Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиные Трансплантация роговицы: Модель по изучению наиболее распространенная форма твердого трансплантации органов

9.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51830

⸱

17 ноября 2014 г.

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Saint Louis University

В этой статье

Краткое содержание

Мыши были использованы в качестве модели для изучения многих форм трансплантации, включая трансплантацию роговицы. В этом отчете мы описываем мышиную модель как для острой, так и для поздней трансплантации роговицы.

Аннотация

Трансплантация роговицы является наиболее распространенной формой трансплантации органов в Соединенных Штатах, где ежегодно проводится от 45 000 до 55 000 процедур. Хотя существует несколько животных моделей для этой процедуры, и мыши являются наиболее часто используемым видом. Причинами использования мышей являются относительная стоимость использования этого вида, существование многих генетически определенных штаммов, которые позволяют изучать иммунные реакции, и существование обширного набора реагентов, которые могут быть использованы для дальнейшего определения реакций у этого вида. Эта модель была использована для определения факторов в роговице, которые отвечают за относительный иммунный привилегированный статус этой ткани, позволяющий аллотрансплантатам роговицы выживать при остром отторжении в отсутствие иммуносупрессивной терапии. Он также был использован для определения тех факторов, которые являются наиболее важными в отторжении таких аллотрансплантатов. Следовательно, многое из того, что мы знаем о механизмах принятия и отторжения аллотрансплантата роговицы, связано с исследованиями с использованием мышиной модели трансплантации роговицы. В дополнение к описанию модели острого отторжения аллотрансплантата роговицы, мы также впервые представляем модель отторжения аллотрансплантата роговицы на позднем сроке.

Введение

Трансплантация роговицы является одним из наиболее успешных и распространенных видов трансплантации, выполненных в организме человека. Причины, по которым эта операция выполняется, являются результатом травмы, инфекционные болезни 1, или других форм неинфекционной заболеваниями роговицы 2. Фигуры из глаз Банк ассоциации Америки показывают, что более 46 000 были выполнены в 2011 году (см сайт по адресу: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). Показателем успеха является то, что один год частота отказов для аллогенных пересадке роговицы в диапазоне от 10 до 15% и на 5 лет успеха превышает 70% 3-8. Как и многие исследования показали, что успех роговицы аллотрансплантатов напрямую связано с тем, что глаз является иммунологически привилегированных сайт. Факторы, ответственные за состояние роговицы в виде иммунной сайте привилегий относятся отсутствие обоих кровеносных и лимфатических сосудов в роговице, относительное отсутствие антиген-представляющих клеток, факторы произведенный роговицы этой suppresS иммунных эффекторных Funtions 9-15 низкая экспрессия антигенов МНС 16, и выражение FasL 17-20.

Тем не менее, несмотря на эти факторы, предрасполагающие эти трансплантаты для успеха, они подвергаются неприятие 3-7. Следовательно, понимание этих механизмов, которые обеспечивают этот отказ, а также проверки различных методов лечения для предотвращения отторжения имеет решающее значение. С этой целью, мы опишем здесь мышиную модель роговицы трансплантации, который был в эксплуатации более 20 лет, чтобы изучить трансплантации роговицы в контролируемой экспериментальной среде. Поскольку ответы трансплантации включают множество различных факторов, работающих в концерте, который будет конечная определяет, не является ли пересадить ткань или преуспевает, это не возможно, чтобы понять важность этих факторов в любой модели в пробирке. Следовательно, исследования с использованием интактных животных обязаны определить, какие факторы важны для любой успех или failuповторно из пересаженной ткани.

В то время как другие виды животных были использованы для изучения трансплантации роговицы, мышиной модели имеет несколько преимуществ по сравнению с использованием других видов. Во-первых, существование многих видов мышей, которые выражают определенные трансгенов или были ген-направленных на лишены экспрессии специфических иммунологических факторов, функция которых в трансплантации может быть лучше изучены. Кроме того, есть много реактивы (оба рекомбинантные факторы и антитела, которые нейтрализуют факторы), которые являются специфическими для мышей и которые не существуют для многих других видов животных. Из-за существования этих факторов, эта модель широко используется для выявления соответствующих факторов, участвующих в острых роговицы ответов Аллотрансплантация 15, 17,18,20 -29. Кроме того, многие из факторов, участвующих в трансплантации роговицы, также известный, чтобы быть функциональным в трансплантации других тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные, используемые в данной процедуре, рассматриваются в соответствии с Ассоциацией по исследованиям в области зрения и офтальмологии и убытках за использования животных в глазной и видение исследований, а также требований, установленных вниз комитета по надзору животных в Университете Сент-Луиса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты и растворы стерилизуют до операции, чтобы ограничить микробной инфекции глаза. Следует отметить, что в то время как животные делают испытывать некоторую боль от этой процедуры, мы не используем анальгетиков. Причина этого в том, что все анальгетики противовоспалительным и так роговицы трансплантации ответы включают воспаление, использование противовоспалительных препаратов может поставить под угрозу нашу способность определять, какие факторы участвуют в роговичного трансплантата недостаточности.

1. Анестезия

  1. Поместите донора и реципиента мышей под общим наркозом с помощью IP-инъекции кетамина (86.98 мг / кг) и ксилазина (13,04 мг / кг).
  2. Держите мышь получатель под наркозом в течение всей процедуры, которая, как правило, занимает от 30 мин до часа. Следовательно, постоянно контролировать мышь для каких-либо признаков приходя в сознание.
  3. Применить puralube мазь для глаз, которые не будут подвергаться операции после животное находится под наркозом, чтобы предотвратить сухость.

2. роговицы Прививка

  1. Получение кнопку донорской роговицы.
    1. После того, как животное полностью под наркозом, достичь адекватного мидриаз введением нескольких глазных капель 1% тропикамид и гидрохлорида фенилэфрина 2,5%.
    2. Расположите головку животного-донора в горизонтальном положении на щите, расположенном на прочную подвижной опоре. Закрепить головку с полосой ленты поперек шеи, чтобы гарантировать, что глаз находится в горизонтальном положении на протяжении всей операции.
    3. Использование диаметром 2 мм трепана, чья верхушка была окрашена с метиловым синим, извыравнивают центральный сайт роговицы трансплантата.
    4. С острым лезвием, проникают через роговицу и придать Геалона в переднюю камеру, чтобы углубить его, чтобы уменьшить вероятность повреждения доноров эндотелия и подстилающей линзы.
    5. Акцизный доноров трансплантата с Vannas ножницами и поместить в чашку, содержащую Хэнкса сбалансированный солевой раствор до использования.
    6. После донор трансплантата была удалена, усыпить доноров мышь через CO 2 ингаляции.
  2. Подготовка трансплантата кровать.
    1. Повторите те же действия, как описано в 2.1.1 через 2.1.2 для получателя.
    2. Используя 1,5 мм диаметр трепана, очертить получатель трансплантата сайт.
    3. С острым лезвием, проникают через роговицу и придать Геалона в переднюю камеру, чтобы углубить его, чтобы уменьшить вероятность повреждения основного объектива.
    4. Снимите описанной центрального участка роговицы кнопку от получателя помощи Vannas ножницы и выбросить.
  3. Наложение швовтрансплантат
    1. Поместите донорской роговицы над трансплантата кровать в роговице реципиента. Убедитесь, что адекватная Геалоном находится под донорской роговицы, чтобы защитить донор эндотелиальные клетки от повреждений при непосредственном контакте с линзой.
    2. Использование супер точная наклоненная microforceps, поместите первый укус 11-0 нейлона шва в стороны доноров, через донора с 90% глубины всей толщине в стороне получателя, то галстук.
    3. После того, как роговица закрепить на месте, выполнять midcardinal узловыми швами таким образом, что роговица имеет от 8 до 10 полных швов и донорскую роговицу надежно выстроились с и прикрепленные к реципиента трансплантата роговицы постели.
  4. Углубление передней камеры
    1. Углубление передней камеры, вводя HBSS или воздушный пузырь в переднюю камеру и мягко проверить целостность роговицы трансплантат для утечки с целлюлозной губкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если передняя камера не может быть реформирована, то существует высокая вероятность того, сataract которые сделают будущие оценки пересаженной роговицы очень трудно и также потенциально привести к донорской роговицы дисфункции эндотелия и тем самым трансплантата провал.
  5. Окончательная оценка
    1. Соблюдайте глаз определить, что ученик круглая и глубина передней камеры нормально.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ученик не круглая это означает, что во время наложения швов диафрагмы был поврежден и, таким образом, трансплантат считается техническая неисправность.
    2. Применить мазь с антибиотиком для глаз. Дополнительно: Закройте крышку глаз с 7-0 шелковой нити.
    3. Соблюдайте мышей, пока они не полностью проснулся, а затем индивидуально размещения их в течение как минимум двух дней после операции.

3. Шов удаления

  1. В тех случаях, когда используется крышка шва, анестезию мышей, как описано выше, и снять крышку шва на 48 ч.
  2. Обезболить мышей на 7-й день после операции. Снимите suturэс обеспечения трансплантата роговицы. После того, как швы снимаются и животное полностью проснулся, вернуть его в клетку.

4. Клиническая оценка

  1. Осмотрите глаза на показаниях процессуальных осложнений, которые включают, катаракта (помутнение хрусталика), Гифема (кровь в передней камере), переднюю камеру, которая не нужную глубину, или значительной непрозрачности роговицы. Рассмотрим те, которые демонстрируют эти осложнения, как "угрозу" и усыпить их CO 2 ингаляции.
    1. Выполните все экзамены по наркозу мышей. Держите мышь с одной стороны, таким образом, сдерживая мыши так, что с другой стороны может proptose глаз для того, чтобы лучше видеть глаза. После наблюдения будут завершены, вернуть животное в клетку.
  2. Уже наблюдатель не знаком с группами лечения оценивает пересадили роговицы от 2 до 3 раз в неделю на наличие признаков роговицы трансплантатэпизоды отторжения или роговицы отказ трансплантата. Используйте или операционного микроскопа или горизонтальная щель-лампы biomicroscope для этих наблюдений.
    1. Оцените каждый роговицу для непрозрачности, используя шкалу от 0 до 5. определяется следующим Масштаб:
      1. Назначьте балл от 0 до тех роговицы, которые не имеют никаких признаков непрозрачности.
      2. Связать 1 балл в этих роговиц, которые показывают минимальную поверхностную непрозрачность.
      3. Связать 2 балла для роговицы, которые отображают мягкий и глубокий непрозрачность но основных ученик и ирис все еще различимы.
      4. Связать оценку 3 с роговицы, которые должны показываться стромы непрозрачность котором диафрагма не может рассматриваться в деталях, за исключением ученик маржи.
      5. Связать 4 балла в роговице, которые должны показываться плотную стромы непрозрачность и если нет, лежащие в основе структуры не могут быть просмотрены.
      6. Связать 5 баллов на роговице, которые должны показываться полную непрозрачность и интенсивный отек стромы, с учеником и ириса полностью закрыт.
    2. Также оценить каждый роговицу для степени кровеносных сосудов инфильтрации (неоваскуляризации) с использованием рейтинговой шкалы от 1 до 8. Для достижения этой цели, смотреть роговицу, как состоящий из 4 равных квадранта и определения количества кровеносных сосудов в каждой из этих секторах с забить, что находится в пределах от 0 (нет сосудов) до 2 для обширной васкуляризации этого квадранта. Добавьте индивидуальные баллы от каждого квадранта рассчитать окончательный счет образования новых сосудов.
    3. Оцените роговицы, как остро отклонены, если они имеют оценку 3 для двух последовательных наблюдений за время указывает до 5 недель.
    4. Оцените мышей, чья роговицы были ясно 5 недель, но развиваются помутнение порой> 45 дней после приживления, со счетом 3 для двух последовательных временных точках, как имеющие подвергся поздно перспективе отказ роговицы аллотрансплантата. Используйте кривые выживаемости Каплана-Мейера для анализа выживаемости трансплантата.

5. Манипуляции с моделью

в-влево: 40px; ">
  • Подготовка отдельных клеток из селезенки.
    1. Для подготовки отдельных клеток, сначала усыпить доноров мышь. Затем снимите селезенки.
    2. Поместите селезенки в ячейки фильтра и сорвать его с поршня шприца от 3 мл шприц.
    3. Промыть клетки и ресуспендируют в 10 мл Hanks Balanced Salt Solution.
    4. Удалить 10 мкл клеточной суспензии и добавление 10 мкл 0,4% трипанового синего и перемешать. Добавим, что на гемоцитометре и подсчета клеток в центральной сетке. Число клеток в пробирку является число клеток х 10 4 х 2 (коэффициент разбавления в трипанового синего) х 10 (объем в трубе).
  • Инъекции в переднюю камеру.
    1. Обезболить мышей, как описано ранее.
    2. Выполните инъекции, используя рассекает микроскопом. Для каждого внутрикамерного инъекции, использовать 10 6 клеток селезенки в 0,005 мл объема и 0,25 мл мкл шприц, снабженный иглой 33 G.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие манипуляциимодели может быть выполнена путем обработки животных с реагентами, которые действуют как ни антагонистов или агонистов, чтобы определить роль, что конкретный фактор может играть следующие ортотопической роговицы аллотрансплантата хирургии.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Мышиной модели трансплантации роговицы был использован на протяжении более 20 лет успешно характеризуют механизмы как роговицы отторжения трансплантата 19-23 и роговицы принятия трансплантата 13, 15,16,18, 24-27. Эта модель была использована для создания важность выражения FasL роговицы принятия трансплантата, в том, что животные, которые не имеют FasL не смогли принять роговицы аллотрансплантаты 15. Кроме того, было использовано, чтобы продемонстрировать, что сосудистый эндотелиальный ф...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Мышиной модели роговицы трансплантации описанной здесь позволяет следователю для изучения человеческого роговицы отторжения трансплантата в модели, которая предсказывает, какие факторы лучше всего связан как с отказом 15,17,18,20, 26-30 и принятия 21-25 роговицы аллотрансплантаты. В отличие от роговицы трансплантации человеческого, в котором пациенты получают либо местное или системное лечение стероидами либо лечения или предупреждения отторжения 31, эта модель, как правило, используется...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

    Благодарности

    Авторы хотели бы поблагодарить многих людей, которые работали над этой техникой и усовершенствовали ее, а также были ответственны за создание многих рукописей как в этой лаборатории, так и в других. Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения EY12707 (PMS) и неограниченным грантом от Исследований по предотвращению слепоты для Департамента офтальмологии.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Zeiss Хирургический микроскоп ZeissRebuilt
    1 мл ШприцBD305122
    3 мл ШприцBD309657
    10 мл ШприцBD309602
    Ножницы VannusStortzE-3387
    11-0 Шовные материалыAlcon717939M
    Трепан 2,0 ммKatenaK 2-7520
    Трепан 1,5 ммKatenaK 2-7510
    Трикаина гидрохлорид 0,5%AlconNDC 0065-0741-12
    HealonAbbottHealon OVD
    ЩипцыFST11251-20
    7-0 Шовные материалыAlcon8065
    2,5% Фенилэфрин гидрохлоридAlconNDC 61314-342-02
    1% тропикамидBausch & LombNDC-24208-585-59
    Шприц HamiltonHamilton7654-01
    игла 33 калибраHamilton90033
    (100 μ m нейлон)BD Falcon352360
    ГемоцитометрCardinal HealthB3175
    Trypan BlueSigmaT8154
    Сетчатый фильтр

    Ссылки

    1. Farooq, A. V., Shukla, D. Herpes simplex epithelial and stromal keratitis: an epidemiologic update. Surv. Ophthalmol. , 448-462 (2012).
    2. Gipson, I. K. Age-related changes and diseases of the ocular surface and. Invest. Opthlamol. Vis. Sci. 54, 48-53 (2013).
    3. Edwards, M., et al. Indications for corneal transplantation in New Zealand: 1991-1999. Cornea. 21, 152-155 (2002).
    4. Thompson, R. W., Price, M. O., Bowers, P. J., Price, F. W. Long-term survival after penetrating keratoplasty. Ophthalmol. 110, 1396-1402 (2003).
    5. Williams, K. A., Roder, D., Esterman, A., Muehlberg, S. M., Coster, D. J. Factors predictive of corneal graft survival. Report form the Australian Corneal Graft Registry. Ophthalmology. 99, 403-414 (1992).
    6. Larkin, D. F. Corneal allograft rejection. Br. J. Ophthalmol. 78, 649-652 (1994).
    7. Boisjoly, H. M., et al. Risk factors of corneal graft failure. Ophthalmol. 100, 1728-1735 (1993).
    8. Sugar, A., et al. Recipient Risk Factors for Graft Failure in the Cornea Donor Study. Ophthalmol. 116, 1023-1028 (2009).
    9. Namba, K., Kitaichi, N., Nishida, T., Taylor, A. W. Induction of regulatory T cells by the immunomodulating cytokines alpha-melanocyte-stimulating hormone and transforming growth factor-beta2. J. Leukoc. Biol. 72, 946-952 (2002).
    10. Taylor, A. W., Yee, D. G., Streilein, J. W. Suppression of nitric oxide generated by inflammatory macrophages by calcitonin gene-related peptide in aqueous humor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 1372-1378 (1998).
    11. Wilbanks, G. A., Mammolenti, M., Streilein, J. W. Studies on the induction of anterior chamber-associated immune deviation (ACAID). III. Induction of ACAID depends upon intraocular transforming growth factor-beta. Eur. J. Immunol. 22, 165-173 (1992).
    12. Volpert, O. V., et al. Inducer-stimulated Fas targets activated endothelium for destruction by anti-angiogenic thrombospondin-1 and pigment epithelium-derived factor. Nat. Med. , 8-349 (2002).
    13. Apte, R. S., Sinha, D., Mayhew, E., Wistow, G. J., Niederkorn, J. Y. Cutting edge: role of macrophage migration inhibitory factor in inhibiting NK cell activity and preserving immune privilege. J. Immunol. 160, 5693-5696 (1998).
    14. Kennedy, M. C., et al. Novel production of interleukin-1 receptor antagonist peptides in normal human cornea. J. Clin. Invest. 95, 82-88 (1995).
    15. Shimmura-Tomita, M., Wang, M., Taniguchi, H., Akiba, H., Yagita, H., Hori, J. Galectin-9-mediated protection from allo-specific T cells as a mechanism of immune privilege of corneal allografts. PLoS One. 8, (2013).
    16. Goldberg, M. F., Ferguson, T. A., Pepose, J. S. Detection of cellular adhesion molecules in inflamed human corneas. Ophthalmol. 101, 161-168 (1994).
    17. Stuart, P. M., Griffith, T. S., Usui, N., Pepose, J. S., Yu, X., Ferguson, T. A. CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis is necessary for corneal allograft survival. J Clin Invest. 99, 396-402 (1997).
    18. Yamagami, S., et al. Role of Fas-Fas ligand interactions in the immunorejection of allogeneic mouse corneal transplants. Transplantation. 64, 1107-1111 (1997).
    19. Stuart, P. M., Pan, F., Plambeck, S., Ferguson, T. A. Fas/Fas ligand interactions regulate neovascularization in the cornea. Invest. Ophthalmmol. Vis. Sci. 44, 93-98 (2003).
    20. Stuart, P. M., Yin, X. T., Pan, F., Haskova, Z., Plambeck, S., Ferguson, T. A. Inhibitors of matrix metalloproteinases activity prolong corneal allograft acceptance by increasing FasL expression. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1169-1173 (2004).
    21. Joo, C. -K., Pepose, J. S., Stuart, P. M. T-cell mediated responses in a murine model of orthotopic corneal transplantation. Invest.Ophthalmol. Vis. Sci. 36, 1530-1540 (1995).
    22. Sonoda, Y., Sano, Y., Ksander, B., Streilein, J. W. Characterization of cell-mediated immune responses elicited by orthotopic corneal allografts in mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36, 427-434 (1995).
    23. Sano, Y., Osawa, H., Sotozono, C., Kinoshita, S. Cytokine expression during orthotopiccorneal allograft rejection in mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 1953-1957 (1998).
    24. Haskova, Z., Usui, N., Ferguson, T. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. CD4+ T cells are critical in corneal but not skin allograft rejection. Transplantation. 69, 483-488 (2000).
    25. Tan, Y., et al. Immunological disruption of antiangiogenic signals by recruited allospecific T cells leads to corneal allograft rejection. J. Immunol. 188, 5962-5969 (2012).
    26. Dana, M. R., Yamada, J., Streilein, J. W. Topical interleukin-1 receptor antagonist promotes corneal transplant survival. Transplantation. 63, 1501-1507 (1997).
    27. Cunnusamy, K., Chen, P. W., Niederkorn, J. Y. IL-17A-dependent CD4+CD25+ regulatory T cells promote immune privilege of corneal allografts. J. Immunol. 186, 6737-6745 (2011).
    28. Fu, H., et al. Arginine depletion as a mechanism for the immune privilege of corneal allografts. Eur. J. Immunol. 41, 2997-3005 (2011).
    29. Medina, C. A., Rowe, A. M., Yun, H., Knickelbein, J. E., Lathrop, K. L., Hendricks, R. L. Azithromycin treatment increases survival of high-risk corneal allotransplants.Cornea. , 32-658 (2013).
    30. Cho, Y. K., Zhang, X., Uehara, H., Young, J. R., Archer, B., Ambati, B. Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 morpholino increases graft survival in a murine penetrating keratoplasty. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 8458-8471 (2012).
    31. Kim, H. K., Choi, J. A., Uehara, H., Zhang, X., Ambati, B. K., Cho, Y. K. Presurgical corticosteroid treatment improves corneal transplant survival in mice. Cornea. 32, 1591-1598 (2013).
    32. Yamazoe, K., Yamazoe, K., Shimazaki-Den, S., Shimazaki, J. Prognostic factors for corneal graft recovery after severe corneal graft rejection following penetrating keratoplasty. BMC Ophthalmol. 13, 5(2013).
    33. Panda, A., Vanathi, M., Kumar, A., Dash, Y., Priya, S. Corneal graft rejection. Surv. Ophthalmol. 52, 375-396 (2007).
    34. Patel, S. V. Graft survival and endothelial outcomes in the new era of endothelial keratoplasty. Exp. Eye Res. 95, 40-47 (2012).
    35. Anshu, A., Price, M. O., Tan, D. T., Price, F. W. Jr Endothelial keratoplasty: a revolution in evolution. Surv. Ophthalmol. 57, 236-252 (2013).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Теги

    Мышиные Трансплантация роговицы: Модель по изучению наиболее распространенная форма твердого трансплантации органов
    Свяжитесь с нами
    Рекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия эксплуатации

    Политика

    Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.