
    10. Добавить 500 мкл буфера RPE в колонну спина. Центрифуга течение 2 мин при 8000 х г в сухой колонки.
    11. Передача столбец отжима в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Внесите 80 мкл рибонуклеазы без воды непосредственно на спин колонки мембраны. Центрифуга течение 1 мин при 8000 х г дл элюировани РНК.
    12. Добавить ингибитора РНКазы 1 мкл РНК в растворе. Хранить при температуре -80 ° С или перейти к 5,13.
    13. Для проверки целостности РНК, сначала вычислить РНК Concentration и 260/280 соотношение помощью спектрофотометра.
    14. Развести часть раствора РНК приблизительно 500 нг / мкл с помощью биологически очищенной воды.
    15. Определите РНК целостности (то есть, Рин) с помощью капиллярного электрофореза анализа. Примерно 5 мкл раствора РНК является достаточным для анализа.
    16. Алиготе РНК решение (см. рисунок 2) и хранить при температуре -80 ° С.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общий выход РНК из 1 мл лизирующего гомогената составляет 20-40 мкг. OD 260/280 отношения, как правило, вокруг 2.0 и РИН последовательно превышает 7,0. Если Рин ≤ 6, изоляция нужно будет повторить. Иногда RIN, что выше, чем 8,0 достигается.

Два наиболее часто используемые методы эвтаназии мышей перед удалением поджелудочной железы являются CO 2 удушья или вдыхание изофлураном. Оба метода с последующим смещением шейных позвонков. Поскольку не исключено, что химическое вещество и / ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изоляция РНК из тканей, которые рибонуклеазы богатых представляет собой серьезную проблему для экспериментов молекулярной биологии. Различные Реагенты и наборы, которые коммерчески доступны, которые в основном основано на методе фенол гуанидин тиоцианат экстракции РНК. Гуанидин тиоцианат денатурации белка и, следовательно, снижает активность рибонуклеазы. Тем не менее, сами масштабы рибонуклеазы в поджелудочной железе требует дополнительных изменений в стандартных протоколов выделения РНК. Протокол сообщается здесь, кот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Цзяньхуа Линг, Раймонд Макдоналд, Galvin Свифт, Мишель Гриффин, Пол Grippo и Сатьянараяна Rachagani за их полезные комментарии, предложения и обмена протоколов к ним. Эта работа была поддержана грантом U01CA111294 и премию развития идея с Программой Государственного Университета Огайо Интрамурального Research.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Генератор мощности 500 Научный центр Фишера14-261-03 гомогенизатор
5424REppendorfОхлажденный микроцентифуг
Тризол реактивИнвитроген15596018Лизис
реактив Студент Ваннас пружинные ножницыFisher91500-09 Использование для разрезания поджелудочной железы из прикрепленных тканей
Хирургические ножницы, 6 дюймовFisher08-951-20Использовать для разрезания мыши
Тупые концевые щипцыFisher1381239Использовать для удержания поджелудочной железы во время препарирования
Isoflurane USPAbbott Labs4/8/5210Анестетик
Rnase out (40 U/µ l)Invitrogen10777-019Ингибитор рназы
Rnase AwayAmbion10328-011Общий инактиватор рназы
класса ВЭЖХ водаFisherW5-4Для мытья лезвий гомогенизатора
Молекулярная биология класса водыHycloneSH30538.03Элюирование РНК
miRNeasy Mini наборQiagen217004Purification Kit
Микроцентрифужные пробирки 2 мл, сертифицированные Rnase Dnase freeСША Scientific Plastics1620-2700
15 мл центрифужные пробиркиFalcon352099
70% этанолFisher
100% этанолFisher
200 µ l наконечники для пипетокRaininGPL200FДля очистки лопастей гомогенизатора
ChloroformFisherBP1145-1
NanodropThermoND-1000Спектрофотометр Биоанализатор
AgilentАнализатор капиллярного электрофореза для измерения целостности РНК
RNAlaterAmbionRNA Stabilization Reagent 
RNeasy  Вращающиеся колонны Колонны QiagenSpin  в составе набора miRNeasy Mini
Chales RiverStrain C57BL/6Их возраст варьировался от 4 до 12 месяцев.  
Мыши Джексон Лабрадорштамм 129Их возраст варьировался от 4 до 12 месяцев.  
, мышки

Ссылки

  1. Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
  2. Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
  3. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  4. Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
  5. Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
  6. Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
  7. Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
  8. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA A Laboratory Manual. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).
  9. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
  10. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

тиоцианат гуанидинареагент для лизисаиндекс целостности РНКпротокол с использованием фенола и гуанидинаингибитор рибонуклеазыгомогенизация тканейпротокол центрифугирования
Выделение РНК от мыши поджелудочной железы: Рибонуклеаза богатых тканей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.