Сочетание Magnetic сортировка материнские клетки и колебания испытаний для анализа геномной нестабильности Во время митотического клеточного старения в Saccharomyces CEREVISIAE

Краткое содержание

Мутация ставки в молодые Saccharomyces CEREVISIAE клеток измеренных через флуктуации испытаний используются для прогнозирования частоты мутаций для материнских клетках различных репликативных возрастов. Магнитная сортировка и проточной цитометрии затем используются для измерения фактических частот мутаций и возраст материнских клеток для выявления любых отклонений от прогнозируемых частот мутаций.

Аннотация

Saccharomyces CEREVISIAE был превосходным модельной системой для изучения механизмов и последствий нестабильности генома. Информация, полученная из этого дрожжевого модели уместна для многих организмов, включая человека, так как репарации ДНК и реагирования повреждение ДНК факторы хорошо сохраняется в самых разнообразных видов. Тем не менее, С. CEREVISIAE еще не используется в полной мере решать, является ли скорость накопления мутаций изменения с увеличением репликативной (митотических) возраста в связи с техническими ограничениями. Например, измерения дрожжей репликативной продолжительности жизни через микроманипуляций привлечь очень маленькие популяции клеток, которые запрещают обнаружение редких мутаций. Генетические методы для обогащения материнских клеток в популяциях, вызывая гибель дочерних клеток были разработаны, но размеры населения по-прежнему ограничен частотой, с которой случайные мутации что подвергает риску системы отбора произойти. Текущий протокол использует преимущества магнитного Sortiнг поверхностных меченных дрожжи материнских клетках, чтобы получить достаточно большие популяции пожилая мать клетки количественно редкие мутации через фенотипических выборов. Мутация ставки, измеренные через флуктуации испытаний, и частоты мутаций устанавливаются сначала для молодых клеток и используется для прогнозирования частоты мутаций в материнских клетках различных репликативных возрастов. Частоты мутаций затем определяются для отсортированных материнских клеток, и возраст материнских клеток определяется с помощью проточной цитометрии при окрашивании флуоресцентным реагентом, который обнаруживает бутон шрамы, сформированные на их поверхности клеток во время деления клетки. Сравнение прогнозных частот мутаций в зависимости от количества клеточных делений в частотах экспериментально наблюдаемых для материнских клетках данного репликативного возрасте может определить, есть ли возрастные изменения в скорости накапливающихся мутаций. Вариации этого базового протокола предоставляют средства для изучения влияния изменений в конкретных генных функций иликонкретные экологические условия на накопления мутаций обратиться механизмы, лежащие нестабильность генома в ходе репликативного старения.

Введение

Микроорганизмы, такие как дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE, являются отличным примером для исследования частота мутаций, но эти модели не были полностью использованы для расследования накопление мутаций во время митотического старения клеток. Накопление мутаций в ядерном геноме была выдвинута гипотеза, внести свой ​​вклад в старение по в результате прогрессирующей потерей (или изменения) генов функций ^1. Возможность использования микробной системы для изучения механизмов и последствий накопления мутаций в процессе старения может значительно ускорить идентификацию генетических и экологических факторов, влияющих на этот процесс, потому что в легковесных генетических систем и легкость количественного редкие фенотипические изменения в микроорганизмов. Факторы репарации ДНК и белки реакции на повреждения ДНК хорошо сохраняется по разнообразным видам ^2, и фундаментальные сходства в организменном старения были определены для организмов, как разнообразны, как S. CEREVISIAEд млекопитающие ^3, что делает его, вероятно, что результаты, полученные при изучении в дрожжах будут иметь отношение к старению во многих организмов.

Исследования старения в S. CEREVISIAE использование двух стареющих моделей, которые измеряют хронологического старения или репликативной старение клеток. Хронологического старения характеризуется прогрессирующей потерей жизнеспособности популяций дрожжевых клеток, которые в не-деления государственной (неподвижной фазы) в связи с питательной истощения ^3. Хронологическое старение модель была использована, чтобы продемонстрировать, что мутации накапливаются с возрастом ^4, так как крупные клеточные популяции легко получить в этой модели для выполнения выбора фенотипических для мутантных клеток. В этом случае, появляется накопление мутаций под влиянием роста-сигнальных путей и окислительного стресса ^5, и каждый из этих факторов имеет отношение к пониманию старения в многоклеточных эукариот ^3. Репликативная модель старения использует асимметричную DIVISIна между S. CEREVISIAE мать и дочь клетки для исследования старения, которое происходит с последовательными клеточных поколений ^3. Дрожжи репликативная старение часто измеряется через микроманипуляций малых популяций матери и дочерних клеток, или совсем недавно, через видеомикроскопии малых популяций дрожжевых клеток в микрофлюидных устройств ^6,7. Ограниченные размеры населения делают эти подходы плохо подходит для исследования накопления мутаций во время митотического старения, если информация целого генома, полученного от отдельных клеток или генетические изменения очень высокой частоты измеряются ^8. Всего-секвенирование генома отдельных клеток обеспечивает существенные наборы данных для исследования накопления мутации, но фенотипические системы селекции имеют важное преимущество, обеспечивая средства измерения частота мутаций изучать механизмы, лежащие накопления мутаций. Исследования изучить мутации частоты и цены через фенотипических выборов в haploiд штаммы дрожжей во время репликативного старения еще не поступало.

Частота мутаций обычно измеряется с помощью флуктуационных испытания ^9. Значения частоты мутаций отражают общее число клеток, несущих мутацию в последовательности гена в популяции. Это включает в себя клетки, в которых происходят независимые мутации и любое потомство этих клеток, что просто наследуют уже существующие мутации. В отличие от этого, уровень мутаций, измеренные с помощью флуктуационных испытаний представляют число независимых мутаций, которые вновь возникают при каждом поколении клеток. Эти тесты обычно включают прививки много культур репликации при низких плотностях клеток, чтобы уменьшить вероятность добавления клетки с уже существующими мутаций в последовательности-мишени, выращивание культур почти до насыщения, и идентификации мутантных клеток ростом на селективной среде. Цифры из мутантных клеток, выявленных в повторных населения используются затем в одном из нескольких математических моделей для оценки количества Independent мутации, возникшие в процессе роста ^9. Сравнение число независимых мутаций, чтобы средний размер популяции обеспечивает измерение частоты мутаций. В S. CEREVISIAE, мутация частоты и цены часто измеряется с помощью URA3 и CAN1 гены, так как с потерей функции мутации в этих генах производят выбираемые фенотипы. Потеря функции URA3 оказывает клеток, устойчивых к 5-fluoroorotic кислоты (5-FOA), так как белок, кодируемый URA3 преобразует к 5-FOA в молекуле токсичного ^10. Потеря функции CAN1 позволяет клеткам, чтобы стать устойчивым к канаванин, токсичного аналога аргинин, так как белок, кодируемый CAN1 транспортирует аргинина и канаванин в клетки ^11.

Оба генетические и физические стратегии сортировки были успешно использованы для получения более крупных популяций S. CEREVISIAE материнские клетки для облегчения расследования репликативного старения. Генетические стратегии включают умные подходы, которые выбирают против выживания дочь клеток в популяции. Программа мать обогащение (МООС) включает бета-эстрадиол индукцию экспрессии рекомбиназы Cre только в дочерних клеток, что приводит к дочери конкретных нарушению двух важных генов, которые были спроектированы, чтобы содержать LoxP сайтов ^12. Штаммы MEP можно выращивать как правило, в отсутствие индуктора, но только мать клетки будут продолжать разделить после индукции, в то время как дочерние клетки будут задержать в М-фазе, как правило, в течение первого прохождения по клеточного цикла ^12. Хотя эта система не использовалась в широко изучать накопление мутаций во время старения, он был использован для изучения потерю гетерозиготности, относительно частой формой нестабильности генома в диплоидных дрожжевых штаммов, а также биохимические изменения в старение материнских клеток ^13,14. Аналогично, система дочь-разрядник включает дочь конкретных экспрессии S. cereviГен SIAE URA3 ^15. Штаммы дочери-разрядника нормально расти до тех пор, 5-FOA не будет добавлен к среде, после чего дочерние клетки, экспрессирующие URA3 умрет, в то время как материнские клетки продолжают расти ^15. Эти полезные системы для обогащения материнских клеток, но они зависят от поддержания функций генов, которые составляют систему отбора. Случайные мутации в одном или нескольких компонентов системы отбора может привести к дочерним клеткам, которые ускользают от выбора и пролиферируют в геометрической прогрессии. Во время развития штаммов MEP, соответствующие размеры населения были полны решимости избежать появления мутантных дочерних клеток, которые могли бы спастись выбор ^12. Однако этот предел численности населения ставит под угрозу обнаружение редких форм нестабильности генома в ходе репликативного старения. Это ограничение на численность населения может быть частично преодолена за счет использования диплоидных штаммов дрожжей с две копии каждого гена вклад в систему отбора, так как большинствомутации, вероятно, будет рецессивным ^12. Тем не менее, использование диплоидных штаммов ограничивает типы мутационных событий, которые могут быть легко обнаружены по сравнению с теми, которые могут быть легко обнаружены в гаплоидных дрожжевых клеток.

Физические стратегии сортировки включают выделение материнских клеток с меченым поверхности клетки от немеченых дочерних клеток для обогащения крупных популяций материнских клеток. Тот факт, что на поверхности клеток белков (протеины клеточной оболочки) из S. CEREVISIAE дочь клетки вновь синтезированный во время бутонизации эксплуатируется маркировать материнские клетки без маркировки дочерние клетки, которые они производят ^16. Например, начальная популяция дрожжевых клеток, меченных на их поверхности с биотином могут быть выращены и затем выделены из их дочерних клеток с использованием анти-биотин микрошарики и магнитной сортировки ^16, потому что дочерние клетки, полученные от начальной популяции не будет содержать биотин на их поверхности . Серийный рост исортировка позволяет постепенно старшего популяции материнских клеток, которые будут получены и проанализированы. Эта процедура успешно используется для изучения изменений в физиологии клетки и экспрессии генов в ходе репликативного старения дрожжей ^13,14,17,18. Текущий метод адаптируется этот биотин маркировку и методом магнитной сортировки для обогащения материнских клеток с целью измерения накопления потенциально редких мутаций или других форм нестабильности генома анализировали через фенотипических выборов. Серийный рост и физическое сортировка позволяют анализ накопления мутаций в постепенно старых материнских клеток, а также в их популяции дочерних клеток. Определение мутаций ставок на поколение позволяет предсказать частота мутаций рассчитываться для материнских клеток, которые подверглись определенное количество клеточных делений. Поскольку прогнозируемые значения частоты основаны на ожидаемом росте за счет дополнительных раундов деления клеток, существенных отклонений в наблюдаемых mutatiна частотах по сравнению с прогнозируемыми значениями предоставить доказательства для возрастных изменений в размере накапливающихся мутаций. Используя этот протокол, люминесцентные окрашивание почек шрамов, которые соответствуют сайтах клеточных делений на материнских клетках в сочетании с анализом методом проточной цитометрии могут быть использованы, чтобы быстро определить возрастное распределение отсортированных и неотсортированных населения. Дополнительные реактивы флуоресцентные, такие как те, которые используются для обнаружения активных форм кислорода, также могут быть использованы в течение этого протокола. В целом, этот протокол позволяет эффективно анализ возрастных изменений в нестабильности генома с потенциалом для корреляции с возрастными клеточных физиологических изменений в качестве модельного организма хорошо подходит для изучения генетических и экологических факторов, которые влияют, связанные со старением нестабильность генома.

Протокол

1 Подготовка СМИ и решения

1. Рост клеток с помощью дрожжевой экстракт-пептон-глюкозы (YPD) богатый среду для стандартного протокола. Приготовьте 2% бактопептон, 1% дрожжевого экстракта, 2% раствора глюкозы для YPD среде и добавить 2% бактоагар на твердом носителе ^19. Автоклав для стерилизации. Использование альтернативного среды, если это необходимо, для проверки конкретного состояния роста или мутантного штамма дрожжей.
2. Сделать твердую синтетическую среду полностью отсутствует аргинин 60 мг / л канаванин (SC-Arg + канаванин), чтобы выбрать для канаванин устойчивых мутантов. Приготовьте раствор, который 0,67% бактодрожжевого азотистого основания без аминокислот, 2% глюкозы, 0,2% полного дополнения смеси без аргинина (отсева смеси), и 2% бактоагар ^19. Автоклав и прохладный перед добавлением канаванин от 20 мг / мл исходного раствора (фильтр стерилизуют, хранили при 4 ° С) ^19.
   1. Сделайте прочную синтетическую полную среду, содержащую 5-fluoroorotic кислоту (5-ФА). Подготовьте 500мл раствора, что является 1,34% бактодрожжевого базу азота без аминокислот, 4% глюкозы, 0,4% полное дополнение смесь, и 0,2% 5-ФА и фильтр-стерилизовать ^19. Автоклав емкостью 500 мл 4% бактоагар раствора, круто кратко, а затем смешать с 500 мл стерилизованным фильтрацией питательного раствора. Используйте соответствующего альтернативного носителя для других мутаций анализов.
3. Для биотин маркировки, чтобы 500 мл 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), раствор, содержащий 137 мМ хлорида натрия, 2,7 мМ хлорида калия, 10,14 мМ двухосновного фосфата натрия и 1,77 мМ двухосновного фосфата калия, рН 8 Хранить при 4 ° С и продолжают лед во время использования.
4. Выполняет свежее 5 мМ биотин запас в стерильной, особо чистой воды.
5. Чтобы утолить биотин маркировку, сделать 500 мл 1x PBS, 100 мМ глицина. Хранить при 4 ° С и хранить на льду во время использования.
6. В зависимости от количества клеток, используемых и продолжительности эксперимента, сделать 1-2 л шарик-маркировки буфере, содержащем 1X PBS, 2 мМ ЭДТА, 0,5% BOVIпе сывороточный альбумин. Фильтр стерилизовать и буфер устранения газа. Хранить при 4 ° С и хранить на льду во время использования.
7. Приготовьте 0,4% трипанового синего решение в 1x PBS, фильтр стерилизовать, и хранить при комнатной температуре для использования в измерениях жизнеспособности клеток.
8. Алиготе небольшие объемы (~ 100 мкл) в агглютинина зародышей пшеницы (WGA) люминесцентные сопряженной хранить при температуре -20 ° С в фольге завернутые (или непрозрачных) микропробирок для использования при определении клеток возраст.

2 Определение мутаций курс и частоты

1. Установление исходного частоту мутаций на поколение клеток, используя флуктуации тесты для клеток, выращенных в обычных условиях культивирования. Grow семи до одиннадцати репликации 1 мл культуры с исходной плотностью 1,000-5,000 клеток / мл в ранней стационарной фазе (~ 10 ⁸ клеток / мл).
   1. Для каждой параллельной культуры, разбавленной клеток 1: 2000 и распространяются 1-4 мкл на неселективной среде (YPD), чтобы определить, колониеобразующих-единиц / мл. Пелле остальные клетки на ~ 2400 хг в течение 1 мин в микроцентрифуге и ресуспендируют в 100 мкл воды, чтобы распространить на селективной среде, чтобы определить мутантов. Планшеты инкубируют в течение трех дней при 30 ° С перед подсчета колоний (настройки времени инкубации при необходимости на основе скорости роста клеток).
   2. Определить количество независимых мутаций (м), имевших место в ходе судебного разбирательства на основании количества мутантных колоний (г), полученных на селективной среде. Используйте средний оценщик Lea-Коулсон найти м, подставив средний ряд мутантных колоний для г в формуле ниже ^9. Тогда подставим значения м до левая сторона уравнения не практически равен нулю.
      
   3. Чтобы определить частоту мутаций, сначала рассчитать среднее число жизнеспособных клеток высевали на селективной среде, умножая среднюю колониеобразующих-единиц / мл повторных культур и объемакультуры в мл наносили на селективной среде. Разделить м значение из шага 2.1.2 этого среднего числа жизнеспособных клеток, чтобы получить частоту мутаций на поколение клеток.
2. Индивидуально рассчитать количество жизнеспособных клеток высевали на селективную среду для каждой параллельной культуры в испытании, как описано в шаге 2.1.3. Разделить число мутантных колоний (г), полученных на культуре на количество жизнеспособных клеток высевали на селективной среде, чтобы получить частоту мутаций. Используйте средний или медиану из отдельных частот мутаций от повторных культур в шаге 2.1 в качестве базового частоты мутаций.
3. Сделайте измерения частоты до и после биотин маркировки клеток (шаги 3,2 и 3,4), чтобы определить, являются ли маркировка шаг приводит любом изменении частоты мутаций, которые должны быть рассмотрены при тестировании возрастных изменений в накопления мутаций.

3 Биотин Маркировка

1. Санкт-рубить С. CEREVISIAE из глицерина складе при -80 ° С на YPD среде и инкубируют при 30 ° С в течение 1-3 дней.
2. Используя стерильный наконечник пипетки, передача клетки от разводов пластины по 1 мл (или больше) воды имея в виду, что 1-1,5 см густо выросли части полосы даст примерно 10 ⁸ клеток. Определить точную плотность клеток с помощью гемоцитометра.
3. Этикетка 10 ⁸ клеток на деформации (или состояние обработки) в пункт приема, при котором частота мутаций будет определяться или численности населения, достаточной для получения по меньшей мере 5-10 мутантных колоний на проб на селективной среде (на основе частоты мутаций с шага 2,2). Включите дополнительные 10 ⁸ клеток для базовых измерений в деформации / состоянии.
4. Биотин этикетки согласно стандартной процедуре от производителя, за исключением использования 5 мМ биотин реагентов запас и осторожно встряхнуть во время инкубации. Вращение в течение 5 мин при 4 ° С при 3000 мкг в течение всех этапов центрифугирования, Sосле вращается при температурах, превышающих 4 ° С, может привести к увеличению потерь клеток. После последней промывки, приостановить клеток до концентрации 10 ⁸ меченых клеток / мл в воде.
5. Проверить жизнеспособность клеток с использованием окрашивания трипановым синим. Развести 10 мкл клеток с 23 мкл воды и 67 мкл 0,4% трипанового синего в 1X PBS. Выдержите в течение по крайней мере 40 минут при комнатной температуре до забил жить (неокрашенных) и мертвые (окрашенные) клетки с помощью гемоцитометра.
6. Измерьте базовые значения для нестабильности генома, клетки возраста, и других соответствующих характеристик (см разделы 5, 6, и 7).
7. Передача биотин-меченых клеток в 20 мл среды YPD на 10 ⁸ клеток в колбы Эрленмейера (примерно 5 × 10 ⁶ клеток / мл). Расти культуры (ы) 16-18 ч при 20 ° С к приближенному плотностью 10 ⁸ клеток / мл (4:56 клеток поколений), но не позволяют достичь клетки стационарной фазы. С помощью более короткого времени инкубации в течение роста при 30 ° С. Хранить меченного биотином Cлоктей при 4 ° С в течение до нескольких часов перед добавлением к среде, в случае необходимости, чтобы оптимизировать сроки периода роста и сбора.

4 из бисера Маркировка и магнитного Сортировка

1. После фазы роста, разбавленной аликвоты культуры, чтобы определить плотность клеток с помощью гемоцитометра. Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 4 ° С при 3000 х г в. Слейте супернатант.
2. Вымойте клеток путем встряхивания приостановить осадок в 30 мл шарик-маркировки буфера, затем центрифугирования и слива супернатанта как в разделе 4.1. Повторите промывку.
3. Полностью ресуспендируйте клеток в 50 мкл шарик-маркировки буфера на 10 ⁸ общего числа клеток путем встряхивания. Добавить 2 мкл магнитных шариков на 10 ⁸ общего числа клеток и вихря кратко перемешать. Выдержите на льду в течение 10 мин, переворачивая периодически смешивать (изменение в интернет-протокола в http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </>).
4. Вымойте клеток три раза 30 мл шарик-маркировки буфера.
5. Добавить 0,5 мл шарик-маркировки буфера на 10 ⁸ общего числа клеток и кратко вихревой осадок на средних настройках просто пока клетки повторно суспендируют. Налейте через сито 40 мкм клеток в 50 мл пробирку для удаления оставшихся скопления клеток. При необходимости оставить клеток на льду в течение 1-2 ч перед погрузкой на колонке.
6. Следуйте рекомендованный протокол производителя для магнитные колонки привязать, мыть, и вымывания магнитные бисера меченных материнские клетки. Для повышения восстановления меченых клеток, использовать хотя бы один столбец за 2 х 10 ⁹ общего числа клеток.
   1. Удалите все пузыри, которые происходят при загрузке колонны, как они будут блокировать поток. Снять и заменить столбец на разделителя между моет, чтобы предотвратить клетки от попадания в ловушку между шариками (модифицированных в интернет-протокола в http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
   2. Сохранить течь через от связывания и стиральных шагов для анализа молодые клетки, произведенные в материнских клетках, если это необходимо. Концентрат клеток, как описано на стадии 4.7.
   3. Используйте разделители нескольких столбцов для обработки нескольких образцов одновременно. Элюции несколько столбцов из того же образца в том же пробирку, чтобы сократить время обработки и снизить потерю клеток.
7. Концентрат элюировали материнских клеток центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Аспирируйте все, кроме 1 мл буфера на 10 ⁸ оригинальных биотина-меченых клеток. Кратко Vortex приостановить клетки в оставшихся буфер.
8. Развести аликвоту клеток и окрашиваются трипановым синим для определения плотности клеток и жизнеспособность клеток, используя гемоцитометра (см шаг 3,5). Рассчитать общее количество клеток, выделенных.
   1. Если количество клеток значительно выше, чем ожидалось, проход т через образец элюирования через другую колонку, чтобы попытаться удалить загрязнения молодые клетки.Если количество клеток значительно ниже, чем ожидалось, передавать сохраненную потока через образец через другую колонку, чтобы попытаться улучшить выход материнских клеток.
9. Использование клеток для дальнейшего анализа, как описано в разделах 5 и 6 Альтернативно, клетки растут в YPD бульона еще раз, чтобы увеличить их репликативной возраста (этап 3.7) и следовать по шарика маркировки и сортировки (шаги 4.1-4.8.1), без необходимо повторить биотин маркировку.

5 Определение репликативных возрасте

1. Спин клетки в течение 2 мин при 5000 мкг при комнатной температуре в течение всех шагов в этом разделе. Поместите 25 мкл восстановленных клеток (~ 10 ⁸ клеток / мл) в 1,5 мл центрифужную пробирку и дважды промывали 1 мл 1X PBS. Аспирируйте от супернатанта.
   1. Оттепель аликвоту WGA-сопряженных, вихрь смешивать, и кратко вращаться устранить белковые агрегаты. Приостановка клеток в 180 мкл 1х PBS и 20 мкл конъюгированных с WGA флуоресцентной молекулы маркировать бутон шрамы на поверхности гое клетки. Накройте 1,5 мл центрифужную пробирку с фольгой и инкубировать при осторожном встряхивании при 30 ° С в течение 30 мин.
   2. Промыть три раза 1 мл 1X PBS.
2. Для флуоресцентной микроскопии, горки этикеток и смонтировать за стандартному протоколу, используя анти-выцветанию агента. Полностью вылечить слайды в темноте (до нескольких дней) перед закрытием покровное, чтобы избежать движение клеток во время съемки. Количество BUD шрамы на по крайней мере, 50 клеток на образец, чтобы получить репрезентативное измерение клеток возраста. Храните горки для до 1 месяца для просмотра бутон шрамы, при необходимости.
   1. Кроме того, определяют интенсивность флуоресцентного сигнала от WGA-конъюгата, выполняя проточной цитометрии на клетки суспендируют в 1 мл 1X PBS после этапа 5.1.2. Используйте лазер 405 нм возбуждения и 530/30 нм фильтр излучения с 505 нм долго фильтр для WGA-Alexa 488. Включить безупречной контроль для каждой точки сбора.
3. График бутон шрамы на молодых клеток и в возрасте подсчитанных клеток с помощью микроскопа наY-ось по отношению к нормализованной геометрического среднего (среднее геометрическое окрашенных / неокрашенных среднее геометрическое) из WGA-сопряженного флуоресценции от тех же самых клеточных популяций на оси х. Получить уравнение линейной линии тренда для этих отношений. Для последующих экспериментов, заменить нормализованное среднее геометрическое WGA-сопряженной интенсивности флуоресценции клеточной популяции для х в уравнении и решить для у определить средний возраст клеток в образце.

6 Мутация Частота

1. Распространение сортируются материнских клеток ресуспендировали в буфере с шагом 4,7 на YPD среде и селективной среде, как описано в шаге 2.1.1. Используйте 1 мл ресуспендированных материнских клеток для селективной среде и спин клеток на 5000 мкг в течение 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Распространение большие объемы разбавленных клеток на YPD среды, клетки увеличиваются в возрасте, чтобы компенсировать большее число нежизнеспособных и стареющих клеток в пожилого населения.
   1. Выдержите YPD среды и селективные пластины среды отшаг 6,1 при 30 ° С в течение 3 дней и 4, соответственно. Увеличение инкубационный времени до одной недели для очень старых клеток или медленно растущих штаммов. Расчет частоты мутаций, как описано на стадии 2.2.

7 Расчет Прогнозируемая частоты мутаций для данного репликативных возрасте

1. Вычислить среднее увеличение репликативной возрасте биотин-меченых клеток в течение эксперимента путем вычитания среднего возраста начальной популяции клеток от среднего возраста, отсортированных материнских клеток для соответствующего вида. Используйте клеточные возраст, рассчитанные на шаге 5.2 или шаг 5.2.2.
2. Умножить частоту мутаций, полученного на стадии 2.1.3 увеличением среднего возраста клеток, рассчитанного на шаге 7.1. Добавить это значение с базовым частоты мутаций для исходной популяции, рассчитанного на этапе 2.2, чтобы определить прогнозируемую частоту мутаций для клеток соответствующего репликативного возраста.

Результаты

Схема на рисунке 1 показаны общие этапы процедуры, в том числе точек, в которых мутации ставки, частоты и сотовый возраст измеряются. Точного определения частоты и скорости мутаций (или другой формы нестабильности генома) в молодых клеточных популяций является важным первым шагом, так как это необходимо для выбора подходящего размера популяции для маркировки и магнитного сортировки. Значения Оцените можно установить с помощью флуктуационных испытания ^9. Пример результатов для дрожжевых штаммов, в BY4741 генетического фона ^20, выбранного для мутаций в гене CAN1, которые придают устойчивость канаванин или мутации в гене URA3, которые придают устойчивость к 5-FOA, показаны на рисунке 2. Клетки выращивали при 20 ° С в течение представитель Эксперименты скорости, и при 20 ° С и 30 ° С для репрезентативных экспериментов частот. Эти температуры были использованы, потому что начальные клеточные популяции выроспри 30 ° С, затем выращивали при 20 ° С в течение последующих представительных экспериментов сортировке. Оцените значения за независимых испытаний были сопоставимы для исходной популяции клеток и клеток после биотин маркировки для штамма, который имеет ген CAN1 в его нормальном положении на хромосоме V, примерно 32 тысяч пар из левой руки теломер ( www.yeastgenome.com ) ( 2А, колонны лаванды). Скорость мутация CAN1 был значительно выше в начальных популяций второго штамма дрожжей, который имеет делецию гена CAN1 от его обычного расположения на хромосоме V и вставку CAN1 на правой плече хромосомы VIII около 25 тысяч пар от теломер ²¹ (Рисунок 2B). CAN1 мутация гена частоты были также сопоставимы для начальных клеточных популяций и биотина меченых клеток в любом температуры роста (Fiфигура 2А, синие столбцы). Тем не менее, частоты мутаций получены при 20 ° С, оказались выше, чем мутации частот при 30 ° С. Чтобы проверить, был ли этот температурный эффект ограничивается гена CAN1, мы измерили мутации в URA3 выбрав на устойчивость к 5-FOA с использованием штамма дрожжей, который имеет CAN1 вставлен на хромосоме VIII. Этот штамм также имеет удаление URA3 от его нормального сайта на хромосоме V и вставку URA3 на правую плече хромосомы VIII около 40 тысяч пар от теломер ^21. Частоты мутаций также были выше при 20 ° С в течение URA3 в этом месте хромосомной (фиг.2С). В целом, это показывает, что температура роста может повлиять на частоту мутаций, но биотин маркировка, кажется, не влияют частоты мутаций. Поэтому мутация скорости и частоты для начальных населения должны быть определены в то же Темпе ростаратура, который будет использоваться для матчей одного роста и сортировки. Желательно, чтобы проверить, что биотин маркировку не влияет нестабильность генома перед использованием протокола исследовать другие типы мутаций или перестроек генома.

Как и ожидалось, величины частоты мутаций показано на фиг.2А несколько раз ниже, чем соответствующие измерения частоты. Это различие возникает потому, что частота мутаций измеряет появление клеток с новых мутаций с каждого раунда деления клеток, в то время как частота мутаций мер общее число мутантных клеток в популяции в конце периода роста. Темпы и 95% доверительные интервалы для этих испытаний показывают, что воспроизводимые результаты могут быть получены с помощью семи дублирующие культур на суде, что является минимальное количество повторов предложил для этого протокола.

После того, как начальные частоты и скорости значения определяются, численность населения должна быть чосень, что гарантирует, что адекватные клетки присутствуют после нескольких раундов сортировки достоверно определить частоты мутаций. Маркировка с населением 10 ⁸ клеток на момент времени, который должен быть проанализирован в процессе старения уместно, когда частоты и цены аналогичны тем, которые показаны на рисунке 2А. Это решение также зависит от того, насколько эффективно помечены мать клетки восстанавливаются после каждого раунда сортировки. Эффективность восстановления меченых материнских клеток может быть быстро и просто оценивали с помощью гемоцитометра, чтобы определить количество клеток, элюированных из колонок для каждого сорта и изучить морфологию клеток. Две основные точки иллюстрируется данными эффективность пример восстановления (Рисунок 3А): восстановленные номера ячеек могут появиться выше, чем ожидалось после первого рода, и небольшой прогрессирующая потеря клеток, как ожидается, с продолжающимся сортировки. Выше, чем ожидалось Количество ячеек в некоторых экспериментах после первого рода мог разрешениемии от маркировки почек на клетках в исходной популяции. Дрожжевых клеток с бутоном, как правило, забито, как одной клетки при определении количества клеток, чтобы этикетка с биотин. Маркировка почек, присутствующих в исходной популяции, тем не менее, позволит клетки, которые развиваются от этих рецепторов также быть сохранены на колонках при сортировке. Влияние этого явления на определения эффективности восстановления зависит от доли расцветший клеток в исходной популяции клеток. Второй потенциальный причиной более высокой числа клеток после рода является то, что там, как правило, более крупные расцветший клетки в этот момент времени, что может быть завершающей деление клеток во время сортировки. В результате крупные почки все еще прикрепленные к их материнских клеток могут быть отсортированы, но затем отображаются в виде отдельных клеток, когда элюированные клетки исследовали. В то время как некоторые потери клеток наблюдается при каждом раунде роста и сортировки, протокол может привести к надежного удержания 80-90% клеток после каждого цикла сOrting. Это стоит того, чтобы практиковать процедуру для того, чтобы 80% или более из меченых клеток в настоящее время изолированы, чтобы избежать необходимости маркировать излишне большое начальное клеточной популяции. Обработка клеток мягким стресса после первого рода (1 мМ перекиси водорода в YPD среды в течение 30 мин) не помешало эффективное восстановление клеток с продолжение раундов роста и сортировки, хотя были некоторые изменения в процессе восстановления для первого сорта после стресс (3А).

Инспекция морфологии и жизнеспособности клеток также полезны как для подтверждающие успешное выделение материнских клеток и для регулировки разведения / объемы, используемые при распространении клеток на не-селективной среде, чтобы определить плотность колониеобразующих единиц. Родные клетки становятся все более крупные и более неправильной формы, поскольку они стареют, по сравнению с дочерними клетками (Рисунок 3В). Поэтому Образцы мать клеток должны в первую очередь состоят из большого, IRRegularly формы клеток, как эксперимент проходит через каждого раунда сортировки. Наличие множества мелких овальных клеток правильной формы может означать, что материнские клетки, не находят адекватного отделена от дочерних клеток. Жизнеспособность материнских клеток также должны постепенно снижаться с каждым раундом растет и сортировки, хотя там не может быть много изменений в течение первых 9:55 клеточных поколений. Число клеток, способных к образованию колоний может уменьшить значительно более резко, чем количество клеток, которые определяются, чтобы быть жизнеспособными той или иной форме прямого окрашивания для целостности клеток, за счет образования стареющие клетки. Когда жизнеспособность прямым методом окрашивания первый начинает снижаться (около 80% или меньше), это может быть необходимо для регулировки разведения и объемы, используемые для измерения колониеобразующих плотности единицы в расчете на более резкому снижению в способности жизнеспособных клеток к образуют колонии (от двух до нескольких снижению раза).

репликативные возраст отсортированных населения и населения управления должны быть определены до частоты мутаций данные материнские клетки могут быть проанализированы для возрастных изменений в размере накапливающихся мутаций. Это может быть достигнуто с помощью ручного подсчета почек шрамов на материнских клетках (рисунок 4) или через проточной цитометрии для количественной оценки сигнала для реагента обнаружения бутон рубцовой (рисунок 5). Bud шрамы могут быть помечены с относительно низким фоновый сигнал с помощью WGA-флуоресцентный конъюгатов (Рисунок 4C). 4А показывает, что большинство клеток из потока через образцов сортировки процедуры есть ноль или один бутон шрам. Клетки, элюированные из колонок, в основном в возрасте от материнские клетки (Рисунки 4B и 5). Как правило,> 90% элюируемых клеток материнские клетки, которые могут быть замечены более легко с проточной цитометрии результате на рисунке 5. Клетки с относительно небольшим количеством почек шрамов (<6) ОБТained после более чем двух раундов сортировки может представлять загрязняющих клетки, которые не были биотин меченых что прошли несколько раундов деления клеток в течение соответствующего витка роста, в отличие от материнских клеток которые делятся очень медленно. Изменение клеточного возраста может увеличить с последующих раундах сортировки, если не все клетки в популяции растут равномерно.

Больший популяция клеток может быть использована более быстро, чтобы оценить клеточный возраст, если линейная зависимость установлена ​​между интенсивностью сигнала флуоресценции WGA-и количества почек рубцов на клетку. Для этого анализа, нормализация всех интенсивностей сигналов WGA-флуоресценции осуществляется путем деления сигнала окрашенных клеток по сигналу, полученному для соответствующего незапятнанной клеточной популяции (дочь или мать), чтобы учесть повышенной фоновой флуоресценции в старых клетках. Рисунки 4 и 5 показывают, анализ тех же популяций клеток представительных.Ручная счетная создана средние репликативные возраст 0,95 и 11,4 для дочерней клетки (рис 4а) и населения мать клеток (Рисунок 4б), соответственно. Нормализованные WGA-сигналы для этих двух групп населения и трех дополнительных групп населения (средний возраст 3,0, 6,9, 14,4 и) в виде зависимости от среднего количества почек шрамов для каждой популяции (фиг.5В). Это линейное соотношение, то могут быть использованы с тем же штаммом и реагентов в будущих экспериментов, чтобы определить средний возраст клеток от нормированной WGA-сигнала, полученного с помощью проточной цитометрии, что позволяет быстрое и точное определение возраста клеток. Население управления должно впоследствии быть включено для проверки подобные эффективность окрашивания между испытаний.

Влияние возраста на накопление мутаций может быть решена, как только предыдущие этапы получения значения частоты мутаций, эффективно сортировке клеток, клеток и определение возрасте выполняются. НюMBER моментов времени, при котором частота может быть определена в зависимости от размера меченного биотином клеточной популяции и количества клеток, которые должны быть распространены на селективной среде, чтобы получить достоверные результаты. Если изменения частоты мутаций с возрастом, то наблюдаемые частоты мутаций для пожилая мать клетки должны отличаться от тех, которые ожидаются исключительно на основе дополнительных раундов деления клеток. Сравнение наблюдаемого частоты мутаций в прогнозируемой частоты мутаций может определить возрастные различия в размере, накапливающихся мутаций. Как описано в разделе 7 протокола, предсказанное частота может быть получен из продукта базовой частоты мутаций для начальной популяции клеток и увеличение репликативной возрасте от материнских клеток, добавленных к частоты мутаций в начальной популяции. Увеличение CAN1 частоты мутаций наблюдались с увеличением возраста средняя клеток в штамме с CAN1 в его нормальном положении на хромосоме V(6А), и в штамме с CAN1 на правом плече хромосомы VIII (фиг.6В). Поскольку наблюдаемые частоты мутаций для материнских клеток в фиг.6А аналогичны или чуть ниже прогнозируемых частот, данные не представил никаких доказательств для изменения возрастного в скорости мутаций. В отличие от этого, мутации частоты для материнских клетках штамма с CAN1 на хромосоме VIII были выше, чем прогнозируемые частот (Рисунок 6b). Следует отметить, что предсказанные частоты в графе-видимому, не очень сильно увеличить, так как логарифмическая шкала должна была быть использована для оси у в связи с большим увеличением наблюдаемой частоты мутаций. Таким образом, результаты в фиг.6В действительно обеспечивают доказательства, подтверждающие увеличение повозрастную в размере накапливающихся мутаций. Разница в результатах для наборов данных в рисунке 6A и 6B, вероятно в связи с ра арендовать геномных местоположения CAN1. Эти типы наблюдений в качестве отправной точки для разработки гипотезы для изучения механизмов, которые влияют мутации ставки как клетки возраста и разработать модели, чтобы объяснить накопление мутаций с репликативной возраста.

Рис.1 Структурная схема общей процедуры для изучения накопления мутаций во дрожжей репликативного старения. Черный текст и стрелки указывают основные этапы процедуры. Изогнутая стрелка отражает, что дополнительные раунды повторного роста и сортировки одних и тех же клеток используются для получения постепенно старые клетки. Фиолетовый стрелки и текст указывают шаги, при которых указанные измерения. Частота - частота.

загрузить / 51850 / 51850fig2highres.jpg "ширина =" 400 "/>
Рисунок 2. Определение частоты мутаций и скорости в молодых клеточных популяций. (A) Mutant колонии были отобраны путем распространения клеток на SC-Arg + канаванин среды, чтобы выбрать для с потерей функции мутаций в гене CAN1 и по сравнению с общим количеством жизнеспособных клеток распространяются на селективной среде для расчета частоты / цены. Клетки из исходных популяций до биотин маркировки (IP) или после того, как биотин маркировки (PB) были выращены с помощью YPD среде с исходной плотностью 5000 клеток / мл в вблизи насыщения. Столбцы Лаванда указывают измерения скорости и синие столбцы представляют измерения частоты, сделанные на указанных температурах (20 ° С и 30 ° С). Наборы семи повторных культур выращивали в течение каждого испытания и были выполнены 4:58 независимых испытаний. Значения Индивидуальные ставки, рассчитанные для независимых испытаний показаны, и планки погрешностей для этих испытаний представляют 95% доверительные интервалы определенияD с помощью онлайн-калькулятор ^22. Частоты представляют средние и стандартные отклонения. Цену (B) CAN1 мутации получены и представлены, как описано для части A с помощью штамма, CAN1 на правом плече хромосомы VIII. (C) Частота мутаций, полученных следующие отбора мутантных колоний на 5-FOA помощью штамм с геном URA3, расположенный на правой плече хромосомы VIII. Методы были иначе как для части А, и средства и стандартные отклонения для трех или четырех независимых испытаний показаны.

Рис.3 Пример сортировки эффективность определяется путем расчета количества элюируемых клеток после каждого раунда сортировки. (A) Общее количество клеток в каждой стартовой населения после биотин маркировки была установлена ​​в одном, и т г о количество клеток, присутствующих в элюированных образцов из каждого раунда магнитного сортировки клеток был разделен на этих начальных значений, чтобы получить фракцию меченых клеток. Всего количество клеток определяли из подсчитанных клеток, полученных с помощью гемоцитометра. Оранжевые столбцы представляют собой среднее значение и стандартное отклонение для трех независимых испытаний в соответствии со стандартным протоколом. Синие столбцы представляют собой среднее значение и стандартное отклонение для двух независимых испытаний, в которых клетки обрабатывали 1 мМ перекиси водорода в течение 30 мин сразу после первого рода. (B) Размер и морфология клеток после биотин маркировки (пост-биотин) и материнских клеток восстановился после третьего раунда магнитного сортировки (сортировки 3 материнские клетки), показанной с использованием стандартного светлого поля микроскопии и цели 20X. Белые линии в происхождении являются линии, которые связали мельчайшие квадратики видимые на стандартном гемоцитометре.К "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4 Определение репликативного возраста с использованием ручного подсчета бутон рубцовой. Конфокальной микроскопии рассчитывать Bud шрамы на отдельных клеток, помеченных с WGA-флуоресцентного конъюгата (возбуждение при 488 нм и обнаружения с полосой пропускания 458/543 нм и 505 нм Длинный пас комбинированный фильтр). () Руководство бутон шрам подсчеты клеток из потока через (дочерних клеток) после завершения третьего раунда магнитного сортировки (п = 62). (B) Руководство бутон шрам на счету вымываемого клеток (материнские клетки) после Третий раунд магнитного сортировки (п = 54). (C) Родные клетки сохраняются после завершения третьего раунда магнитного сортировки сфотографировали с помощью 63x масло иммерсионный объектив с 3-кратным зумом после окрашивания остроумиеха-WGA-флуоресцентный сопряжены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5 Определение репликативной возраста с помощью проточной цитометрии. Образцы 10000 клеток, окрашенных с WGA-флуоресцентного конъюгата анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием возбуждения при 488 нм и детекции с проходом 530/30 и 505 группы длинного набора частот фильтра. ( ) Гистограммы, изображающие количество клеток с определенными интенсивностями WGA-флуоресценции для дочери клеточной популяции или элюата (материнские клетки) после трех раундов магнитного сортировки. Популяции соответствуют проанализированы на рисунке 4. Синие вертикальные линии показывают соответствующее положение для большинства Дауghter клетки на гистограмме мать клеток. (B) нормализуется среднее геометрическое для сигнала флуоресценции каждой популяции, показанном на А и трех дополнительных популяции клеток (средний возраст 3,0, 6,9, и 14,4) была рассчитана как отношение среднего геометрического окрашенные клетки и среднее геометрическое соответствующей незапятнанной клеточной популяции. Эти значения приведены в сравнении с средним числом почек шрамов для каждой общей численности населения (фиг.4 и данные не показаны). Значение R ² для линии тренда этого сравнения дается на графике.

Рисунок 6 Сравнение прогнозных и наблюдаемых частот мутаций во репликативного старения. Клетки с мутациями в гене CAN1 были выбраны, как описано для Рисунок 2 Usinштаммы г с CAN1 в его нормальном положении на хромосоме V (А) или на правой плече хромосомы VIII (B). Клетки выращивали на твердой среде при 30 ° С до биотин маркировки и при 20 ° С после этого. Наблюдаемые значения частоты показаны с оранжевыми колоннами (OBS) и прогнозируемых частот для стареющих клеток показаны с коричневыми колоннами (PRE). В первой колонке для каждого графика показывает среднее и стандартное отклонение начальной частоты мутаций после биотин маркировки для четырех независимых испытаний (Pb). Числа ниже столбцов указывают среднее число почек шрамов для каждой группы населения в возрасте (Cell). Независимые прогнозируемые значения были определены, как описано в разделе 7 протокола с использованием каждого из начальных значений скорости, показанных на рисунке 2А (столбцы IP) и 2В. Эти независимые значения затем были усреднены. Наблюдаемые значения средством трех испытаний. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение.

Обсуждение

Этот протокол объединяет несколько методов для того, чтобы ресурсы и подходы доступны в Saccharomyces CEREVISIAE модель системы, которые будут эффективно применяться для изучения нестабильности генома во время митотического клеточного старения. Широкий спектр анализов для количественного различные формы нестабильности генома через фенотипической селекции могут быть объединены с магнитной сортировки изучить возможные изменения повозрастные в накопления тех или иных форм мутаций или хромосомных перестроек. В то время как вся-секвенирования генома подходы могут предоставить больше информации о общих типов изменений, происходящих в геноме с возрастом, способность использовать фенотипические системы отбора для получения измерения скорости мутации и преимущественно изолировать определенные типы генетических изменений являются важными преимуществами для изучения механистический аспекты, связанные со старением нестабильности генома. Упорядочение определение клеточной возраста и потенциал, чтобы сделать параллельные измерения physiologiческие изменения через проточной цитометрии обеспечить эффективные средства коррелируют нестабильность генома с другими клеточными изменениями во конкретных возрастных. Определение потенциальных возрастных изменений в темпах накопления мутаций требуется: 1) осторожны определение ставок в молодых клеточных популяций, 2) точное определение клеточной возраста, и 3) способность надежно обогатить достаточно большие популяции материнских клеток воспроизводимо измерять нестабильность генома в старости. Такой подход позволяет дрожжи модель системы внести свой вклад в определение основных механизмов, ответственных за возрастных изменений в ставок и / или частот нестабильности генома в митотически активных клеток. Кроме того, генетические и экологические факторы могут быть быстро оценил за вклад в возраст-зависимой нестабильности генома. В конечном счете, эти характеристики могут привести к разработке моделей, на которые приходится образом, мутации в которых накапливаются во репликативного старения.

Этот способ зависит от способности для обнаружения мутации или другие типы нестабильности генома через внешний вид выбираемых фенотипов для измерения скорости таких событий. Тем не менее, творчество в дизайне анализа может разрешить многие аспекты нестабильности генома быть исследованы. Например, URA3 и CAN1 гены могут быть размещены на различных сайтах генома, чтобы проверить любые влияния геномной месте на результатах. Возврат конкретных нефункциональных аллелей генов в функциональных аллелей генов может проверить конкретные мутационные процессы. Кроме того, введение нескольких неактивных аллелей гена или фланговые ген с повторяющихся последовательностей может быть использован для изучения событий рекомбинации посредством восстановления или потери функции гена, соответственно. Флуктуационные тесты стандартный подход для определения цены этих различных мероприятий нестабильности генома ^9. Протокол написан с использованием хорошо принята и относительно простой Lea-Коулсон средний оценщик для определения МутаСкорость ния, чтобы сделать его более доступным для различных исследователей, несмотря на то, MSS-метод максимального правдоподобия считается лучшим подходом для определения мутации ставки ^9. MSS-оценка максимального правдоподобия была ранее подробно рассмотрены ^9, и может быть использован в качестве альтернативного метода, но требует более сложных вычислений. Кроме того, бесплатное программное обеспечение для расчета частота мутаций с помощью этого метода был предоставлен ^22. Получение воспроизводимых меры частоты мутаций требуется внимание на несколько аспектов эксперимента, в том числе с использованием достаточных культур дублирующие, прививки культур при малых плотностях достаточно начальных клеток, что численность населения увеличивается на 10 000 раз и более, и выбора соответствующих объемов культуры так, чтобы вся популяция клеток может быть распространен на селективной среде. Для последней точки, описанные выше формулу можно использовать, чтобы настроить частоту мутаций на основе фракции культуры Testeд ^9. Изменение темпов роста культур может усложнить определение воспроизводимым частоты мутаций, и модифицированной срединной основе оценщик, которые могут дать более воспроизводимые результаты в таких ситуациях был недавно описанных ^23.

Возможность точного измерения клеток возраст является еще одним фактором, который важен для установления того, отличаются от ожидаемых значений частоты нестабильности генома в старых клеток за счет скорости событий в молодых клеток. Мы обнаружили, окрашивание WGA, чтобы быть предпочтительным, чтобы Calcofluor белого окрашивания, как с точки зрения фона и гибкость, так как WGA доступен конъюгированного с различными флуоресцентными молекулами. Такая гибкость может обеспечить больше возможностей для одновременного измерения других характеристик клеточных с люминесцентными реагентами. Первоначальная работа, чтобы установить отношения между интенсивностью сигнала для окрашивания WGA и соответствующего количества почек шрамы на клетки затем может привести к болеебыстрое определение возраста клеток с помощью проточной цитометрии. Этот подход также позволяет использовать более крупные размеры популяций, чем будет обычно рассматриваются микроскопии для повышения воспроизводимости измерений. В то время как все определения возраста могут быть сделаны через микроскопическое исследование клеток, мы чувствуем, что поток цитометрии подход способствует быстрому скрининг факторов, влияющих возрастного нестабильность генома.

В дополнение к измерительной ячейкой возраст надежно, внимание должно быть уделено числа клеточных делений материнские клетки разрешено пройти с каждым последующим раундом растет и сортировки клеток. Использование меньшего исходного размера популяции или большего объема культуры клеток может позволить пройти несколько клеточных делений прежде, чем достигнуть желаемой плотности клеток. Например, другие исследователи использовали только два раунда сортировки получить очень старые дрожжевые клетки ^16, которая имеет очевидное преимущество получения старые клетки с меньшим experimental шаги. При рассмотрении вопроса, чтобы увеличить громкость культуры, чтобы клетки для завершения больше деления клеток до сортировки, имейте в виду лимит на общее количество клеток, которые могут быть обработаны в одном столбце. Используйте большего объема культуры может потребовать использования нескольких столбцов для сортировки одну популяцию клеток. Кроме того, если клетки подвергаются меньшее количество раундов клеточного деления между точками виды / сбора, то есть больше возможностей для наблюдения отклонения от ожидаемых частот мутаций в различных временных точках в течение жизни. Например, отбор проб только на ранние и поздние моменты времени в течение срока службы может привести данные, указывающие на устойчивый рост частоты мутаций, но отбор проб на дополнительных промежуточных раз в течение срока службы может показать, что частота мутаций увеличивается быстро, а затем плато. Однако, поскольку этот протокол изолирует старые материнские клетки, есть возможность получить более прямой меру изменений в мутации ставок с возрастом. Флуктуационные тесты можно было бе осуществляется с использованием материнских клетках разных возрастов, чтобы определить, будет ли частота мутаций отличается от курса, полученного с помощью молодых клеток. В то время как культуры для этих флуктуаций испытаний станет смеси старых и молодых клеток, как они растут, любые отклонения от ставок, полученных начиная с молодых клеток может быть связано с использованием старой отправной населения.

Возможность воспроизводимо получать достаточно большое население в возрасте материнских клеток, чтобы точно измерить нестабильность генома имеет решающее значение для успеха этого подхода. Хотя протокол описывает использование конкретной магнитной системы сортировки для этой цели, другие группы сортируются материнские клетки дрожжей с альтернативными системами ^14,18 (см таблицу материалов). Такие альтернативные системы также должны работать с этим методом, хотя может потребоваться некоторое оптимизация протоколов производителей. Независимо от конкретной используемой системы, размер популяции требуютD различается в зависимости от частоты типа мутации генома или перегруппировки, выбранного для исследования. Как минимум, должна быть достаточно материнские клетки для получения по меньшей мере, один мутантный колонию каждого населения для вычисления частоты мутаций. На практике, результаты могут быть весьма переменная, если только от нуля до пяти мутантные колонии ожидать от численности населения, и даже небольшое увеличение численности населения, так что 9:55 мутантные колонии, как ожидается, может значительно улучшить воспроизводимость. Когда биотин маркировки стартовый населения, эффективность восстановления для каждого сорта должны быть приняты во внимание, чтобы помочь определить соответствующий размер популяции, необходимую для измерения частоты мутаций в старых материнских клеток. С 90% восстановления материнских клеток после каждого рода, только 59% от первоначального населения будут возмещены после пяти туров роста и сортировки. Это падает до ~ 33% восстановление исходной популяции после пяти туров роста и сортировки, если только 80% меченых материнских клеток восстановитьред в течение каждого рода. Измерение и максимальной рекуперации имеет решающее значение при измерении низкие события частоты, так как 2:58 кратное снижение численности населения может легко привести к непредсказуемым числом мутантных колоний в популяции.

Существуют многочисленные возможности для расширения или изменения этого протокола для получения более глубокого понимания нестабильности генома во время митотического клеточного старения. Простые примеры включают анализа того, как изменения в генных функций, изменения средств массовой информации, или других изменений состояния окружающей среды изменить накопление мутаций с возрастом. Мутация ставки для молодых клеток с измененной генной функции или в надлежащем состоянии будет измеряться и используется для определения того накапливаются мутации по-разному, чем предсказывали значений скорости и по-другому, чем в контрольной популяции клеток. Клеточные популяции в различных точках в течение репликативного старения может подвергаться воздействию определенных факторов стресса, таких как активных форм кислорода или повреждающих ДНК агентов.переходных и мягкий контакт с окислительным стрессом существенно не изменяют способность выполнять сортировки клеток (рисунок 3), но более жесткие напряжения может осложнить восстановление клеток. Предварительные эксперименты необходимо будет убедиться, что материнские клетки могут быть восстановлены эффективно после конкретных напряжений. Кроме того, клеточные характеристики отдельных материнских клеток могут быть проанализированы в деталях, в том числе уровней активных форм кислорода, митохондрии и вакуоли морфологии и других физиологических особенностей, связанных со старением ^3. Кроме того, материнские клетки может быть началом населения для дальнейшего лечения или манипуляций. Поскольку мать и дочь клетки физически отделены во время процедуры, дочерние клетки также по-прежнему доступны для анализа. Например, изменения в физиологических особенностей дочерних клеток или асимметричной наследования поврежденных макромолекул между дрожжевой матери и дочерних клеток 24 можно сравнить с сроках любых интересных изменений в мутации частот / скоростей. Частота мутаций для населения дочь клеток также может быть получена, чтобы попытаться смоделировать есть ли асимметричный наследования мутаций во репликативного старения. Таким образом, объединение обогащение материнских клеток с помощью магнитной сортировки клеток с колебанием тестов позволяет преимущества S. CEREVISIAE модель системы, которые будут эффективно применяться для исследования механизмов, ответственных за накопление генетических изменений при митотического клеточного старения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	100 мг
антибиотин Микрогранулы	Miltenyi Biotec	130-090-485	2 мл Микрогранулы конъюгированы с моноклональными мышиными антителами к биотину (изотип: мышиный IgG1)
MACS LS колонки	Miltenyi Biotec	130-042-401	25 колонок подходят для сепаратора QuadroMACS
QuadroMACS сепаратор	Miltenyi Только	сепаратор	130-090-976
Стартовый комплект QuadroMACS Стартовый комплект	Miltenyi Biotec	130-091-051	включает в себя: сепаратор QuadroMACS (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS колонки (130-042-401), штатив для пробирок MACS 15 мл (130-091-052), одну единицу микрогранул MACS объемом 2 мл. Примечание: Альтернативные системы включают Dynabeads Biotin Binder и магнитные шарики MagnaBind
BD Falcon Cell Strainer, 40 и микро; m	BD Biosciences	352340	40 &микро; m для использования с коническими трубками BD Falcon 50 мл. 50 в упаковке
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T6146	Порошок, фильтрация после растворения важна для удаления частиц
Агглютинин зародышей пшеницы Alexa Fluor488	Life Technologies	W11261	Также могут быть использованы конъюгаты с различными спектрами возбуждения/излучения
ProLong Gold антифейдный реагент	Life Technologies	P36930	10 мл, также могут быть использованы другие антивыцветающие реагенты

Biotec