Методическая статья

Улучшенные В-гель восстановительного β-Ликвидация для Комплексная О-связанные и сульфо-glycomics помощью масс-спектрометрии

DOI:

10.3791/51840

⸱

20 ноября 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы всесторонне исследовать разнообразие О-связанных гликанов, новая процедура восстановления β в геле в сочетании с перметилированием и методом быстрого разделения фаз применяется к анализу О-связанных гликанов, непосредственно высвобождаемых из гликопротеинов, разрешенных с помощью SDS-PAGE и поддающихся последующему гликомическому анализу с помощью масс-спектрометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разделение белков с помощью SDS-PAGE с последующим протеолитическим расщеплением разрешенных белковых полос в геле привело к протеомному анализу биологических образцов с высоким разрешением. Аналогичные подходы, которые позволили бы провести углубленный анализ гликанов, переносимых гликопротеинами, разрешенными с помощью SDS-PAGE, требуют особого внимания для максимального восстановления и чувствительности при использовании масс-спектрометрии (МС) в качестве метода обнаружения. Основным препятствием, которое необходимо преодолеть для получения высококачественных данных, является удаление гелевых загрязнителей, которые мешают анализу РС. Представленный здесь рабочий процесс образцов надежен, эффективен и устраняет необходимость в поточной очистке ВЭЖХ перед МС. Кусочки геля, содержащие целевые белки, промываются в ацетонитриле, воде и этилацетате для удаления загрязняющих веществ, включая фрагменты полимерного акриламида. О-связанные гликаны высвобождаются из целевых белков путем восстановления β в геле и восстанавливаются с помощью надежных и простых процедур очистки. Преимущество этого рабочего процесса заключается в том, что он повышает чувствительность к обнаружению и характеризации сульфатированных гликанов. Эти процедуры обеспечивают эффективное отделение сульфатированных перметилгликанов от несульфатированных (сиалированных и нейтральных) перметилированных гликанов путем быстрого разделения фаз перед анализом МС и, таким образом, улучшают гликомический и сульфогликомический анализы гликопротеинов, разрешенных с помощью SDS-PAGE.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гликозилирование является важным белком посттрансляционная модификация, способствуя организменном физиологии, ткани патологии и клеточной признания 1-3. Несмотря на значительные достижения в аналитической glycoscience, характеризующий полное разнообразие гликанах на специфического белка остается чрезвычайно сложной задачей, особенно на белки, выделенные из первичных биологических источников. Тем не менее, микрогетерогенность гликопротеина гликанов часто влияет функциональных взаимодействий с другими белками. Таким образом, характеристика гликана разнообразия имеет важное значение для понимания физиологическое значение клеточной и тканевой гликозилирования 4,5. Для того чтобы понять вклад гликопротеина гликозилирования к ткани физиологии и патофизиологии, надежной, чувствительной и комплексных glycomic аналитических методов становятся все более важными. В протеомного анализа, белковые идентификации, как правило, достигается с помощью ЖХ-МС/ MS анализ триптических пептидов 6. Белок пищеварение может быть осуществлена ​​с использованием очищенного белка или белков решена путем SDS-PAGE в следующий-гель расщеплением протеаз, таких как трипсин 7-9. Предварительно обогащение смеси белков с помощью SDS-PAGE повышает глубину и точность белка ID. Развитие аналогичных стратегий для glycomic анализа гликопротеина гликозилирования лежит на переднем крае glycoscience.

Два основных класса гликанах крепятся к белковых магистралей через любой N-связи или O-связи. N-связанных гликанов прикреплены к аспарагина (Asn) остатки, найденные в рамках sequon определяется как Asn-X-Ser / Thr / Cys (Х обозначает любую аминокислоту кроме пролина), и может быть выпущен ферментативным расщеплением с пептидные N -glycanase (помощью PNGазы F или), либо в растворе, в-гель, или на 10-12-блота. О-связанных гликаны основном привязаны к серин (Ser) или треонина (Thr) остатков. Тем не менее, только один фермент был идентифицированы, что способна высвобождать О-связанных гликанов из гликопротеина, и это имеет очень ограниченную специфичность гликана, выпуская только самые простые О-связанных гликанов. Стратегии Химическая релиз остаются методом выбора для комплексного выпуска О-связанных гликанов из гликопротеинов. Восстановительное или нередуктивных β-устранение, или гидразинолиз методики хорошо охарактеризованные химической релиз и в настоящее время наиболее часто используемые подходы к выпуская О-связанных гликаны из гликопротеинов 13,14. Хотя восстановительное β-элиминирования был использован, чтобы выпустить О-связанных гликанов из гликопротеинов, разделенных электрофорезом в ДСН-ПААГ, прежние подходы требуется разделение ВЭЖХ для последующего анализа 15-17.

Многомерные MS (MS н) анализ в настоящее время предоставляет богатейший источник структурных данных для определения характеристик гликаны выпущенные из гликопротеинов, выделенных в сумме, от большинства биологических источников. Глубина МС-based структурная характеристика в значительной степени способствует permethylating высвободившиеся гликаны до их анализа. Permethylation усиливает ионизацию и имеет тенденцию к выравниванию молярных ответов сигналов в широком диапазоне гликанов структур 18,19. Кроме того, permethylation однозначно теги терминала и замещенных моносахаридов фрагменты с характерными массами, тем самым повышая структурного анализа 20-23. Например, кислотные гликанов, как правило, трудно обнаружить, как не-перметилированный видов с помощью МС. Хотя кислые гликанов могут быть обнаружены в режиме отрицательных ионов с помощью МС, невозможно обнаруживать как кислых и нейтральных гликанов в том же режиме ионов. Основным преимуществом гликановой permethylation является то, что все количества свободных гидроксильных групп (ОН) на моносахаридных заместителей гликанов будет ограничен метильной группой (ОСН 3 или OMe), таким образом, расходы сиалилированы гликанов являются нейтрализованной, что делает их, как обнаруживается, как перметилированный нейтральный (АзияLO) гликаны. Тем не менее, гидроксильные сульфатных остатков на sulfoglycans устойчивы к permethylation, в результате удержания анионного заряда, который подавляет ионизацию и снижает чувствительность. Это подавление настоящее время препятствует всеобъемлющей glycomic анализ очень сложных гликопротеинов, таких как муцинов, которые несут высокую численность сульфатированных гликанах 24-26.

Последние сообщения на очистных сульфатированный гликанов использовали заряжен, хроматографией с обращенной фазой, чтобы очистить и отдельные перметилированный гликанов до анализа MALDI. Этот метод основан на полном разделении сульфатированных и не сульфатированных гликанах использованием различных подвижных фаз для вымывания, которые мы нашли, чтобы быть менее строгими, чем органическую фазу разделения. Таким образом, новые методы, пригодные для обнаружения и обогащения sulfoglycans представлены здесь. Эти методы позволяют для количественного восстановления сульфатированных гликанов в водной фазе следующим воды: ДХМ (дихлорметан)экстракция, который обычно выполняется в конце гликанов реакций permethylation 27. Важно отметить, что этот надежный разделение перметилированных sulfoglycans из смеси перметилированных не-сульфатированных гликанов одновременно обогащает для заряженных частиц а также упрощение МС 2 модели фрагментации. Комплексный протокол для улучшения вывода связями гликана анализа в геле также представлены. Улучшенный протокол усиливает гликана восстановление, увеличивает структурную информацию, получаемую с помощью MS н анализ перметилированных гликанов, и улучшает чувствительность анализа sulfoglycomic применяемых к основным гликопротеинов, выделенных из биологических источников.

Этот протокол предназначен для O-связанных гликанов анализа целых гликопротеиновых экстрактов или конкретного интереса гликопротеина решена путем SDS-PAGE и состоит из трех экспериментальных процедур; ) Гель очистки, B) в геле восстановительное β-устранение, и C) гликана permethyтельства. Цель состоит в том, чтобы получить всесторонние О-связанных glycomic данные для гликопротеинов, собранного из основных источников биологического интереса (рисунок 1). Гликопротеины разделенных электрофорезом в ДСН-ПААГ которые визуализировали окрашиванием и полосы, представляющие интерес, вырезали и полученный гель полоса нарезанный на небольшие кусочки. Гелевые куски обесцвечивают и подвергали этилацетат промывок для удаления загрязнений гелевые (фиг.2А). Glycan релиз достигается в-гель восстановительного β-элиминирования (рис 2В), а высвобожденные гликаны перметилированный. Водно-органических добыча следующие permethylation количественно разбивает анионные сульфатированной гликаны от не-сульфатированных нейтральных гликанах (рис 2в). В-гель восстановительное β-элиминирования, соединенный с водно-органической экстракции дает характеристику О-связанных гликанов и sulfoglycans освобожденных из небольших количеств гликопротеина разделенных электрофорезом в ДСН-ПААГ. Стратегический обзор является конспектыЗет на рисунке 1 и детали показаны на рисунке 2. Кроме того, часть обесцвечивают и промывают кусочки геля может быть использован для белка ID стандартными LC-MS / MS протеомическим методов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Лабораторные соображений безопасности

В соответствии со стандартными лабораторными лучших практик, соблюдайте следующие. Храните все органические растворители в соответствующих местах. Храните все отходы в контейнерах химических отходов с четкую маркировку химических составов. Как несколько реагентов, используемых в этих протоколах, являются потенциальными канцерогенами или генерировать летучие горючие газы, обрабатывать все реагенты в вытяжном шкафу с вентиляцией. Средства индивидуальной защиты, такие как перчатки, халат и средства защиты глаз при работе с органическими растворителями.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Порядок в-гель уплотнительных glycomics. (A) Белки интерес решаются SDS-PAGE, обнаружены с помощью соответствующих процедур окрашивания (Coomassie или серебра), и вырезали. Вырезанные куски геля нарезанныйна маленькие кубики, обесцвечивают и промывают этилацетатом, чтобы уменьшить загрязняющие вещества, которые мешают последующего анализа MS. Часть куска геля могут быть зарезервированы для в-гель триптического пищеварения и последующей протеомного характеристики ЖХ-МС / МС. (B) О-связанных гликаны освобождаются от разрешенных гликопротеинов в-гель восстановительного β-элиминирования. Эфирные шаги включают обессоливания и борат ее удаления азеотропа с метанолом. (C) О-связанных гликанов выпущенные восстановительным β-элиминирования которые перметилированный и затем разделяется на водную и органическую фазы. Sulfoglycans количественно извлекают в верхней (водной) фазе в то время как нейтральные и сиалилированы гликанов раздела в нижнем слое (DCM).

figure-protocol-2
Рисунок схема 2. Деталь для в-гель glycomics. Каждый экспериментальТаль шаг показано на рисунке 1 в индивидуальном рисунке. (A) гель Обесцвечивание и добыча EtOAc, (B) направлять в-гель восстановительное β-элиминирование для O-связанного гликана выпуска и (C) permethylation и фазы раздел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию рисунка.

1. Гель иссечение и удаление Гель-производных загрязняющих веществ

  1. Перед началом процедуры, подготовить химикаты и реактивы, перечисленные в списке материалов.
  2. Устранение белка на SDS-PAGE геле с использованием стандартных Трис-глицин буферных систем. Пятно решен белки с любой Кумасси или серебром. В общем, восстановление О-связанных гликанов из серебра окрашивали гелей составляет примерно 80-90% от достигнутой восстановления от окрашивани гел кумасси синим.
  3. После электрофореза разместить гель на стеклянную пластину и акцизного тон область интереса с помощью чистой скальпель или лезвие бритвы.
  4. Для повышения урожайности уплотнительных гликанах, передать гель полосу интерес на другой стеклянной пластиной и вырезать вырезали гель кусок в приблизительно 2 мм кубов. Избегайте кусочки геля меньше, чем 1 мм, поскольку кубики гликанов восстановления уменьшается. Перенесите небольшие кусочки геля в винтовой верхней стеклянной трубки (13 х 100 мм) с microspatula из нержавеющей стали.
  5. Добавить 1 мл 25 мМ бикарбоната аммония (AMBIC, NH 4 HCO 3) в пробирку, крышка стеклянную трубку с тефлоновым покрытием винта верхней крышки, и аккуратно перемешать, щелкая трубки, прежде чем дать постоять 10 мин. Не используют интенсивном перемешивании, чтобы избежать копирования на кусочки геля.
  6. Осторожно снимите AMBIC из стеклянной трубки, используя либо стеклянной пипетки Пастера или пипетки, оснащенный удлиненной пластиковым наконечником. Избегайте разбивая и передачи небольшие кусочки геля при удалении AMBIC решение.
  7. Добавить 1 мл ацетонитрила (ACN), чтобыстеклянная трубка, крышка, и аккуратно перемешать, щелкая трубки, прежде чем дать постоять 10 мин. Убедитесь, что кусочки геля полностью покрыты растворителем. При необходимости, нажмите кусочки геля от стенки трубы и в растворителе с кончика пипетки.
  8. Внесите от ACN из стеклянной трубки и повторите шаги 1.5-1.7 до ярко-синий цвет не будет устранена. Повторите не менее пяти последовательных промываний AMBIC / ACN при необходимости. Для серебряных окрашенных гелей, использовать комплект destain. Переходите к следующему шагу, когда гель штука получается равномерно белым цветом, а в АКН.
  9. Внесите от любой жидкости из стеклянной трубки, резюмировать трубку, добавить 1 мл AMBIC и дать постоять 5 мин.
  10. Удалить AMBIC и добавить 2 мл этилацетата (EtOAc), чтобы стеклянной трубки. Резюме трубка с тефлоновым покрытием и крышкой месте при 4 ° С в течение ночи с конечным над уровнем конца перемешиванием или, альтернативно выполнить три EtOAc промывок при комнатной температуре в течение 30 минут каждый. Чем дольше стирки EtOAc, тем эффективнее удаление загрязняющих веществ.
  11. УдалятьОкончательный EtOAc мыть и выполнить три моет каждый с 2 мл H 2 O. Полное удаление EtOAc обеспечит надежную восстановительной реакции β-элиминации.
  12. Внесите от H 2 O и обезвоживают гель путем однократной промывки 1 мл ACN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После сушки обезвоженных гели готовы к в-гель β-элиминирования. Обезвоженные куски гель можно хранить при -20 ° С до использования.
  13. Остановка процесса стирки на любой стадии и хранить кусочки геля при температуре 4 ° С в течение ночи, независимо от того, какой буфер или раствор наносят на гель (AMBIC, ACN, H 2 O). Перезапуск пробоподготовки в любое время в течение следующих 2 дней.
  14. Используйте часть из обесцвечивали и обезвоженных кусочков геля для белка ID стандартными протеомическим подходов.

2. В-гель O-гликана выпуска восстановительным β-ликвидации

  1. Подготовка исходного раствора 1 М гидроксида натрия (NaOH) с использованием 50% NaOH или твердого NaOH и хранят при температуре 4 ° С до использования.
      Возьмем 5,2 мл 50% NaOH (или 4 г твердого NaOH) и регулировать громкость до 100 мл, чтобы сделать раствор 1 М NaOH. Развести 1 М NaOH исходного раствора до 100 мМ NaOH, который можно хранить при температуре 4 ° С в течение 6 месяцев без потери эффективности в восстановительных реакций β-элиминирования.
  • Сделайте 2 М натрийборгидрид (NaBH 4) в 100 мМ NaOH. Растворите 38 мг NaBH 4 в 0,5 мл 100 мМ NaOH. Как правило, используют 0,5-1,0 мл раствора борогидрида для каждого образца. Vary объем реакционного раствора на количество высушенных кусочков геля, полученного на стадии 1. Ожидать использовать 0,5 мл раствора боргидрида в течение 1-2 вырезанных частей геля (шаг 1,3).
  • Добавить 500 мкл 100 мМ NaOH в обезвоженных куски геля и дать настояться в течение 3-5 минут на льду, с тем чтобы уравновесить гель для основных условий, которые повышают гликана восстановление.
  • Добавить 500 мкл 2 М NaBH 4 в 100 мМ NaOH, в результате чего в конечной концентрации 1 М NaBH
  • В течение первого часа инкубации, осторожно перемешать трубу на каждые 15 мин. Избегать сильного перемешивания, потому что это может фрагментировать кусочки геля. Выполните реакцию в хорошо уравновешенном инкубатора / печи или в нагревательном блоке. Убедитесь, что кусочки геля покрыты реакционного раствора.
  • Остановка реакции путем удаления пробирки с образцом из инкубатора или нагревательный блок и размещение его на льду.
    Примечание: После того как реакция β-элиминирование провод т в течение 18 ч, процесс обессоливания должны быть выполнены в тот же день.

    • 3. обессоливания на катионообменной хроматографии

    1. Сохраняя пробирку на льду, чтобы предотвратить образование избыточного тепла, медленно добавить 10% по каплям уксусную кислоту (уксусной кислоты), чтобы нейтрализовать базу. Аккуратно вихрь пробирку между добавками уксусной кислоты. Будьте осторожны, чтобы добавить кислоту медленно и по каплям, как дополнительна кислоты будет производить "вулкан" пузырей. Центрифуга трубки, чтобы устранить пузырьки и предотвратить выплеск, если это необходимо.
      1. Для того чтобы удалить большое количество натрия в реакционной смеси, проходят реакционной смеси через небольшую колонку катионообменной смолой Dowex (или AG-50W-X8 смолы, Н + форма).
      2. Промыть катионообменную смолу с 1 М NaOH и 1 М HCl до использования с целью удаления загрязняющих веществ, которые мешают анализа MS, даже если смола аналитической чистоты.
      3. Замочите смолы в 1 М NaOH и удалить решение декантацией. Добавить деионизированной воды, удаления воды, затем добавьте 1 М HCl.
    2. Повторите эти действия, пока над смолы раствор не станет бесцветным. Промыть очищенный смолы с деионизированной водой и хранить в 5% уксусной кислоте при температуре 4 ° С.
    3. Чтобы сделать маленький стеклянный столбца, царапины и сломать кончик стеклянной пипетки Пастера с использованием керамического ножа так, чтобы конусность кончика пипетки примерно 1 см в длину, Дразните друг от друга вилку стекловаты и толкать к кончику, образующей опору для слоя смолы. Закрепите колонку пипетки с помощью зажима или прищепки и место над стеклянную пробирку.
    4. Промыть пустой пипетки с 1 мл метанола (MeOH) и 3 мл 5% AcOH. Вихревой Н + Dowex или AG50 катионообменной смолы суспензию хранили в 5% уксусной кислоты и передать достаточное количество суспензии для получения объема 1 мл кровать в столбце пипетки Пастера.
    5. Промойте колонку, используя пять томов 5% уксусной кислоты. Проверьте течь через появления частиц смолы и не использовать колонку, если смола обнаружен.
    6. Столбец Поместите над новой винт сверху стеклянной трубки (16 х 125 мм) и образца нагрузки. Сбор поток через гликанов и элюируют с по крайней мере 3 объемами 5% -ного раствора AcOH в одной и той же трубе.
    7. Накройте трубку с парафильмом и сделать крошечные отверстия с помощью иглы. Поместите пробирку при -80 ° С или на сухом льду. После того, как замороженный, сухой образец по лиофилизации. Хранить высушенный материал при -20 °С до использования.

    4. Борат удаления

    1. Подготовьте 10% уксусной кислоты в метаноле. Возьмем 10 мл ледяной уксусной кислоты и отрегулировать объем до 100 мл с помощью метанола. Храните этот реагент в стеклянной бутылке с тефлоновым покрытием крышки на срок до 6 месяцев.
    2. Добавить 300 мкл 10% -ного раствора AcOH в МеОН с высушенный лиофильной сушкой пробирку и вихря. Удаление полученного триметилбората выпариванием при N 2 потока.
      Примечание: Смешивание боратные соли с метанолом в кислой среде производит триметилбората, который представляет собой летучее соединение.
    3. Сухой под N 2 поток при 37 ° С. После сушки добавить другую аликвоту АсОН в МеОН, как описано в шаге 4.2. Сушат жидкость в течение 5 мин в атмосфере азота (N 2) поток при 37 ° С.
      1. Повторите ресуспендирование и сушки, по крайней мере в 3 раза. Хранить высушенного материала при температуре -20 ° С до использования.

    5. С 18 Очистка

    1. Равновесие столбец C18 картриджа(Размер 1 мл, 100 мг смолы) с использованием трех томов ACN и пять томов 5% уксусной кислоты. Ускорение прохождение уравновешивающим решений путем применения мягкого положительном давлении воздуха.
    2. Добавить 500 мкл 5% уксусной кислоты в обессоленной и боратном свободной пробирку и растворяют с помощью вихря.
    3. Загрузка ресуспендировали образец на уравновешенную колонку C18 и собирать поток через стекло в завинчивающейся крышкой пробирку (13 х 100 мм). Элюировать O-гликанов с 3 мл 5% -ного раствора AcOH в одной и той же трубе.
    4. Парафином трубку, чтобы маленькие отверстия с малым иглой или при помощи свободно закрытую тефлоновую картонных колпачок, чтобы покрыть трубу, и заморозить образца при -80 ° С или на сухом льду. Удаление растворителя лиофилизацией. Хранить высушенного образца при -20 ° С до использования.

    6. База Подготовка к Permethylation

    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения надежной permethylation, подготовить NaOH суспензии свежей. Все изделия из стекла используются для permethylation реакций следует широко чистить.

    1. Для приготовления основного реагента для permethylation, добавить 400 мкл 50% -ного NaOH к чистым стекла с завинчивающейся крышкой пробирку (13 х 100 мм). Добавить 800 мкл безводного МеОН и вихря.
    2. Добавить 4 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО) и вихря генерировать белый осадок.
    3. Центрифуга при 600 х г в течение 1 мин для осаждения осадка. Внесите от супернатанта и выбросить. Добавить еще 4 мл безводного ДМСО к осадку. Vortex.
    4. Повторите шаг 6.2 и 6.3, как минимум, еще три раза или до каких-либо белый осадок.
    5. Растворите гранулированный базу в 3 мл безводного ДМСО и аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз с чистой пипетки Пастера.
    6. Немедленно использовать базу для следующей реакции permethylation как это не могут быть сохранены.

    7. Permethylation выпускаемой гликаны

    1. Добавить 200 мкл безводного ДМСО в C18-очищенного образца и вихря или разрушать ультразвуком ресуспендировать.
    2. Добавить 300 мкл resuspсостава базы суспензия для образца и сразу добавить 100 мкл йодометана (МЭИ). Уплотнение трубки с тефлоновым покрытием крышки и энергично перемешать в течение 5 мин по вихря.
    3. Для остановки реакции permethylation, добавляют 2 мл 5% -ного раствора AcOH на льду и вихря. Пипетка раствор вверх и вниз в 5 раз снизить оставшийся объем ОЭП выпариванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: АсОН нейтрализует решение и удаление MeI повышает эффективность извлечения сульфатированных гликанах в водной фазе во время поэтапного раздела.
    4. Добавить 2 мл дихлорметана (DCM) и вихря. Центрифуга при 600 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы отделить водную и органическую фазы.
    5. Передача верхний слой (водный фазы, которая содержит большую часть перметилированных сульфатированных гликанов) в новую стеклянную трубку (13 х 100 мм).
    6. Добавить 2 мл H 2 O в органическую фазу и вихря. Центрифуга при 600 х г в течение 1 мин, чтобы отделить водную и органическую фазы и комбинировать этот второй водной фазы с пихтыул водную фазу (шаг 7,5).
    7. Повторите шаг 7,6 и 7,5 три раза больше, но нет никакой необходимости, чтобы сохранить водные фазы в результате последующих разделах.
    8. Удалить конечный верхний слой (водный фаза) в максимально возможной степени с нижним слоем (органической фазе) и передать нижний слой (органической фазе) в отдельную новой стеклянной трубки с помощью чистой пипетки Пастера.
    9. Органическую фазу сушат в атмосфере N2 потоке при 42 ° С.
    10. Накройте трубку с парафильмом и хранить при -20 ° С до использования.

    8. С18 Очистка от перметилированный сульфатного О-гликанов из водной фазы

    1. Равновесие колонку С18 картриджа с тремя объемами ACN и пяти объемами 5% -ного раствора AcOH.
    2. Загрузка Водные фазы собирали и объединяли с шагом 7,5 и 7,6 на колонку.
    3. Промыть колонку с 10 мл H 2 O для обессоливания.
    4. Элюирования перметилированный O-сульфатированный гликанов в новую стеклянную трубку с 2 мл50% ACN. Используйте дополнительный элюирование с 85% ACN, чтобы добавлять восстановление перметилированных сульфатированных уплотнительных гликанах на больших олигосахариды.
    5. Сухие элюаты в потоке азота при 42 ° С.
    6. Хранить высушенный материал при температуре -20 ° С до 6 месяцев до анализа MS.

    9. Масс-спектрометрия из перметилированных уплотнительных гликанах

    1. Анализ перметилированный O-гликанов от прямого вливания в соответствующий масс-спектрометре с использованием источника nanoelectrospray при скорости потока шприца 0,40-0,60 мкл / мин при 210 ° C температуре капиллярной. Для фрагментации по CID в MS / MS и MS п в ловушки инструмента ионов, применяется 30-40% энергии столкновения.
    2. Для режима отрицательных ионов, восстановить перметилированный сульфатированный О-гликанов в 50 мкл смеси метанол / 2-пропанол / 1-пропанола / 13 мМ водный ацетат аммония (16: 3: 3: 2 по объему). Для режиме положительных ионов, нейтральных воссоздать перметилированный / сиалилированы O-гликанов в 50 мкл 1 мМ натрий гидроXide в смеси метанол / вода (1: 1).
    3. Используйте общее отображение ионный (TIM) и нейтральный сканирования потери (NL сканирования) функциональность программного комплекса Xcalibur версии 2.0 для анализа MSN охарактеризовать отдельные O-гликана структур 13,19.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Влияние этилацетат лечения До В-гель восстановительным β-ликвидации

    Представитель масс-спектр перметилированных О-связанных гликановых образцов, освобожденных из шкур крупного рогатого скота муцина с использованием в геле восстановительное β-элиминирование показано на рисунке 3. EtOAc мыть гелевых штук эффективно удаляет SDS и полиакрил загрязнений, которые мешают последующего анализа MS 27.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Сочетание восстановительной β элиминации в геле с водно-органической экстракцией повышает чувствительность и глубину структурных данных, которые могут быть получены для характеристики сульфатированных и несульфатированных O-связанных гликанов, полученных из небольших количеств гликопротеинов муцинового типа, растворенных из других белков с помощью SDS-PAGE. К числу основных достижений технических подходов, представленных в настоящем исследовании, относятся: а) легкое удаление гелевых загрязнителей с помощью простых этапо...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Эта работа была поддержана грантом P01HL107151 от NHLBI/NIH. Авторы также выражают признательность за поддержку и доступ к инструментариям, предоставленным в рамках грантовой P41GM103490 от NIGMS/NIH.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Вода, деионизированная водаSigma-Aldrich 270733-4LCHROMASOLV, для ВЭЖХ
    уксусной кислоты, GlacialFisherA38-500Certified ACS ≥ 99,7% по маслу
    МетанолСигма-Олдрич 34860-4L-RCHROMASOLV, для ВЭЖХ, ≥ 99,9%
    Бикарбонат аммонияFluka09830-500GBioUltra, ≥ 99,5% (Т), Стадия 1
    АцетонитрилСигма-Олдрич 34998-4LCHROMASOLV Plus, для ВЭЖХ, ≥ 99,9%, Этап 1
    ЭтилацетатFluka34972-1L-RLC-MS CHROMASOLV, Этап 1
    Боргидрид натрияAldrich213462-25GReagentPlus, 99%, Шаг 2
    ЙодометанSigma-Aldrich 289566-100GРеагентПлюс, 99,5%,  Шаг 6.  Хранить при 4 °deg; C до использования.  Перед использованием составьте при комнатной температуре.
    Раствор гидроксида натрия, 50% с сертификатомFisherSS254-1, Ступень 6
    Диметилсульфоксид, безводныйSigma-Aldrich 276855-1лБезводный, ≥ 99,9%, Шаг 6
    Метанол, безводныйСигма-Олдрич322415-100MLБезводный, 99,8%, Шаг 6
    ДихлорметанСигма-Олдрич 34856-4LCHROMASOL®, для ВЭЖХ, ≥ 99,8%, содержит амилен в качестве стабилизатора, ступень 7
    Dowex 50WX8 форма водорода 100-200  сеткаSigma-Aldrich 217506-500GШаг 3
    AG 50W-X8 Смола Bio-Rad142-1441Step 3
    BAKERBOND spe 1 мл x 100 мг твердофазная экстракционная колонка, PP, октадецил (C18) обратная фазаJT BakerJT-7020-01Step 5 и 8
    7,5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Bio-RadStep 1
    Био-безопасная морилка для кумасси Bio-Rad161-0786G-250, Step 1
    Набор для окрашивания серебром для масс-спектрометрииPierce24600Step 1
    Набор олигосахаридов (мальтотриоза, dp3: R474140)Supelco 47265
    Набор олигосахаридов (мальтотетраоза, dp4: R474135)Supelco 47265
    Одноразовые пастеровские пипетки, стеклянные, с коротким наконечникомVWR14673-010Промыть перед использованием
    PYREX 13 x 100 мм Одноразовые трубки для культуры с круглым дном и резьбойCorning99447-13Промыть перед использованием
    PYREX 16 x 125 мм Одноразовые трубки для культуры с круглым дном и резьбойCorning99447-16Промыть перед использованием
    Фенольные колпачки/крышки с резиновой подкладкой из ПТФЭKimble45066C-13Вымыть перед использованием
    фенольные колпачки/крышки с резиновой подкладкой с покрытием из ПТФЭKimble45066C-15Вымыть перед использованием
    шприц Hamilton для ВЭЖХHAMILTON81265объем 500  μ л, размер иглы 22 г
    Hamilton шприц для ВЭЖХHAMILTON81165объем 250  μ л, размер иглы 22 г
    Hamilton шприц для ВЭЖХHAMILTON81065объем 100  μ л, размер иглы 22s G
    Hamilton шприц для ВЭЖХHAMILTON80965объем 50  μ л, размер иглы 22с G
    Калиброванные шприцы HamiltonHAMILTON80300объем 10  μ l, размер иглы 26s G
    Чашка Петри Стакан 100 мм x 15 ммGSC INTERNATIONAL INC1500-4Вымойте перед использованием, Шаг 1
    Хирургические лезвия Bard-ParkerFisher371310Шаг 1
    Reacti-Therm Модуль нагрева/перемешиванияПрокол18870Шаг 1, 4 и 7
    Нагревательные блокиFisher125DШаг 2
    Pyrex стекловата боросиликат размер пор 8  μ mAldrichCLS3950Step 3
    Резак из плавленого диоксида кремнияРезак для трубокalltech3194Step 3
    Многотрубные вихревые VWR444-7063Шаг 6
    Лиофилизатор 25EL FreezemobileVirtis25EL
    ЦентрифугаVWRClinical 50
    LTQ Orbitrap DiscoveryThermo Fisher Scientific

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    OSDS PAGEC18

    Похожие статьи