3D Орбитальная слежения в модифицированной двухфотонного микроскопа: Приложение к отслеживая внутриклеточного везикулы

Краткое содержание

В этом видеопротоколе мы отслеживаем - с высокой скоростью и в трех измерениях - флуоресцентно меченные лизосомы в живых клетках, используя метод орбитального слежения в модифицированном двухфотонном микроскопе.

Аннотация

Цель данного видео протокола является обсуждение как выполнить и проанализировать трехмерную флуоресцентный орбитальный эксперимент отслеживания частиц с использованием модифицированного двухфотонного микроскопа ^1. В отличие от традиционных подходов (растр сканирования или широкое поле на основе стека кадров), орбитальный слежения 3D позволяет локализовать и следовать с высоким пространственным (точность 10 нм) и временным разрешением (50 Гц АЧХ) 3D смещение перемещения люминесцентные частицы на длине масштабах от сотен микрон ^2. Метод основан на алгоритме обратной связи, которая управляет аппаратными средствами двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа, чтобы выполнить круговую орбиту вокруг объекта, которые необходимо отслеживать: механизм обратной связи будет поддерживать флуоресцентный объекта в центре, контролируя смещение сканирующий луч ^3-5. Чтобы продемонстрировать преимущества этой техники, мы следовали быстро движущихся органеллы, лизосому, в рамках альiving клеток ^6,7. Клетки высевали в соответствии со стандартными протоколами, и окрашивали с использованием коммерчески лизосом краситель. Мы обсудим кратко аппаратную конфигурацию и более подробно программного управления, чтобы выполнить 3D орбитальный эксперимент отслеживания внутри живых клеток. Мы подробно обсудим параметры, необходимые для того, чтобы контролировать сканирующего микроскопа и позволить движение луча по замкнутой орбите вокруг частицы. Мы пришли к выводу, демонстрируя, как этот метод может быть эффективно использован для отслеживания быстрое движение меченой лизосом вдоль микротрубочек в 3D в живой клетке. Лизосомы может перемещаться со скоростью в диапазоне 0,4-0,5 мкм / сек, как правило, отображение, направленное движение по сети микротрубочек ^8.

Введение

Большое количество подходов были разработаны до настоящего времени отслеживать флуоресцентные частицы в трех измерениях с помощью микроскопа. Большинство подходов основаны на использовании быстрых камер, идеально подходит для отслеживания в двух измерениях, как правило, в сочетании с индивидуальными модификаций выбросов оптики микроскопа, чтобы достичь отслеживания в осевом направлении. Лазерная сканирующих микроскопов (либо конфокальные или двух фотонов) условно можно отслеживать флуоресцентный частицу, выполняя временную последовательность Z-стеки, хотя этот процесс, как правило, отнимает много времени, и дает разумное разрешение по времени (10 Гц), если только частица отслеживается является хранится в центре небольшого региона растровых изображений активным механизмом обратной связи ^2.

Идея блокировки в частице является основой метода орбитальной отслеживания. Вместо растра сканирования выполняется круговая орбита вокруг флуоресцентного частицы. Интенсивность флуоресценции вместеорбита точно локализует положение частиц ^4.

Локализованный положение частицы затем можно использовать для приведения в действие микроскопом сканеры и повторного центр орбиты от положения частиц. Гальванометра сканеры микроскопом движет аналоговое напряжение. Компонент AC этого напряжения позволяет осуществлять орбиту с сфокусированным лазерным лучом, т.е. синус и косинус волны, приложенного к X и Y сканирующие зеркала позволит выполнять круговую орбиту. DC смещение сигнала облегчает изменения положения центра орбиты. После того, как период орбиты определяется и форма сигнала для сигнала переменного тока настроен, система обратной связи необходимо обновить только постоянную составляющую сигнала.

Программное обеспечение в состоянии прочитать флуоресцентный сигнал, собранную с детекторов требуется контролировать сканеры и детекторы, чтобы вычислить положение частицы и обновить DC отустановить. Для успешного обратной томография тщательного выбора параметров орбиты (объемы и сроки) не требуется, и эти параметры должны быть скорректированы на основе характеристик люминесцентных частиц, что необходимо отслеживать.

Физические и математические основы техники были описаны в прошлом ^4,5 для обоих 2D и 3D приложений. В этом протоколе мы кратко опишем основные аппаратные компоненты установки, и более подробно выбор параметров и подготовка образца, необходимый для типичного эксперимента, позволяющего нам после смещения лизосом в высоким временным разрешением в живой клетке.

Протокол

1 Подготовка образцов

1. Поддержание CHOK1 клетки в тканевых культуральных колбах с использованием DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 100 МЕ / мл пенициллина 50 мкг / мл стрептомицина. Инкубируйте клетки в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.
2. Урожай а затем пластины CHOK1 клеток на 14 мм диаметром микро-скважины с толщиной поверхности 0,16 мм. Семенной клетки для оптимальной плотности для работы с изображениями, 60-70% слияния.
3. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С, 5% СО _2. Промыть клетки три раза в HBSS (Hank буферный солевой раствор), и инкубируют клетки в раствор, содержащий 50 нМ Lysotracker DND26 зеленого и 150 нм тубулина следящей зеленый. Инкубируйте клетки в течение 1 часа при 37 ° С. Необязательный шаг: До инкубации, выполнить дополнительное пятно с митохондриальной окрашивания матрица красителя (25 нМ).
4. Промыть клетки три раза в HBSS, чтобы удалить любой несвязанный краситель. Добавить свежую среду роста DMEM до ИМАГчисле клетки.

2. Микроскоп Конфигурации

Микроскоп для отслеживания частиц описанного в протоколе видео собран на раме коммерчески доступного инвертированного микроскопа (Рисунок 4). Однако коммерческие модули для 3D слежения орбитальная частиц теперь доступны.

1. Используйте когерентного Chameleon-Ultra II Ti: Sa фемтосекундного лазерного возбуждения источника света, с перестраиваемой диапазоне выходных длин волн от 690 нм-1040 нм.
2. Убедитесь, что лазерный луч выравнивается в задней порту микроскопом с помощью ИК-покрытием зеркала. Лазерный луч ослабляется с помощью вращающегося полуволновой пластинки с последующим кальцит линейного поляризатора. Ослабление пучка таким образом, чтобы средняя мощность на образце составляет от 0,5 до 2 мВт.
   ПРИМЕЧАНИЕ: лазерный луч отражается парой гальванометра моторных приводных зеркал, которые позволяют контролировать положение и траекторию сфокусированного пучка в плоскости образца. ВТипичная конфигурация коллимированное лазерный луч, выходящий из гальванометрических зеркал расширяется (10X), проходящий через расширитель пучка, перед входом в задней части объектива микроскопа после отражения на короткий проход зеркальные.
3. Собирают света флуоресценции от образца, помещая высокой числовой апертурой воды цели (60X, NA 1.2) на пути прохождения света. Выберите куб флуоресценции фильтра в соответствии с требуемыми длинами волн излучения в любой конфигурации канала один или два. Применять полосовых выбросов фильтры для дальнейшего выбора спектрального диапазона излучаемого флуоресценции.
4. Поместите образец на моторизованной этапе, и выполнить точную движение объектива микроскопа, используя объективную пьезо-контроллер.
5. Направьте свет от куба фильтра в фотоумножителями где сигнал предвзято и отправленных в цифровой I / O сбора данных карты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: компьютерная графика волны являются аналоговый выход платы ввода-вывода / и Providред к сканеров управлять электроникой. Входной счета фотонов от ФЭУ и выходного сигнала к сканеров измеряются и контролируются через карты ввода / вывода в лаборатории для флуоресценции Динамика SimFCS программного обеспечения.

3 изображений

1. Расположите клеток на сцене и сфокусироваться с помощью проходящего света освещение.
2. Переключение в режим визуализации растрового сканирования, чтобы определить клетки, которые включены краску и визуализировать основные микротрубочки. Определить начальную область, где движение пузырьков присутствует.
3. После того, как изолированные везикулы идентифицируется, установите следующие параметры для орбитальной слежения:
   1. Выберите радиус орбиты, чтобы определить размер круговой сканирования в соответствии с размером частицы отслеживается. Для точки излучателя, установите радиус орбиты, равной талии Функция рассеяния точки (PSF) пучка возбуждения максимизации чувствительности и реакции.
   2. Установите осевуюрасстояние, чтобы определить расстояние между двумя орбитах, которые выполняются, чтобы локализовать положение частицы вдоль осевого направления. Установите осевое расстояние к 1,5-3 раза ФСФ талии.
   3. Определить время задержки в зависимости от яркости частицы, чтобы установить время, затрачиваемое на каждой точке орбиты, которая также будет определять фото-отбеливания скорость. Используйте время пребывания между 10-100 мкс.
   4. Установите количество точек в каждой орбите до 64 или 128 с получением периоды орбиты в порядке 4-32 мс и обеспечивает высокое временное разрешение для определения положения частиц.
4. Изменение смещения постоянного тока сигнал, посланный к зеркалам для центровки луча на частицы с помощью графического интерфейса пользователя через выбор курсора в растрового сканирования изображения.
5. Начните отслеживание путем переключения режима микроскопа от растрового-визуализации для орбитальной сканирования.
6. Активируйте обратной связи и сбора данных.

4 Trajectрии Анализ

1. С помощью программного обеспечения для отображения флуоресценции собранных в каждой точке вдоль орбиты и в каждый момент времени в форме «интенсивности ковер". Интенсивность собраны по ковру обеспечивает информацию о взаимодействии частицы с другими ярких объектов. С помощью программного обеспечения для отображения как траекторию информацию (т.е. смещения постоянного тока в течение долгого времени в X, Y сканеры и из г -piezo), а также интенсивности флуоресценции, собранной из ФЭУ в течение долгого времени в виде временных рядов.
2. Используйте представление временных рядов и 'интенсивность ковер' информацию, чтобы выбрать только интересующую область в траектории.
3. С помощью программного обеспечения для отображения 2D проекцию выбранной части траектории частицы. Выберите соответствующие элементы управления для цветового кода траекторию в зависимости от интенсивности флуоресценции частиц.
4. Выберите опцию для отображения рСтатья траектории в 3D, и цвет-код, что в зависимости от интенсивности флуоресценции. Поверните траектории в 3D с помощью органов управления для визуализации особенности движения лизосом вдоль микротрубочек.

Результаты

В соответствии с этим протоколом быстрая 3D отслеживания одна частица может быть выполнена внутри живых клеток с использованием модифицированного двухфотонного микроскопа, чтобы отслеживать перемещение флуоресцентно меченных лизосом. Эксперимент выполняется заключается в отслеживании изолированную лизосому движется внутри клетки после процесса созревания эндосом ^9. Лизосом окрашивали с помощью флуоресцентного зеленую краску и возбуждается на 930 нм эксплуататорских возбуждение 2-фотона. Наши данные показывают...

Обсуждение

Несмотря на огромные прогрессирует от флуоресцентных методов микроскопии и контрольно-измерительных приборов в течение последних лет, достижения траектории люминесцентных частиц в трех измерениях с высоким временным разрешением осталась с проблемой в области. Если высоким временным разрешением были достигнуты частицы отслеживания в двух измерениях, расширение в осевом направлении, как правило, приводит к резкому снижению частотной характеристики системы ^10.

В этом видео-протокола ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Лизотрекер DND 26	Life Technologies	L-7526
Тубулин трекер Green	Life Technologies	T34075
Mitotracker RED	Life Technologies	M7512
Когерентный хамелон-ультра II TI	Когерентный
Глан Тейлор Кальцитовый поляризатор	Melles Griot	03PTA001
Гальванометр-мотор зеркало	Cambridge Technologies	M 6350
Дихроичное зеркало	Chroma Technologies	700 DCSPXR
Моторизованная сцена	ASI	MS2000
Piezo	PI	P721-LLQ
Фотоумножитель	Hamamatsu	H7422P-40
Карта сбора данных	IO tech	PCI 1128-4000
Программное обеспечение для визуализации	LFD	Global для изображений-SimFCS