Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Получение и выделение Аксоны от сенсорных нейронов для биохимического анализа, используя пористые фильтры

13.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51795

⸱

8 июля 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Neurology and Neurosurgery, Montreal Neurological Institute, McGill University

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описывается система культивирования нейронов, которая может быть использована для получения большого количества чистых образцов аксонов для биохимического и иммуноцитохимического анализа. Этот метод позволит лучше понять нормальную физиологию аксонов и сигнальные пути, ведущие к нейродегенерации.

Аннотация

Нейронные аксоны используют специфические механизмы для опосредования расширения, поддержания целостности и индуцирования дегенерации. Надлежащий баланс этих событий необходим для формирования функциональных нейронных цепей. Описанный здесь протокол объясняет, как использовать вставки для клеточных культур, содержащие пористую мембрану (фильтр), для получения большого количества чистых аксональных препаратов, пригодных для исследования обычными биохимическими или иммуноцитохимическими методами. Функциональность этих фильтрующих вставок будет продемонстрирована на моделях обрезки развития и валлеровской дегенерации с использованием эксплантов эмбрионального ганглия дорсального корня. Целостность и функция аксонов нарушаются при широком спектре нейродегенеративных патологий. Действительно, в настоящее время ясно, что аксональная дисфункция появляется гораздо раньше в течение заболевания, чем потеря сомы нейронов при некоторых нейродегенеративных заболеваниях, что указывает на то, что в этих расстройствах в первую очередь нацелены аксональные специфические процессы. Получая чистые образцы аксонов для анализа с помощью молекулярных и биохимических методов, этот метод может пролить новый свет на механизмы, регулирующие физиологию и патофизиологию аксонов. Это, в свою очередь, окажет влияние на наше понимание процессов, которые приводят к дегенеративным заболеваниям нервной системы.

Введение

Аксонов отсек нейронов показывает большую степень функциональной независимости от сомато-дендритных отсека. В проекционных нейронов, аксоны содержат большую часть нейронов 1,2 белка. Изучение физиологии и патофизиологии аксонов набрало обороты в неврологии сообщества, потому что недавние исследования показали, что раннее аксонов дисфункция, кажется, общая черта нейродегенеративных заболеваний и нервно-психических расстройств 3. Вполне вероятно, что лучшее понимание аксонов эксклюзивные механизмов при нормальных и патологических условиях прольет свет на ранних событий, которые ведут дисфункции.

Настоящий протокол описывает, как использовать культуру вставки подшипника пористую мембрану (фильтр), чтобы получить большие количества чистого аксонов материала, который подходит для биохимических и иммуноцитохимическая анализирует. Использование фильтра вставляет учиться аксонов биология была впервые реализована на Стюард иколлеги 4 и далее, разработанные Twiss и коллег 5 к ее нынешней конфигурации. Техника находится сейчас в текущей использования групп, изучающих различные аспекты аксонов и дендритов биологии, с небольшими изменениями в каждом конкретном случае для размещения для населения нейронов исследованных, лечение, выполняемые и тип биохимических анализов используется 6-9. Настоящий Протокол не намерен разместить всех альтернатив для такого разнообразия приложений, а скорее обеспечить простой подход, который подходит для большинства приложений. В частности, протокол, описанный здесь использует тройную покрытие, которое максимизирует аксонов выход для биохимических анализов и наиболее подходит для изучения дегенерация аксонов-другой покрытий, описанных в литературе производится меньше аксоны, что убираться и вырождающиеся быстрее, когда лишены трофических факторов 9.

В этой процедуре, нейронные органы клеток остаются изолированными на вершине Wh фильтровИль аксоны проходят через поры и расти вдоль его нижней поверхности. Чистые аксоны (свободные глии и нейронов загрязнений тела клетки), которые растут на нижней поверхности фильтра могут быть собраны для биохимических анализов или могут быть зафиксированы на месте и рассмотрены иммуноцитохимических методов 9. Процедура основана на использовании эмбриональных сенсорных нейронов из спинного ганглиев (DRG). Эмбриональные DRGs широко используются для изучения аксонов биологии, потому что нейритов из этих клеток претерпевают быстрый и устойчивый рост в пробирке, когда поддерживается в фактор роста нервов (NGF), а потому что они быстро дегенерируют когда лишены этого фактора. Кроме того, DRG нейроны не имеют дендриты, так что все невриты, собранные с помощью этого метода являются чисто аксоны.

Фильтровать вставки представляют большое преимущество по сравнению с другими подходами, используемыми для изучения аксоны. Исследования, основанные на принципе использования микроскопии дифференцировать процессы, происходящие в клетке сомы из тех, кто вXons обеспечивают ограниченную биохимический информацию. В качестве другого примера, узконаправленных систем культуры (например, Campenot камеры 10 или микрожидкостных устройств 11) полезны для подходов изображений и дифференцированного режима клеточных отсеках, но обеспечивают лишь небольшое количество аксонов материала, исключая применение этих методов для биохимических анализов, которые требуют относительно большие количества образца. Кроме того, их использование требует значительной подготовки, а также специализированные устройства, и они занимают много времени. Другой подход часто используется для изоляции аксонов от эксплантов является вручную удалить эксплантате центр (содержащий нейронные тела клетки) перед аксонов сбора проб. Хотя это может производить большое количество аксонов обогащенный препаратов, аксоны в этом препарате может быть, завернутые в глии и быстрого удаления тела 20 эксплантатов в последовательно от 6 скважин (в качестве примера минимального эксперимента) занимает много времени и на пределе возможности.

В противоположность этому, метод, представленный здесь производит обильные и чистые аксонов препараты, которые затем могут быть проанализированы с помощью практически любого биохимический метод, который обычно используется для анализа цельной клеточных лизатов, как вестерн-блоттинга, иммунопреципитации 6, Нозерн-блот-5 масс-спектрометрии 6, очистки РНК 7,12,13, среди других. Кроме того, протокол может быть применен к иммунофлюоресценции техники (If), как можно исправить аксоны, растущие в нижней стороне фильтра для дальнейшего изучения их IF. Такой подход значительно облегчает анализ аксонов конкретных процессов, так как нет клеточных тел в окончательной подготовки. Это значительное преимущество, так как высокая иммунофлуоресцентный сигнал от клеточных тел часто подрывает обследование и анализ более слабым сигналом, происходящих из тонких структур, таких как аксонов.

Два приложения метода культуры для изучения дегенерация аксонов арэ описано; модель обрезки развития и модели травмы-индуцированной дегенерации (обычно называют валлеровский дегенерации). Моделирование обрезки развития основана на том, что сенсорные нейроны в естественных условиях конкурировать для ограничения количества целевой полученных NGF и те не в состоянии получать достаточно нейротрофический поддержки вырожденный 14. Это явление можно имитировать в эмбриональных культурах DRG путем удаления NGF из культуральной среды, которая, как это происходит в естественных условиях, инициирует дегенерацию аксонов с последующим разрушением клеток тела. Для моделирования валлеровский дегенерации, верхняя сторона фильтра с клеточных тел разгреб. Аксоны, выросшие на нижней стороне фильтра стать физически отделен от клеточных тел и после этого пройти быструю и стереотипное дегенеративный процесс, известный как валлеровский дегенерации 15, имени А. Waller, которые впервые сообщили явление в 1850 году 16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Канадского совета уходу за животными. Все усилия по минимизации боль и страдания животных во время выполнения процедур.

1. Покрытие Фильтры

Примечание: Когда культура фильтрующие элементы размещены в лунки мульти-луночных планшетах, два отсека определены: верхний отсек область над пластиной и нижний отсек один ниже вставки Рисунок 1A.ab. Эксплантаты высевают в верхнем отсеке, где они придают верхней стороне фильтра; многие аксоны расти через фильтр и продлить на нижней стороне фильтра, в нижний отсек Рисунок 1A.c. Стандартные рабочие объемы (то есть для нанесения раствора покрытия, моет, питательных сред, и т.д.) 2 мл на нижнее отделение и 1 мл для верха и будут говорится в протоколе как "; Стандартные объемы ". Добавить решения, начиная со нижний отсек, помещая наконечник пипетки в промежутке между вставкой и боковой скважины. Кроме того, наклон вставку в одну сторону в то время как введения раствора, чтобы предотвратить пузыри от захваченных на нижней части фильтра.

  1. Начните покрытия фильтры накануне обшивки. Под стерильной капот культуры ткани, поместите 24 мм фильтр вставки в 6-и принимающей пластины. Инкубируйте пластины с поли-D-лизина в воде (1 мг / мл) в течение 1 часа при комнатной температуре с использованием стандартных томов: 2 мл в нижний отсек и 1 мл в верхней части.
  2. Аспирируйте поли-D-лизина и промыть один раз водой. Аспирируйте воды, закройте крышку и оставить тарелки сушить на капот O / N. Во время аспирации жидкостей, убедитесь, чтобы удалить остатки жидкости, которая попадает в ловушку прямо под фильтром.
  3. На следующее утро, разбавленные ламинин в воде (10 мкг / мл), перемешивают и тепло при 37 ° С Выдержите вставки с ЛАМИНИНА 1 час в челл-инкубатор при 37 ° С, с использованием стандартных объемов.
  4. Аспирируйте ламинин и коллаген добавить в воде (0,1 мг / мл) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. В этом случае используют 2 мл на нижнем отсеке и 2 мл на верхнем отсеке.
  5. Аспирируйте коллагена и мыть один раз стерильной водой. Фильтры теперь готов к приему питательных сред и DRG эксплантов, как описано в пункте 3.

2. Пройдя Эмбриональные Спинной ганглий корень (DRG) Экспланты

  1. Обезболить 13-дневный беременной женщины мышь с помощью IP-инъекции Avertin (250 мг / кг). Подождите 10-15 минут и проверьте отсутствие роговицы и педали рефлексов отмены. После того, как рефлексы отсутствуют, выполните шейки дислокации.
  2. Лечить все хирургические инструменты и женский живот с 70% этанола. Разрешить инструменты, чтобы высохнуть. Держите кожу живота и прорезать кожи и мышечных слоев, чтобы разоблачить брюшной полости.
  3. Удалить матку, отсоединив от шейки матки и яичников. В Steriле капот, удалить эмбрионов из матки с помощью ножниц и собирать их в чашку Петри, наполненную ледяной L15 СМИ. Держите на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. предыдущие технических отчетов для получения более подробной информации о том, как получить эмбрионы 13 дней беременности 17,18.
  4. Под микроскопом, лежал зародыш на стороне и использовать небольшие весенние ножницы, чтобы удалить голову. Сделать надрез вдоль боковых сторон отказаться от груди, живот, конечности и хвост. Держите спину содержащий позвоночник, лежал брюшной стороной вверх и удалите все внутренних органов.
  5. При небольших весенних ножницами, разоблачить всю спинной мозг путем разрезания позвоночник от его вентральной стороне вдоль средней линии. Держите тушку вниз с одной парой щипцов (# 3) и использовать вторую пару провести спинной мозг на самом ростральной аспект.
  6. Медленно и осторожно потяните шнур вдали от позвоночного полости и отщипнуть ДРГ из спинного мозга с использованием ультра-тонкие щипцы (# 5). Группа в ДРГ должны быть собраны нав нижней части блюда.
  7. Сбор сгруппированных ДРГ путем аспирации с кончика пипетки 200 мкл, разрезанные чтобы увеличить ее открытие. Поместите ДРГ в трубке и выйти на лед, пока коллекция DRG не закончится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: белый / прозрачный советы являются предпочтительными, поскольку DRGs не прилипают к стенкам этот совет (по сравнению со стандартными желтых кончиков). Промывка советы со средствами массовой информации перед использованием дополнительно предотвращает ДРГ от прилипания к его стенам.

3. Посев и обслуживание ганглия дорсального корня эксплантов на Фильтры

  1. Добавить полную DRG СМИ при 37 ° С до покрытых вставок с использованием стандартных объемов. Дополнение нижнюю отсека СМИ с 15 нг / мл NGF, сохраняя верхнюю отсек ФРН-бесплатно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, ФРН эффективно рассеивает на фильтре и его концентрация в равновесие в течение нескольких часов, мы наблюдали, что применение NGF в нижний отсек непосредственно перед посевом значительно увеличивает аксонов выход на бottom поверхности фильтра.
  2. Перенесите ДРГ из трубки к фильтрам с использованием 1000 мкл пипетки с наконечником подстриженной чтобы увеличить ее открытие.
  3. Нарисуйте носитель в Совет 2-3x перед сбором ДРГ. Это предотвращает их от прилипания к внутренней стороне наконечника. То же наконечник может быть повторно использован для всех скважин. Использование неокрашенных советы (против стандартных синих советы) снижает DRG прилипания к поверхности наконечника.
  4. Для передачи ДРГ, установите пипетки на 800 мкл. Аспирируйте около 200 мкл СМИ от верхней стороне фильтра, а затем перейти к DRG содержащих трубки и пипетки небольшой объем вверх и вниз - для ресуспендирования ДРГ, которые опустились на дно. Аспирируйте весь объем и пипеток ДРГ погружение наконечника в середине пластины.
  5. После того, как все вставки загружены, закройте крышку пластины и вихрем тарелку 10x, нажав на него мягко на капот скамейке между каждым водоворот. Эти движения увеличить аксонов выход, помогая DRG эксплантов раковиной иприкрепить к фильтру. Это также помогает распределить равномерно эксплантов так что аксоны из различных эксплантов не перекрываются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура посева эксплант описано в предыдущих шагах значительно увеличивает общую скорость привязанности эксплантата к подложке (до 75%). Наиболее важно, процедура пипетирования легко предотвращает эксплантов с плавающей на поверхности среды вместо опускаясь на дно вставки.
  6. Для биохимических анализов, семена ДРГ из одного эмбриона (около 30) на фильтр. Для морфологического анализа, использовать либо половину или треть ДРГ из одного эмбриона (10-15). Это решение должно быть принято перед сбором ДРГ в пробирки, так что все ДРГ из трубки высевают в одной скважины (будь то 30, 15 или 10 ДРГ).
  7. Поддержание культуры в клетке-инкубаторе при 37 ° С, изменение среды каждые 2-3 дня. Чтобы изменить носитель, аспирация верхний отсек первым, а затем нижний отсек. Добавить свежие СМИ в стандартном объемеы начиная с нижнего отсека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения клеток / аксоны от высыхания, не меняют средства массовой информации в более чем 3 вставками в то же время. DRGs, выращенные на фильтрах в присутствии NGF продлит длинные аксоны, идущие до 2 мм после 2 дней в культуре.

4. Трофический фактор Снятие Лечение

ФРН вывод вызывает дегенерацию аксонов с аксонов фрагментации (определяется фазового контраста и β-III-тубулина ИФ), что сначала появляется около 12 часа после выхода. Полное фрагментация достигается на 36 часа. Как долго дегенерация оставляют протекать в течение должен быть выбран конечным пользователем в соответствии с экспериментальной конструкции.

  1. После 2-дневного аксонов фазе расширения, изменить носитель из верхней и нижней отсеками для СМИ, что не хватает NGF и содержит анти-NGF антител (1 мкг / мл), чтобы изолировать все оставшиеся (или эндогенно производится) NGF.
  2. Вернуться пластины клеток инкубатор (37 ° C), чтобы позволитьNGF вывод-индуцированной дегенерации протекать в течение желаемого промежутка времени.
  3. Далее к экстракции белка (шаг 6) для исследования методом вестерн-блоттинга или непосредственно изучать фильтры по ПЧ (этап 7).

5. Аксонов Перерезка, чтобы побудить валлеровский дегенерации

Эта процедура выходит аксоны на нижней стороне фильтра, отделенной от их тела клетки, но в остальном без изменений. После этого, эти аксоны быстро начать валлеровский вырождение. Аксонов фрагментация (о чем свидетельствует фазового контраста или β-III-тубулина ИФ) впервые появляется на 3 часа после перерезки; на 9 часов, аксоны полностью фрагментированы и отдельно от фильтра. Как долго дегенерация оставляют протекать в течение должен быть выбран конечным пользователем в соответствии с экспериментальной конструкции.

  1. Собрать верхнюю сторону фильтра, содержащий выращенные DRG эксплантов, с сотовым-скребка. Убедитесь, полное удаление верхнего материала, перемещая скребок в X-, Y-и круговойнаправлениях.
  2. Отменить носитель из верхнего отсека, содержащего плавающие эксплантатов, которые были соскабливают с фильтра и заменить 1 мл подогретого, полное DRG среде, содержащей ФРН (10 нг / мл).
  3. Возврат к клетке пластину инкубатора (37 ° С), чтобы позволить валлеровский дегенерация протекать в течение от количества времени, выбранного конечного пользователя.
  4. Далее к экстракции белка (шаг 6) для исследования методом вестерн-блоттинга или непосредственно изучать фильтры по ПЧ (этап 7).

6. Белок Добыча аксонов образцов

  1. Заполните трубки сбора (1,5 мл) с 75 мкл буфера Лэммли образца. Держите пробирки на лед при уборке аксоны из всего набора фильтров.
  2. Промыть фильтр DRG эксплантов в PBS и очистить верхнюю сторону фильтра. Выньте вставку из пластины, чистки верхней стороне фильтра с хлопка наконечником аппликатором и аспирации каких-либо дополнительных PBS с верхней и нижней сторон.
  3. Наведите вставки потенциал ростана верстак и сократить фильтр из изолятора, используя острый скальпель. Держите фильтр пинцетом, снизу вверх. Сделать разрез от окружности к центру фильтра с ножницами.
  4. Место фильтр в верхней части пробирку, и щипцами, нажмите на центр фильтра вниз трубы. При этом, воронка должна стать. Нажмите воронкообразную фильтра к нижней части трубы так, что он погружен в буфере выборок Лэммли.
  5. Полный экстракции белка путем кипячения трубки в течение 4 мин. Извлеките фильтр с помощью пинцета, чтобы поместить его вверх-вниз в верхней части трубки и выполнения краткого спин (2000 х г в течение 15 сек). Откажитесь от сухих фильтров.
  6. Устранение 10 мкл аксонов белкового препарата в SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга для обнаружения белков, представляющих интерес.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве эталона, аксонов препарат из 20 эксплантов, выращенных в течение 2 дней и лизированных в 100 мкл RIPA буфера для лизиса будет иметь концентрацию белка 4-6мкг / мкл.

7. Иммунофлуоресценции Экспертиза Аксоны на Фильтры

Следующие шаги описаны основные манипуляции для выполнения ЕСЛИ окрашивания на фильтрующих вставок, на примере обнаружения β-III-тубулина. Фиксирующий, инкубационные времена, концентрации и другие данные должны быть оптимизированы для других антиген-антитело пар.

  1. Использование ранее используемые тарелки 6-а, тщательно очистить, для следующих моет и инкубации вставок.
  2. Кратко мыть вставки в PBS. Исправить их в свежеприготовленного 4% параформальдегида в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре на шейкере.
  3. После фиксации очистить и убрать верхнюю сторону пластины для сбора аксоны, которые росли исключительно на нижней поверхности фильтра. Продолжайте стандартных инкубации для IF.
  4. Инкубировать вставки в блокирующем растворе (TBS, 0,05% Tween 20, 5% обезжиренное молоко), с использованием стандартных объемов, в течение 1 часа при комнатной температуре и осторожном встряхивании.
  5. Передача вставляет к первичным антителом, разведенным в блокирующем буфере (анти-β-III-тубулина, 1:5000), с использованием стандартных объемов. Инкубировать O / N (~ 18 ч) при 4 ° С при осторожном встряхивании.
  6. Промыть первое антитело дважды в PBS (2 х 10 мин при комнатной температуре).
  7. Передача вставляет в люминесцентных конъюгированного с вторичными антителами разбавленных в блокирующем буфере (козий анти-мышь, 1:2000), с использованием стандартных объемов. Инкубировать покрыты от света в течение 2 ч при комнатной температуре и осторожном встряхивании.
  8. Промыть 3 раза вторичного антитела в PBS (3 × 10 мин при комнатной температуре).
  9. После ЕСЛИ завершена, принять вставить вне, вылить PBS от последней промывки и чистки верхней стороне фильтра с хлопка наконечником аппликатором. Аспирируйте любую жидкость из верхней и нижней сторон.
  10. Место вставить в обратном порядке на скамейке, и сократить фильтр из изолятора с острым скальпелем.
  11. Держите фильтр пинцетом, недостаток, и разместить на микроскопии слайда. Наложение с покровным и люминесцентные-совместимый муnting СМИ. Дайте высохнуть квартиру в холодной комнате, покрытый от света. Осмотрите и захвата изображений с помощью флуоресцентного микроскопа.
    Примечание: при хранении при 4 ° С в защищенном от света, эти препараты могут быть сохранены в течение нескольких недель с минимальной потерей флуоресценции.
  12. ВАРИАНТ: Альтернативно, если может быть выполнена на фильтрах, которые были удалены из вкладыша. Чтобы сделать это, скрести и чистить верхнюю сторону фильтров непосредственно после фиксации.
    1. Возьмем фильтры из вставок с острым скальпелем и место фильтров аксонов планом на дне шесть-луночного планшета.
    2. После этого, выполните инкубации для IF, как указано в 7,4-7,8 и 7,11. Преимущество этого варианта является то, что она сохраняет реагенты, так как, например, объемы инкубации может опускаться до 500 мкл (по сравнению с 3 мл используемых при фильтров непосредственно на окрашенных вставками, как показано на 7.1-7.11).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ганглиев дорзальных корешков эксплантаты от мышей E13.5 расти экстенсивно на фильтрах с покрытием последовательно поли-D-лизина, ламинин и коллаген (фиг.1В, слева), достигая до 2 мм в течение 2 дней в культуре. Это сочетание подложки дает особенно буйный рост; другие комбинации дают аксоны, которые значительно короче (Фиг.1В, справа). Кроме того, ДРГ поддерживается на фильтрах расширить больше и дольше аксоны, чем ДРГ, выращенных на пластиковой фиг.1С.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Важные параметры, которые следует учитывать при адаптации этой техники включают нейронов населения, которые будут изучены, субстрат, размер пор фильтра и площадь поверхности. Все эти параметры будут влиять на специфичность, качество и количество аксонов препарата, полученного, и, должно быть рассмотрено на конечного пользователя. В примерах, приведенных в данном протоколе, использование DRG нейроны имеет то преимущество, простирающийся только аксоны, что дает чистый (специфические) аксонов препарат.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Этот проект был поддержан грантом MOP62827 от Канадского института исследований в области здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мышь CD-1, беременность по времени E13Чарльз РиверБеременность по времени в домашних условиях может быть выполнена путем спаривания мышей и проверки вагинальных пробок (день E0)
Вставки для культуры клетокFalcon Corning3531021 &; m размер пор, подходит для 6-луночной приемной пластины
Falcon клеточной культуры компаньонные пластиныCorning353502Приемные пластины для вставок
Poly-D-лизинSigma-AldrichP6407Используется в концентрации 1 мг/мл в воде. Можно использовать повторно один раз.
ЛамининСигма-ОлдричL2020используется при 10 & микро; г/мл в воде. Возьмите 100x стоковый от -80 ° С и оттаивание Н/Н при 4°С; С 
PureCol раствор бычьего коллагенаAdvanced Biomatrix5005-B
Leibovitz's L-15 MediumInvitrogen11415-064Может быть заменен на DMEM
Neurobasal mediumInvitrogen21103-049
B-27 бессывороточная добавкаInvitrogen17504-044
5-Fluoro-2′-дезоксиуридин (FDU)Sigma-AldrichF0503
NGF (2,5S, бета-субъединица)CedarlaneCLMCNET-001
Антитело против NGFПриготовлено на собственном производствеКак описано в: Acheson, A. et al. Обнаружение нейротрофического фактороподобного активно-подобного фактора мозга в фибробластах и шванновских клетках: ингибирование антителами к NGF. Нейрон. 7, 265-75, (1991).
Alomone LabsAN-240Коммерческий вариант
Анти-тубулин антителоMilliporeMAB5564
Alexa Fluor 488 козье антитело против мышиInvitrogenA-11029
DRG культуральная среда
Нейробазальная среда
2% B27 нейробазальная добавка
2 мМ l-глутамин
1% пенициллин-стрептомизин
10 &; M FDU
15 нг/мл NGF (только нижний отсек)
1x Laemmli sample buffer
2% SDS
50 mM DTT
60 mM Tris (pH 6,8)
5% Глицерин
0,01% (w/v) бромфеноловый синий

Ссылки

  1. Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
  2. Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
  3. Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
  4. Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
  5. Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
  6. Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
  7. Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
  8. Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
  9. Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
  10. Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
  11. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  12. Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
  13. Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
  14. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
  15. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
  16. Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
  17. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  18. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
  19. Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Препарат аксоновспинальный ганглий задних корешковфактор роста нервовВаллеровская дегенерацияThere developmental pruning (развитийный прунинг)иммунофлуоресцентный анализэкстракция белковвставки для культивирования клетокфильтрующая мембрана
Получение и выделение Аксоны от сенсорных нейронов для биохимического анализа, используя пористые фильтры
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.