Высокое разрешение Пространственно-временная Анализ рецептора Dynamics по одиночных молекул флуоресцентной микроскопии

Краткое содержание

Этот протокол описывает, как использовать флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения для визуализации и отслеживания отдельных рецепторов на поверхности живых клеток и тем самым анализировать латеральную подвижность рецептора, размер рецепторных комплексов, а также визуализировать переходные взаимодействия рецептор-рецептор. Этот протокол может быть распространен на другие мембранные белки.

Аннотация

Микроскопия одиночных молекул становится мощным подхода для анализа поведения сигнальных молекул, в частности в отношении тех аспектов (например,., Кинетика, сосуществование различных государств и групп населения, переходных взаимодействий), которые, как правило, скрыты в измерениях ансамбль, например, результатами, полученными с помощью стандартных биохимических или микроскопии методов. Таким образом, динамические события, такие как взаимодействия рецептор-рецепторов, можно проследить в режиме реального времени в живой клетке с высокой пространственно-временной резолюции. Этот протокол описывает метод, основанный на маркировке с небольшими светлыми и органических флуорофоров и полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия непосредственно визуализировать одиночные рецепторы на поверхности живых клеток. Такой подход позволяет точно локализовать рецепторы, измерить размер рецепторных комплексов, а также захватить динамические события, такие как переходных взаимодействий рецептор-рецепторов. Протокол содержит подробное описание того, как реrform эксперимент в одиночных молекул, в том числе подготовки проб, получения изображений и анализа изображений. В качестве примера, применение этого метода для анализа двух G-белком рецепторы, то есть., Β _{2-адренорецепторов} и γ-аминомасляной кислоты типа B (ГАМК _B) рецептор, не сообщается. Протокол может быть адаптирована к других мембранных белков и различных моделей клеток, методы трансфекции и стратегии маркировки.

Введение

Рецепторы, расположенные на поверхности клеток ощутить внеклеточную среду и отвечать на различные стимулы, такие как отдушки, ионов малых нейротрансмиттеров и крупных белковых гормонов. Жидкость характер клеточных мембран позволяет движения рецепторов и других мембранных белков. Это необходимо для формирования белковых комплексов и возникновением переходных белок-белковых взаимодействий, таких как те, что используются рецепторов собрать в функциональных блоков и преобразовывать сигналы в внутрь клетки. Например, G-белком рецепторы (GPCR), которые составляют самый большой семейство рецепторов клеточной поверхности ^1, были предложены для формирования di-/oligomers, которые, как представляется, участвуют в регуляции тонкой настройки передачи сигнала и могут иметь важные физиологические и фармакологические последствия, ^2-5.

Микроскопия одиночных молекул имеет большой потенциал непосредственно визуализации с высоким spatiotempоральный разрешение динамическое поведение отдельных рецепторов, расположенных на поверхности живых клеток, в том числе их ассоциации с образованием димеров и высших порядков молекулярные комплексы ^6-10. Это дает несколько преимуществ по сравнению со стандартными биохимическими и микроскопии методов, которые обычно сообщают среднее поведение тысяч или миллионы молекул.

Белок маркировка с достаточно яркой и фотостабильным флуорофором имеет важное значение для микроскопии одиночных молекул. Этот протокол использует недавно введенной SNAP тега ¹¹ ковалентно присоединить небольшие и яркие органические флуорофоры чтобы рецепторами клеточной поверхности. SNAP является кДа белок тег 20 происходит от человека фермент репарации ДНК алкилтрансферазы O ^{6-алкилгуанин-ДНК,} который может быть необратимо меченного флуорофора, конъюгированным бензилгуанином (флуорофор-BG) производные. CLIP, еще инженерии тег происходит от SNAP, можно вместо помечены флуорофора-сonjugated производные benzylcytosine ^12.

Протокол сообщалось в этой рукописи объясняет, как трансфекции и этикетка ^SNAP-11 помечены рецепторы с малыми органическими флуорофоров и использовать полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия для визуализации одиночных рецепторы или рецепторных комплексов на поверхности живых клеток ^10. Представленные результаты протокола на> 90% эффективности маркировки на внеклеточно SNAP-меченых клеток поверхностного белка ^10. Более подробную информацию о том, как использовать данные одной молекулы анализировать размер и подвижность рецепторных комплексов, а также на захват переходных взаимодействий рецептор-рецептор, предоставляется. Схематическое рабочий процесс всей протокола дается на рисунке 1. Например, трансфекция яичника китайского хомячка (СНО) с SNAP-меченых G-белком рецепторы (GPCR) следуют маркировка с производным флуорофором BG как а также его применение в quantifу и di-/oligomerization рецепторов монитор описаны. Этот протокол может быть распространен и на другие поверхности клеток белков и флуоресцентных меток (например., Клип), а также на другие трансфекции и маркировки методов.

Протокол

1. Подготовка образца

1. Покровные очистки
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работа под вытяжкой.
   1. Используйте чистые пинцет, чтобы разместить покровные стекла (диаметром 24 мм) в держатель покровное, которая отделяет отдельные покровные.
   2. Установите держатель с покровные в стакан и добавить хлороформ до покровные не покрыты. Стакан накрывают алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить испарение и обрабатывают ультразвуком в ванне для обработки ультразвуком в течение 1 часа при комнатной температуре. Возьмите держатель покровное из стакана и пусть покровные сухой.
   3. Повторите шаг 1.1.2 с 5M NaOH решения вместо хлороформа.
   4. Возьмем держатель покровное в новый стакан и мыть три раза дистиллированной водой. Поместите очищенные покровные стекла в клеточной культуральной пластины, наполненной 100% этанола.
2. Подготовка образцов калибровочных
   1. Растворите флуоресцентный краситель в соответствующем растворителе.
   2. Приготовьте 1:10 серийное разведение флуоресцентного красителя в диапазонес 1 пМ до 1 нМ фильтр стерилизуют воду (0,22 мкм).
   3. Возьмем очищенные покровные, сохраненные в 100% этаноле и промывают стерилизованным фильтрацией воды. Пятно 20 мкл каждого разбавления флуоресцентным красителем на отдельном очищенной покровное. Пусть покровные высохнуть в стерильной крышкой. Защитите покровные от света и пыли до использования. Используйте эти образцы для оценки интенсивности отдельных флуоресцентных молекул (см. шаг 3).
3. Трансфекция
   1. Культура клеток СНО в 1:01 модификации Дульбекко / питательной смеси Дульбекко F-12 (DMEM/F12) дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° С, в . 5% СО ₂ ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте фенол-красный свободные средства массовой информации в течение всего эксперимента, чтобы минимизировать аутофлюоресценция.
   2. Возьмем очищенные покровные из 100%-ным раствором этанола, промойте стерильной фосфатно-солевом буфере (PBS), и разместить один покровное в каждую лунку 6 мкл клеточной культуре хорошоели.
   3. Trypsinize, считать и семян клетки СНО при плотности 3 х 10 ⁵ клеток / лунку в клеточной культуры пластины 6-а, содержащего покровные. Пусть клетки растут в инкубаторе (37 ° C, 5% CO ₂₎ в течение 24 часов, чтобы достичь прибл. 80% слияния, который является оптимальным плотность клеток для трансфекции.
   4. Для каждой лунки, разбавленных 2 мкг целевого плазмидной ДНК (например., SNAP-меченый β _{2-адренергических} рецепторов) и 6 мкл липофектамина 2000 в двух отдельных пробирки, содержащие 500 мкл среды OptiMEM. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
   5. Объедините решения, начиная с шага 1.3.4 в одну пробирку и смешать, чтобы получить трансфекции смесь. Инкубируйте трансфекции смесь при комнатной температуре в течение 20 мин.
   6. Во время инкубации (1.3.5), взять клетки СНО и мыть дважды подогретого (37 ° С) PBS. Заменить PBS с 1 мл / лунку фенолового красного среде DMEM/F12, дополненной 10% FBS, но без антибиотиков.
   7. Добавить весь трансфекцииионный смесь (1 мл) с этапа 1.3.5 каплям в каждую лунку и осторожно раскачивать пластину назад и вперед для обеспечения полного перемешивания.
   8. Выдержите в течение 2 до 4 часов при температуре 37 ° С, в 5% CO ₂ и приступить сразу же после этого к следующему шагу. ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия трансфекции были оптимизированы для достижения плотности рецепторов <0,45 частиц / мкм ^2, которые подходят для одно- томография молекула. Корректировки могут потребоваться при использовании различных клеток, конструкции или реагентов.
4. Белок маркировки
   1. Развести 1 мкл флуорофор-BG маточного раствора в 1 мл среды DMEM/F12, дополненной 10% FBS, чтобы получить конечную концентрацию 1 мкМ. Возьмем трансфицированных клеток из инкубатора и дважды промывали нагретого (37 ° C) PBS. Заменить PBS с 1 мл 1 мкМ раствора флуорофором BG и инкубировать в течение 20 мин при 37 ° C 5% CO ₂ в инкубаторе.
   2. После инкубации промыть клетки трираза с среде DMEM/F12, дополненной 10% FBS, каждый раз с последующей 5-минутной инкубации при 37 ° С Возьмите покровное (с меченых клеток) с помощью пинцета и поместить его в камеру изображения.
   3. Мыть два раза с 300 буфера изображений мкл. Добавить 300 мкл свежего буфера изображений и немедленно приступить к визуализации (Часть 2).

2. Приобретение изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскоп, оснащенный масло-погружения высокой числовой апертурой объектива (например, 100x magnification/1.46 числовой апертурой.), Подходящих лазеров (например, 405 нм, 488 нм, 561 нм и 645 нм диодные лазеры), электрон умножения прибор с зарядовой связью (EMCCD) камера, инкубатор и контроль температуры визуализировать одиночные флуоресцентных молекул.

1. Установите желаемые параметры микроскопа, т.е.., Лазерная линия, угол TIRF (этот параметр управляет проникновенияглубины проникновения от затухающих области), время экспозиции, частота кадров и количество кадров в фильме ^10. Держите контроль нагреватель / инкубатор и температуры всегда, чтобы избежать температурных заносы и конденсации влаги.
2. Поместите каплю иммерсионного масла на 100X объектив микроскопа. Поместите изображения камеры с меченых клеток на держатель образца микроскопа, и принести клетки в фокусе использованием светлое освещение.
3. Перейти к TIRF освещения. Хранить мощность лазера как можно ниже, чтобы поиск требуемой клетке, но в то же время сводя к минимуму фотообесцвечивания.
4. Выберите нужную ячейку и тонкой регулировки фокуса. Установите мощность лазера до уровня, который позволяет визуализировать отдельных флуорофоров. Приобретать последовательность изображений и сохранить файл необработанного последовательность изображений, как. Размолвки.

3. Калибровка (Одноместный Флуорофоры на стекла и мономерных / димерных рецепторов управления)

1. Соберите каждый калибровки SAMPLе полученного, как описано в п. 1.2 в камере изображений. Поместите каждый образец на микроскопа и выбрать образец, содержащий хорошо разделенных дифракционной пятна, которые отбеливатель в одну стадию. Примечание: Эти пятна представляют отдельные молекулы флуоресцентного красителя.
2. Приобретать последовательности изображений TIRF, как описано в шаге 2. Важно: те же параметры визуализации должны использоваться для всех экспериментов, в том числе тех, для калибровки.
3. Выполните обнаружение и сопровождение анализ как подробно изложено в 4,1 - 4,2. Выписка интенсивность каждой частицы, как описано в 4.2.6. Исходя из этих данных, вычислить среднее (μ) и стандартное отклонение (σ) интенсивности отдельных флуорофоров.
4. Дополнительно: выполнить тот же анализ на клетках, трансфицированных мономерного рецептора на поверхности клетки (. Например, CD86), N-терминально отмеченных либо одного или двух копий SNAP ¹⁰ и помечены с производной флуорофором BG. ФоллоW методике, описанной выше для одного флуорофора на стекле. Оценить эффективность маркировки, как описано в Calebiro, D. и соавт. ¹⁰

4. Анализ изображений

1. Подготовка последовательность изображения
   1. Используйте программное обеспечение для обработки изображений (например,., ImageJ), чтобы обрезать изображения.
   2. Сохраняет отдельные кадры как отдельный. TIFF изображения в новой папке, указывая на каждом изображении номер кадра.
   3. Измерьте площадь поверхности клетки, рисуя область интереса (ROI) по контуру клетки и с помощью инструмента измерения в ImageJ или аналогичного инструмента в другое программное обеспечение. Это значение можно использовать для расчета плотности частиц путем деления общего количества частиц в начале фильма на площадь поверхности клетки.
2. Обнаружение частиц и отслеживания
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте некоммерческой программы, такие как U-трек ^13, работая в Matlabсреда, для автоматического обнаружения и отслеживания частиц одиночных рецепторов.
   Примечание: алгоритм U-трек основан на подходе отслеживания нескольких гипотез. Этот подход связывает частицы между кадрами путем создания стоимости матриц, где отдельные вероятности того, что данная частица в одном кадре соответствует данной частицы в следующем кадре, оказывается, исчезает или слияний / разбивает с / от других частиц назначены. Решение, которое во всем мире минимизирует затраты, то есть., Тот, с наибольшей вероятностью, будет, наконец, выбрали. Это также позволяет отслеживания временно исчезают частицы, типичный феномен, вызванный флуорофора миганием. В последней версии U-трек (2.1.0) имеет графические пользовательские интерфейсы, которые облегчают выполнение этих анализов.
   1. В командной строке Matlab, типа "movieSelectorGUI", чтобы открыть интерфейс выбора фильма. Следуйте инструкциям, чтобы создатьНовая база данных фильмов, начиная с ранее сохраненным отдельных изображений (см. 4.1.2).
   2. Обеспечить размер пикселя в нм, интервал времени в секундах, числовую апертуру, глубину камеры битов и длины волны излучения флуорофора, необходимое для регистрации частиц и отслеживания. Сохраните базу данных фильмов.
   3. Из интерфейса выбора кино, запустить анализ, выбирая "одиночные частицы" как тип объектов. Появится новое окно, где параметры, используемые для обнаружения частиц и отслеживания может быть определена. Начните с параметрами по умолчанию. Позже, настроить эти параметры, если качество обнаружения и / или отслеживания не является удовлетворительным (например, некоторые частицы не обнаружены или дорожек фрагментированы) Дополнительно:. В настройках слежения, проверить "отслеживания результатов Экспорт в формат матрицы", чтобы сохранить координаты и амплитуды всех частиц в одной матрице (поле под названием "trackedFeaturedInfo»). Для получения подробного описания этих параметров, обратитесь к документации у-трека.
   4. Запустите алгоритм обнаружения. Этот алгоритм автоматически определить местоположение и интенсивность выше фона каждой дифракционной месте (то есть., Одиночные рецепторы / рецепторных комплексов) путем установки двумерный гауссовой функции со стандартным отклонением, равным функции рассеяния точки микроскопа около локальных максимумов интенсивности . Затем запустите алгоритм отслеживания. Храните результаты анализов в. Файл мат.
   5. Используйте "movieViewer" рутины, содержащийся в пакете у-трека или аналогичные новые пользовательские режимы визуализировать треки и проверить качество обнаружения и сопровождения.
   6. Откройте файл. Мат, чтобы увидеть положение и амплитуду (т.е.., Интенсивность) отслеживаемых частиц в каждом кадре. Данные, полученные в шаге 4.2.4 содержатся в области tracksCoordAmpCG АР tracksFinalлуч и / или в trackedFeaturedInfo. Из общего числа частиц обнаружено рассчитать плотность частиц Разделив эту величину на площадь поверхности клеток, измеренной при 4.1.3.
   7. Дополнительно: Используйте координаты частиц с течением времени (см. 4.2.6), чтобы проанализировать движение частиц рецепторов. Рассчитать средние квадратных смещения (MSD) и коэффициентов диффузии (D), используя Matlab или подобное программное обеспечение. Для каждой частицы и каждого интервала времени (Δ т) считается, вычислить средний квадрат смещения (MSD) по следующей формуле:
      
      где Δ т это интервал времени в кадрах, N-число шагов проанализированных х и у х частицы и у координаты в кадре, показанном индекса. Используйте MSD течением времени участков оценить тип движения данной частицы: линейные соотношенияобозначения свободного распространения (т.е.., броуновское движение), на положительную кривизну (IE., кривая выглядит как параболы) предполагает направленное движение, отрицательной кривизны свидетельствует о замкнутом движения ^14. В случае свободно диффундирующих частиц, вычисления коэффициента диффузии (D) каждой частицы путем подгонки полученные данные MSD с помощью следующего уравнения:
      
3. Расчет размера частиц с гауссовой фитинга методом
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как распределение интенсивности калибровочных образцов (Single флуорофоры на стекле и / или флуоресцентной меченых мономерных рецепторов), как известно, выполняют смешанную Gaussian посадку на распределение интенсивности частиц в начале последовательности изображений, чтобы определить размер рецепторных комплексов (т.е.., число рецепторов на одну частицу) ^10. Выполните эти анализы с использованием Matlab или секimilar программного обеспечения.
   1. Рассчитать интенсивность каждой частицы путем усреднения интенсивности частицы от первого кадра к кадру до первого изменения интенсивности произошло (в большинстве случаев снижение из-за фотообесцвечивания).
   2. Выполнение смешанную гауссову присоединение по следующей формуле:
      
      где φ (I) является частота частицы, имеющие интенсивность I, N есть число компонент, α _н это параметр, который вносит свой ​​вклад в высоту компонента п, μ и σ представляют собой среднее и стандартное отклонение интенсивности опорных отдельных флуорофоров . (рассчитывается как описано в шаге 3) ПРИМЕЧАНИЕ: Определите тон Максимальное число компонент _(N Максимум) для каждого последовательности изображений, постепенно увеличивая N _Макс до добавления компонента уже больше не производят статистически лучше фитинг, если судить по F-теста.
   3. Дополнительно: (. Например, последние 60 кадров из 400 последовательности кадра) Выполните смешанную Gaussian посадку на распределение интенсивности, полученные на последних кадрах фильма. Заменить μ и σ со значениями, полученными после этого фитинг, которые обеспечивают изысканные оценки этих параметров, и повторите шаг 4.3.2.
   4. Вычислить площадь под кривой (AUC) для каждого компонента смешанного гауссова подгонки. Вычислить относительное содержание частиц рецепторов разного размера (т.е. мономер, димер, тример и т.д.) путем деления значения AUC каждого компонента по AUC всей распределения.
   5. Дополнительно: Использовать данные из разных клеток и соответствующих плотностей частиц (рассчитывается как описано в 4.2.6) для создания участков, где распределение частиц с различными размерами коррелирует с плотностью частиц ^10.
4. Расчет размера частиц с шагом установки методом
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте шаг облегающие анализ в качестве альтернативного метода определения размера рецепторов комплексов ^10. Основой для этого анализа является то, что светоиндуцированная уничтожения (фотообесцвечивания) одного флуорофорных приводит к ее мгновенной исчезновения - таким образом частицы, содержащие п флуорофоры, как ожидается, постепенно отбеливатель производя профиль интенсивности с п шагов.
   1. Выписка профили интенсивности каждой частицы из файла мат., Порожденной U-трека или аналогичного программного обеспечения обнаружения / слежения (см. 4.2.6).
   2. Используйте шаг облегающие алгоритм, например, той, которую представилв работе. 10, для подсчета количества шагов отбеливания для каждой частицы.
   3. Дополнительно: использовать результаты для создания дистрибутивов, показывающие относительное обилие частиц рецепторов разного размера и соотнести их с плотностью частиц, как описано выше за результаты смешанной Гаусса фитинга (см. п. 4.3).

Результаты

Описанный протокол может быть применен к различных мембранных белков. Например, представительные результаты, полученные с β _{2-адренергических} и GABA _{B-рецепторов} приведены ^10. Поскольку люминесцентные сигналы от одиночных молекул слабы, минимизация фоновой флуоресценции является первым важным шагом к успешным результатам. Таким образом, важно использовать широко очищенные покровные (рис. 2а), а также свести к минимуму образец (например аутофлюоресценция., С помо...

Обсуждение

Описанный протокол позволяет анализ пространственного расположения, подвижности и размера рецепторных комплексов на поверхности клеток на уровне отдельных молекул. По сравнению с использованием флуоресцирующих белков, маркировка с малых органических флуорофоров, которые светлее и более фотостабильным, имеет то преимущество, что позволяет расширенную визуализацию частиц отдельных рецепторов. Поскольку крайне низкие уровни экспрессии достигается (<частицы 0,45 рецепторов / мкм ^2), свойства рецепторов и други...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хлороформ	AppliChem GmbH	A1585	ВНИМАНИЕ: токсичное и раздражающее вещество, а также возможный канцероген
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	ВНИМАНИЕ: сильное основание и высококоррозионный реагент
Абсолютный этанол	Sigma-Aldrich	32205
Стеклозащитное стекло	Marienfeld-Superior	111640	диаметр 24 мм, толщина 0,13-0,16 мм
0,2 мм стерильный фильтр	Sarstedt	83.1826.001
CHO клетки	ATCC, США	ATCC CCL-61	китайский хомяк яичник клеточная линия
6-луночный клеточный культуральный планшет	Nunc	140675
DMEM/F-12 среда	GIBCO, Life Technologies	11039-021	фенол-красная свободная среда
Фетальная бычья сыворотка	Biochrom	S 0115
Пенициллин - стрептомицин	Pan Biotech GmbH	P06-07 100
Трипсин-ЭДТА	Pan Biotech GmbH	P10-23100
Липофектамин 2000	Инвитроген, Life Technologies	11668-019
Opti-MEM I Восстановленная сыворотка Среда	инвитроген, Life Technologies	31985-047
Фторофор-конъюгированный бензилгуанин	Новая Англия BioLabs	S9136S	SNAP-поверхность Alexa Fluor 647. Сделайте стоковый раствор размером 1 мМ в DMSO. Хранить при температуре -20°С.
DMSO	AppliChem GmbH	A1584
Буфер для визуализации:			137 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 2 мМ CaCl<суб>2, 1 мМ MgCl<суб>2, 10 мМ HEPES, pH 7,3, стерильно-отфильтрованный
NaCl	AppliChem GmbH	A1371
KCl	AppliChem GmbH	A3582
CaCl2	AppliChem GmbH	A2303
MgCl2	AppliChem GmbH	A3618
HEPES	AppliChem GmbH	A3724
Камера для визуализации	Молекулярные зонды, Life Technologies	A-7816	Камера для клеток Attofluor, для микроскопии
TIRF-M	Leica		Модель: DMI6000B
объектив TIRF	Leica	11 506 249	HCX PL Apo 100x/1.46 Масло CORR
EM-CCD камера	Roper Scientific		Photometrics Cascade 512B
Контроллер температуры	Pecon		Tempcontrol 37-2 цифровое
программное обеспечение ImageJ	NIH, США		http://rsbweb.nih.gov/ij
программное обеспечение u-track	Лаборатория вычислительной клеточной биологии, кафедра клеточной биологии, Гарвардская медицинская школа, США		http://lccb.hms.harvard.edu/software.html
Matlab программное обеспечение	The MathWorks, США