Клатрин-опосредованный эндоцитоз, быстрый и высокодинамичный процесс, интернализует многие белки, включая сигнальные рецепторы. Описанный здесь протокол непосредственно визуализирует кинетику отдельных эндоцитарных событий. Это важно для понимания того, как основные члены эндоцитарного аппарата координируются друг с другом и как белковый груз влияет на этот процесс.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация клатрином эндоцитоза из G-белками в Single-событий резолюции через TIRF микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Многие важные сигнальные рецепторы интернализуются через хорошо изученный процесс клатрин-опосредованного эндоцитоза (CME). Традиционные клеточные биологические анализы, измеряющие глобальные изменения в эндоцитозе, выявили более 30 известных компонентов, участвующих в CME, а биохимические исследования создали карту взаимодействия многих из этих компонентов. Тем не менее, становится все более очевидным, что CME является высокодинамичным процессом, регулирование которого является сложным и деликатным. В данной рукописи мы описываем использование флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF) для прямой визуализации динамики компонентов клатрин-опосредованного эндоцитарного механизма в реальном времени в живых клетках на уровне отдельных событий, которые опосредуют этот процесс. Этот подход необходим для выяснения тонких изменений, которые могут изменить эндоцитоз без его глобального блокирования, как это видно при физиологической регуляции. Мы сосредоточимся на использовании этого метода для анализа области, представляющей растущий интерес, а именно роли состава груза в модулировании динамики отдельных ям, покрытых клатрином (CCP). Этот протокол совместим с различными широко доступными флуоресцентными зондами и может быть применен для визуализации динамики многих молекул груза, которые интернализуются с поверхности клетки.
Введение
Процесс клатрин эндоцитоза (CME) зависит от своевременного прибытия многих компонентов клатрин опосредованного эндоцитоза машин для сбора грузов и манипулировать плазматическую мембрану в пузырьки 1-3. CME инициируется мембрана деформации и грузо-адаптера белков, которые приходят вместе в зарождающихся сайтов эндоцитоза 1. Эти белки набирать клатрин белка оболочки, который собирает в клетку-подобную структуру, которая образует клатриновых яму (КПК) 4. После того, как КПК полностью собран в сферическую форму, мембраны разрыва, в первую очередь через действия большого GTPase, динамина, генерирует свободные клатриновых везикулы (CCVS)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1 Выражение флуоресцентно меткой CME компонентов в культивируемых клетках
НЕК293 полезные модели клетки, которые были использованы широко изучать GPCR биологию и эндоцитоз, и поэтому используются в качестве моделей в этом протоколе. Используйте любой протокол трансфекции, обеспечивающую равномерное выражение без избыточной экспрессии и низкой цитотоксичности.
- Ручка все культуры клеток в стерильной ламинаре. Заполните 4 лунки 12-луночного планшета с 1 мл модифицированной по Дульбекко Essential медиа (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). С сливной T25 колбу НЕК293 разбавить 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, соответстве....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Использование живых клеток TIRF микроскопии мы записали эндоцитотического динамику μ-опиоидных-рецептора (МЖД), G-белком рецептор (GPCR) и его эндоцитотический адаптер белок β-arrestin. Β-arrestin конструкцию временно трансфицировали в клетки, стабильно экспрессирующие линии MOR, используя протокол, описанной на фигуре 1, и отображаемого 96 ч позже. MOR в стабильной клеточной линии является N-терминальной помечены с рН-чувствительной GFP. Этот флуоресцентный белок флуоресцирует только в нейтральной внек.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы опишем использование TIRFM визуализировать клатрином опосредованный эндоцитоз (CME) на уровне индивидуальной ККТ в живых клетках в реальном времени. CME является быстрым и очень динамичным событием посредничестве кумулятивного эффекта многие пространстве и во времени отдельных индивидуальных событий. Большинство анализов, которые в настоящее время используются, такие как биохимических измерений интернализации с использованием поверхности биотинилирование или связывание лиганда, проточной цитометрии или фиксиров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить докторов К. Шалински, Х. Тенга и М. Брухеза за помощь с Имарисом, Р. Вистейна и Д. Шиварски за техническую помощь и советы, а также д-ра М. фон Застрова, д-ра Т. Кирххаузена, д-ра Д. Друбина и д-ра В. Алмерса за реактивы и полезную дискуссию. Финансирование, предоставленное грантом T32, NS007433 SLB и NIH DA024698 и DA036086 MAP.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM/High Glucose с L-глутамином и пируватом натрия | Fisher Scientific | ||
| Фосфатно-солевой буфер (DPBS), без кальция, без магния | Gibco, от Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco, от Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, без фенола красного | Gibco, от Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, от Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE от Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | реагент для трансфекции |
| 25 мм покровное стекло | Fisher | Scientific 12-545-86 | |
| Колбы, обработанные культурой клеток Corning, 25 см<суп>2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Клеточная культура 6-луночный планшет | Greiner Bio-One, по VWR | 82050-896 | |
| Моноклональный ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin ацетатная соль (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Набор | для мечения белкаLife Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Программное обеспечение для анализа изображений | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, для автоматизированного анализа | |
| инвертированный микроскоп Nikon Eclipse Ti и необходимые аксессуары, включая фильтрующие кубы и фильтры | Nikon | ||
| TIRF arm с необходимыми адаптерами для Nikon Eclipse Ti | Nikon | Для регулировки угла падения | |
| фотоаппарата iXon+ EMCCD и адаптеров | Andor |
Ссылки
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clath....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
