Цитозольные Измерения кальция в почечных эпителиальных клеток методом проточной цитометрии

Краткое содержание

Кальций участвует в многочисленных физиологических и патофизиологических сигнальных путей. Изображений живых клеток требует специального оборудования и может занять много времени. Быстрый, простой метод с использованием цитометр потока для определения относительных изменений цитозольным кальция в прикрепленных эпителиальных клеток ввели в суспензии оптимизированы.

Аннотация

Разнообразные клеточные процессы, как физиологические, так и патофизиологические, требуют кальция или регулируются им, включая экзоцитоз, функцию митохондрий, гибель клеток, клеточный метаболизм и миграцию клеток, и это лишь некоторые из них. Цитозольный кальций в норме поддерживается на низких наномолярных концентрациях; Скорее, он обнаруживается в высоких микромолярных и миллимолярных концентрациях в эндоплазматическом ретикулуме, митохондриальном матриксе и внеклеточном компартменте. При стимуляции временное увеличение цитозольного кальция служит сигналом о последующих событиях. Обнаружение изменений в цитозольном кальции обычно выполняется с помощью визуализации живых клеток, оснащенной красителями, связывающими кальций, которые демонстрируют либо увеличение интенсивности флуоресценции, либо сдвиг длины волны излучения при связывании кальция. Тем не менее, установка для визуализации живых клеток не является свободно доступной для всех исследователей. Альтернативные методы детектирования были оптимизированы для иммунологических клеток с помощью проточной цитометрии и для неиммунологических адгезивных клеток с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера. В данной работе мы опишем оптимизированный, простой метод обнаружения изменений в эпителиальных клетках с помощью проточной цитометрии с использованием красителя, связывающего кальций с одной длиной волны. Адгезивные эпителиальные клетки проксимальных канальцев почек, которые обычно трудно нагружать красителями, загружали флуоресцентным проницаемым кальциевым связывающим красителем в присутствии пробенецида, вводили в суспензию и контролировали кальциевые сигналы до и после добавления тапсигаргина, туникамицина и иономицина.

Введение

Кальций является важным вторичным мессенджером отвечает за передачу клеточного физиологических и патофизиологических сигналов ^1. Цитозольные концентрации кальция на низком уровне благодаря активности насосов кальция и обменных кальция. Саркоплазматического / эндоплазматический АТФазы ретикулума кальция (SERCA) пополняет эндоплазматической сети (ER) магазин кальция в качестве части системы «утечки насоса" в то время как АТФ-азы плазматической мембраны кальция (PMCA) экструдирует кальция в внеклеточное, как в АТР-зависимых манер ^2. Физиологические мессенджеры, такие как гормоны или нейромедиаторы, передают свои сигналы через G-белками рецепторов, активацию фосфолипазы С, который гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PIP2) в плазматической мембране, чтобы генерировать и диацилглицерол инозитол трифосфата (IP3) ^3. В то время как диацилглицерин остается в плазматической мембране, IP3 диффундирует в цитозоле и связывается с рецептором IP3S (IP3Rs), которые лиганд активированные кальциевые каналы, найденные в ER мембраны и кальций высвобождается из ER просвета магазине кульминацией к увеличению концентрации кальция цитозольных ^4. Альтернативный путь для достижения кальция в цитозоль через кальциевых каналов и теплообменников, присутствующих в плазматической мембране. Перекрестные помехи между этими двумя отсеками были описаны: выпуск кальция индуцированной кальция (CICR), где внеклеточного кальция вызывает высвобождение кальция из ER магазинах ^5, и магазин работает поступления кальция (SOCE), где опорожнения из ER магазинах воспринимается СТИМ и вызывает открытие ORAI кальциевые каналы в плазматической мембране, чтобы способствовать повторным наполнением ER магазинах ^6.

Под патофизиологических условиях, ответ сотовой кальция разрегулирована и цитозольных увеличивается кальция в отсутствие физиологических стимуляторов ^1. Реакция кальция может повлиять на несколькими способами: длительное кальцийСигнал, задерживается удаление кальция из цитоплазмы, истощение магазинах кальция или локализованных изменений в кальция. Кроме того, митохондрии взять на главную роль в буферизации и выпуская кальций ^7. Длительное и / или сверхмаксимальном цитозольный увеличение кальция приводит к гибели клеток. На самом деле, кальция чаще всего не участвует в клеточном патофизиологической ответ и является ключевым событием в широком спектре заболеваний, таких как нейродегенеративные заболевания, болезни сердца, рак, болезни костей и заболевания почек, которые в основном связаны с клеточной смерти и потеря или изменение органа или ткани функции ^8-10. Кроме того, возмущение сигналов кальция было связано с клеточной адаптации и изменений в клеточных функций и реакций.

Традиционно сигналы кальция измеряются с отрицательно заряженной флуоресцентного индикатора кальция, который загружается в клетках в клетки проницаемыми ацетоксиметиловый (AM) форме эфира. После того, как расщепляется клеточными esterasэс, флуоресцентные показатели остаются в пределах внутриклеточное пространство и увеличить интенсивность флуоресценции при кальция связан. Самый известный и используемый показатель кальция является пропорциональный Фура-2 разработана Роджером Tsien и коллег ^11. Показатели кальция с различной аффинностью к кальция позволяют различные бассейны кальция, подлежащих мониторингу. Методы обнаружения включают живых изображений сотовый, флуоресценции планшетного и проточной цитометрии. Относительно быстро кинетика кальциевых сигналов (обычно в течение нескольких секунд до минут) делает живых изображений сотовый наилучший метод для получения наиболее полную информацию о характеристиках сигнала кальция. Помимо быстрой кинетики сигналов кальция (в пределах миллисекунд), изображений живых клеток является лучшим методом изучения клеточного обособления кальциевой сигнализации в пределах одной ячейки ^12. Абсолютные концентрации кальция можно рассчитать путем определения минимального и максимального флуоресценции экз кальцияicator добавлением хелатирующего кальция и permeabilizing клетки, соответственно, как описано Grynkiewicz соавт. ^11.

Использование проточной цитометрии для измерения сигналов кальция была впервые разработана в 1980-х годах в иммунологических клеток, где возможность измерения нескольких параметров, таких как целостности мембраны и разделения популяции клеток, а также требование клеток в суспензии в сочетании с развитием одной длине волны показатели кальция из проточной цитометрии идеального и convenientdetection метода ^13-15. В прикрепленных клеток, изображений живых клеток обеспечивает наиболее полную информацию о кальциевой сигнализации, самое главное кинетики, но требует сложной настройки, содержащий флуоресцентный микроскоп, систему перфузии, поддержание клеточной среды, таких как температура, и специализированное программное обеспечение микроскоп для приобретения и анализа данных. Альтернативные способы, такие как флуоресценция микропланшет-ридера или Pharmacological средства через использование хелаторов кальция несравнимы с точки зрения накопленного информации. Проточной цитометрии становится все более широко используются для контроля цитозольную кальция в прикрепленных клеток, хотя, в большинстве исследований, только конечная точка измерения выполняются. С помощью метода, первоначально разработанный Gergely и др. В иммунологических В-клеток ^16, изменения в цитозольной концентрации свободного кальция с помощью проточной цитометрии с в режиме реального времени и мониторинга кинетики интенсивности флуоресценции в отдельных клеток из популяции образца были успешно измеряется в раковых эпителиальных клеток и стволовых клеток рака гибриды ^17. Этот метод был дополнительно приспособлен для использования в адгезивных эпителиальных клеток, которые трудно загружать с показателями кальция ^18.

Здесь, с помощью клейкого иммортализованной линии эпителиальных клеток, полученной из сегменте S1 крысы проксимальных канальцах почек (WKPT-0293 Cl.2) ^19, опишем оптимизированную упрощенную меню для измерения изменений в цитозольной концентрации кальция методом проточной цитометрии. Поскольку многие эпителиальные клетки обладают рядом органических перевозчиков для анионных соединений, загрузка клеток с индикатором кальция может оказаться сложной задачей. Чтобы предотвратить отток показателей кальция, пробенецидом, прототипом ингибитора органических анионов перевозчиков и первоначально разработанной для уменьшения почечной экскреции пенициллина ^20, применяется одновременно в среде инкубации. Клетки поддерживали в монослоев для индикатора кальция загрузки, приведены в подвески и кальциевых сигналов могут быть обнаружены сразу же после того соединения.

Протокол

1. Подготовка реагентов и решения

1. Подготовка сбалансированный солевой раствор модифицированной Хэнка (HBSS) (в мм: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na ₂ HPO _4, 0,44 KH ₂ PO _4, 4,17 NaHCO _3, рН 7,2, нет фенол красный). Хранить при 4 ° С.
2. Сделать 1,5 М CaCl ₂ и 2 М 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) (рН 7,2) Исходные растворы с использованием дистиллированной воды.
3. Подготовьте 250 мМ исходного раствора пробенецидом. Для форме свободной кислоты (часто упоминается как нерастворимый в воде), растворить порошок пробенецид в 1 N NaOH, заполнить на три четверти конечного объема дистиллированной воды и медленно титруют до рН 7,4 с помощью 1 н HCl. Хранить при 4 ° С.
4. Растворите люминесцентные мембраны проницаемыми связывания кальция красителя в безводный диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрации фондовом 1 мМ. Хранить при температуре -20 ° С в темноте.
5. Перед каждым экспериментом, недавно подготовить пробенецид, содержащий H-BSS поток (PHF) буфер модифицирован путем объединения HBSS с (в конечной концентрации) 1,5 мМ CaCl _2, 10 мМ HEPES, рН 7,2, 5% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ пробенецида, и 5,55 мМ глюкозы. Теплый до 37 ° С.

2. Культура клеток

1. Пластинчатые 2,5 х 10 ⁵ почечные клетки проксимальных канальцах (WKPT-0293 Cl.2) на лунку 6-луночный планшет или 35 мм чашку в стандартной культуральной среде, и расти в течение 2 дней достигая слияния примерно 70%.

3. Кальций Dye Загрузка

1. Для каждой скважины или блюдо, смешать 1 мл культуральной среды, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки, 4 мкМ клеток проницаемой связывания кальция краситель и 2 мМ пробенецида.
2. Заменить культуральной среды с красителем смеси 1 мл в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин в увлажненном инкубаторе с 5% CO _2. Накройте тарелку с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить обесцвечивание флуоресцентного индикатора.

4. Подготовка Ceзаполняет для проточной цитометрии

1. Теплый 0,05% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) раствор до 37 ° С.
2. Аспирируйте кальция решение нагрузка красителя из каждой лунки и добавить 1 мл трипсина вдоль стены колодца.
3. Инкубируют при 37 ° С до тех пор, пока все клетки отделены.
4. Передача клетки в 1,5 мл пробирку гранул и центрифугированием в микроцентрифуге при 10000 г в течение 1 мин.
5. Тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
6. Вымойте клеток путем добавления 1 мл буфера PHF и ресуспендируйте с помощью пипетки вверх и вниз.
7. Гранул клетки центрифугированием при 10000g в течение 1 мин.
8. Повторите шаги 4,6. и 4.7. еще два раза.
9. Ресуспендируют клеток в конечном объеме 500 мкл буфера PHF и использовать клетки для экспериментов в течение 1 часа.
10. Дополнительно: счета клетки для определения концентрации клеток и использовать 5 х 10 ⁴ - 1 х 10 ⁵ клеток на измерения.

5. Расход Cytметрового установки

1. Начните поток цитометр, открыть ящик струйной и переверните вентиляционный клапан тумблер, чтобы увеличить давление воздуха в баке оболочка жидкости.
2. "Премьер" прибор для удаления потенциальных пузыри проживание воздуха изнутри внутренних труб и проточной камеры.
3. В цитометрии программного потока, открытые две точечные участок окна.
   1. Первый точка участок требует вперед рассеянный свет (FSC) для параметра X и боковой рассеянный свет (SSC) для параметра Y для контроля за качеством клеток в образце через их размера и их детализации, соответственно.
   2. Второй участок точка измеряет интенсивность флуоресценции кальций связан красителя. Выберите соответствующий канал обнаружения флуоресценции для параметра Y с помощью логарифмической шкале и время в секундах для параметра X на линейной шкале.
4. Установите расход на "высокий".

6. проточной цитометрии Mмерка

1. Выполните измерения при комнатной температуре. В проточной цитометрии пробирку (11,5 х 75 мм), добавляют 480 мкл буфера PHF.
2. Добавить клеточной суспензии 20 мкл и кратко вихрь перемешать.
3. Перемещение опорной трубки руку в сторону и поместите пробирку в течение впрыска образец трубки до тех пор, герметичное уплотнение не образуется. Верните опорную трубу руку в исходное центральное положение.
4. Оптимизация измерения, регулируя флуоресценции канал таким образом, что среднее интенсивность флуоресценции образца при температуре приблизительно 10 ² на оси у. Сохранить и использовать для последующих экспериментов.
5. Чтобы начать эксперимент, повторите шаги 6,1 до 6,3.
6. Запись базовой флуоресценции на 50 сек.
7. Пауза измерения, снимите пробирку, добавить интерес соединения, вихря кратко и вернуться к инъекции образца трубы. Этот шаг не следует принимать более 15 сек.
8. Резюме измерения и продолжаться в течение в общей сложности 204,8 сек.
9. Используйте I кальцияonophore, такие как иономицин (10 мкМ), а хелатор кальция, такие как этиленгликоль тетрауксусной кислоты (EGTA), MnCl ₂ или CoCl ₂ (2 мМ), в течение положительных и отрицательных контролей, соответственно.

Анализ 7. Данные

1. Анализ данных с помощью специального программного обеспечения проточной цитометрии для автономного анализа, такие как WinMDI (Windows Multiple Interface Document для проточной цитометрии), бесплатный пакет программного обеспечения, разработанного Джо Троттер в Скриппса института, проточной цитометрии основной комплекс.
2. Откройте точка участок с SSC и FSC параметров.
3. Выберите область ячеек для анализа с помощью "Регионы" инструмент (щелкните правой кнопкой мыши на изображении), чтобы исключить мертвые клетки или клеточных обломков нашли в нижнем левом углу от анализа данных (Рисунок 1).
4. Квадрант анализ (Рисунок 2)
   1. Откройте плотности сюжет со временем на оси абсцисс и интенсивности флуоресценции от оси у. Используйте все события.
   2. Намэлектронной тот же стробирования регион в 7,3.
   3. Количественная данные с помощью "Quadrant" инструмент.
   4. Регулировка квадранта сепараторов так, чтобы вертикальная линия находится в момент соединения того и горизонтальная линия находится в центре базовой флуоресценции в контрольной группе. Убедитесь, что позиционирование квадранта сепараторов равна во всех образцах.
   5. Процент клеток в каждом квадранте отображается в каждом углу (рисунок 2). Сравните верхнюю правую четверть (UR) между образцами.
5. Анализ гистограммы (рисунок 3)
   1. Откройте данные управления в окне гистограммы с интенсивности флуоресценции от оси х и событий на оси ординат. Используйте все события.
   2. Для наглядного обзора, добавить тестовые данные, чтобы быть по сравнению с контрольным участком как наложения участков (перейдите в меню Файл → Открыть файл → Выберите файл → Overlay).
   3. Для количественного анализа, один гистограмма выигратьстеклам должен быть использован. Ворота популяция клеток с помощью, начиная с шага 7.3 регионе R1.
   4. В необработанной контроля, использовать функцию маркера («маркеры»), чтобы выделить участок для анализа, начиная от середины между минимальной и максимальной флуоресценции пике управления и заканчивая при максимальной интенсивности флуоресценции. Процент клеток в этой области вычисляется.
   5. Получение данных из окна статистики. Повторите для оставшихся файлов данных, используя тот же отмеченную область для анализа.
6. Анализ интенсивности флуоресценции (рис 4)
   1. Откройте точка участок со временем на оси абсцисс и интенсивности флуоресценции от оси у. Используйте все события.
   2. Включить "Кинетика режим" и "Overlay кинетики линия". Синяя линия появится в дот участка, представляющего среднее интенсивности флуоресценции.
   3. Количественной оценки относительной приток кальция путем создания нескольких прямоугольных областей. Каждый регион должен иметь AWidth около "50", что эквивалентно "10 сек". Определить до 15 прямоугольных областей.
   4. Получить количественную из окна статистики и скопировать в таблицу.
   5. Используйте данные Y-средство для анализа. Подсчитать среднее значение R2-R6, что эквивалентно 20 до 50 сек. Это базовое значение.
   6. Выберите подходящий временной интервал для анализа притока кальция (зависит от появления, продолжительности и интенсивности).
   7. Рассчитать сигналы кальция из каждого региона в этом интервале времени по отношению к средним исходным значением, то есть сигнал флуоресценции перед соединением того, который установлен на 100%. Определить среднее значение и стандартное отклонение регионах прикреплять соединение дополнение; это среднее сигнал кальция, вызванный соединения.

Результаты

Для увеличения цитозольную кальций, два фармакологические соединения наносили на проксимальных почечных канальцев клеток (WKPT-0293 Cl.2), нагруженных связывания клеток проницаемой кальция красителя, Fluo-3-AM. Образцы необработанных контрольных были загружены кальция связывания красителя в присутствии пробенецида и были смешаны, но без добавления каких-либо соединений. Тапсигаргин (TG) является классическим ингибитором SERCA насоса приведет к утечке из ER и что приводит к увеличению цитозольным кальция. Туникамицина (T...

Обсуждение

Кальций является ключевым событием в нескольких клеточных процессов, действующих в качестве второй молекулы посланник сигнализации, а также в качестве средства общения между ЭР и митохондрий. Возможность измерения изменений в свободных цитозольными концентрации кальция является полезным методом, который может применяться во всех областях клеточной биологии. Существуют различные методы для выявления цитозольные сигналы кальция. Классически, сигналы от индикатора логометрического кальция, такие как фура-2, контролируются ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Флуо-3, АМ	Инвитроген	F-1241	Проницаемость для ячеек
Пробенецид	Сигма-Олдрич	P-8761	Нерастворимый в воде, растворить в 1 Н NaOH
0,05% Трипсин-ЭДТА (1X)	Инвитроген	25300-062
Иономицин	Сигма-Олдрич	I9657
Тапсигаргин	Токрис Бионаука	1138
Туникамицин	Сигма-Олдрич	T7765
FACSКалибур Проточный цитометр + CELLКоюстное программное обеспечение	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Джо Троттер, Институт		Обратите внимание, что это более старое 16-разрядное приложение, которое читает файлы, совместимые с FCS 2.0, но не распознает цифровые данные FCS 3.0.
WKPT-0293 Cl.2 клеточная линия проксимальных канальцев почек крысы			Биофизика, Университет Кейс<Бр/> Западного резервного университета, Кливленд, Огайо)

Скриппса Предоставлено доктором Ульрихом Хопфером (Департамент физиологии и ;