В этом видеопротоколе мы отслеживаем - с высокой скоростью и в трех измерениях - флуоресцентно меченные лизосомы в живых клетках, используя метод орбитального слежения в модифицированном двухфотонном микроскопе.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
3D Орбитальная слежения в модифицированной двухфотонного микроскопа: Приложение к отслеживая внутриклеточного везикулы
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Цель данного видео протокола является обсуждение как выполнить и проанализировать трехмерную флуоресцентный орбитальный эксперимент отслеживания частиц с использованием модифицированного двухфотонного микроскопа 1. В отличие от традиционных подходов (растр сканирования или широкое поле на основе стека кадров), орбитальный слежения 3D позволяет локализовать и следовать с высоким пространственным (точность 10 нм) и временным разрешением (50 Гц АЧХ) 3D смещение перемещения люминесцентные частицы на длине масштабах от сотен микрон 2. Метод основан на алгоритме обратной связи, которая управляет аппаратными средствами двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа, чтобы выполнить круговую орбиту вокруг объекта, которые необходимо отслеживать: механизм обратной связи будет поддерживать флуоресцентный объекта в центре, контролируя смещение сканирующий луч 3-5. Чтобы продемонстрировать преимущества этой техники, мы следовали быстро движущихся органеллы, лизосому, в рамках альiving клеток 6,7. Клетки высевали в соответствии со стандартными протоколами, и окрашивали с использованием коммерчески лизосом краситель. Мы обсудим кратко аппаратную конфигурацию и более подробно программного управления, чтобы выполнить 3D орбитальный эксперимент отслеживания внутри живых клеток. Мы подробно обсудим параметры, необходимые для того, чтобы контролировать сканирующего микроскопа и позволить движение луча по замкнутой орбите вокруг частицы. Мы пришли к выводу, демонстрируя, как этот метод может быть эффективно использован для отслеживания быстрое движение меченой лизосом вдоль микротрубочек в 3D в живой клетке. Лизосомы может перемещаться со скоростью в диапазоне 0,4-0,5 мкм / сек, как правило, отображение, направленное движение по сети микротрубочек 8.
Введение
Большое количество подходов были разработаны до настоящего времени отслеживать флуоресцентные частицы в трех измерениях с помощью микроскопа. Большинство подходов основаны на использовании быстрых камер, идеально подходит для отслеживания в двух измерениях, как правило, в сочетании с индивидуальными модификаций выбросов оптики микроскопа, чтобы достичь отслеживания в осевом направлении. Лазерная сканирующих микроскопов (либо конфокальные или двух фотонов) условно можно отслеживать флуоресцентный частицу, выполняя временную последовательность Z-стеки, хотя этот процесс, как правило, отнимает много времени, и дает разумное разрешение по времени (10 Гц), если только час....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1 Подготовка образцов
- Поддержание CHOK1 клетки в тканевых культуральных колбах с использованием DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 100 МЕ / мл пенициллина 50 мкг / мл стрептомицина. Инкубируйте клетки в 5% CO 2 увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.
- Урожай а затем пластины CHOK1 клеток на 14 мм диаметром микро-скважины с толщиной поверхности 0,16 мм. Семенной клетки для оптимальной плотности для работы с изображениями, 60-70% слияния.
- Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С, 5% СО 2. Промыть клетки три раза в HBSS (Hank буферный солевой раствор), и инкубируют клетки в раствор, содержащ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В соответствии с этим протоколом быстрая 3D отслеживания одна частица может быть выполнена внутри живых клеток с использованием модифицированного двухфотонного микроскопа, чтобы отслеживать перемещение флуоресцентно меченных лизосом. Эксперимент выполняется заключается в отслеживании изолированную лизосому движется внутри клетки после процесса созревания эндосом 9. Лизосом окрашивали с помощью флуоресцентного зеленую краску и возбуждается на 930 нм эксплуататорских возбуждение 2-фотона. Наши данные показывают.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несмотря на огромные прогрессирует от флуоресцентных методов микроскопии и контрольно-измерительных приборов в течение последних лет, достижения траектории люминесцентных частиц в трех измерениях с высоким временным разрешением осталась с проблемой в области. Если высоким временным разрешением были достигнуты частицы отслеживания в двух измерениях, расширение в осевом направлении, как правило, приводит к резкому снижению частотной характеристики системы 10.
В этом видео-протокола .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Этот проект был поддержан грантами NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 и P50-GM076516
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Лизотрекер DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Тубулин трекер Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Когерентный хамелон-ультра II TI | Когерентный | ||
| Глан Тейлор Кальцитовый поляризатор | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Гальванометр-мотор зеркало | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Дихроичное зеркало | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Моторизованная сцена | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Фотоумножитель | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Карта сбора данных | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Программное обеспечение для визуализации | LFD | Global для изображений-SimFCS |
Ссылки
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
