Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного In Vitro Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Краткое содержание

Руководство представлены для генерации убийцы искусственного антигенпредставляющих клеток, KaAPC, эффективным инструментом для истощения в пробирке человеческих антиген-специфических Т клеток и альтернативного решения сотовой иммунотерапии для лечения Т-клеточного аутоиммунных заболеваний в антиген конкретного способа без ущерба оставшуюся иммунную систему.

Аннотация

Современное лечение Т-клетки аутоиммунные заболевания в основном зависит от стратегии глобальной иммуносупрессии, которая, в долгосрочной перспективе, сопровождается неблагоприятными побочными эффектами, такими как снижение способности контролировать инфекции или злокачественные опухоли. Поэтому, новые подходы должны быть разработаны, что цель только болезни посредником клетки и оставить излишнее иммунную систему без изменений. За последнее десятилетие различные клеточные основе стратегий иммунотерапии для модуляции Т-клеточные иммунные ответы были разработаны. Большинство из этих подходов рассчитывать на толерантность индукции антиген-представляющих клеток (АРС). Тем не менее, в дополнение к тому, технически трудным и громоздким, такие подходы на основе клеток весьма чувствительны к цитотоксическим Т-клеточные ответы, что ограничивает их терапевтический потенциал. Здесь мы приводим протокол для генерации непористые убийцы искусственных антигенпрезентирующих клеток (KaAPC), что позволяет истощения патологических Т-клеток, оставляя реостающие иммунная система нетронутыми и функциональным. KaAPC является альтернативным решением для сотовой иммунотерапии, которая имеет потенциал для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжение аллотрансплантата путем регулирования нежелательных Т-клеточные реакции в антигенспецифического моды.

Введение

За последние два десятилетия значительный прогресс был достигнут в понимании патогенетические механизмы аутоиммунных заболеваний. Тем не менее, наиболее распространенные методы лечения все еще ​​полагаются на кортикостероиды, а также иммуносупрессивных препаратов, таких как аналоги пурина, алкилирующих агентов и ингибиторов кальциневрина ^1. Использование таких препаратов значительно улучшить прогноз у больных, пока лечение не обеспечивает лечение лежащего в основе иммунологической неисправности. Кроме того, пациенты становятся уязвимыми к инфекциям и развитию рака.

Таким образом, конечной целью для лечения опосредованных Т-клеток аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантата является специально предназначены только болезнетворные Т-клетки, и в то же время, в результате чего оставшийся нетронутым иммунную систему и компетентным, чтобы бороться иммунологических нарушений. Использу антиген-представляющих клеток (АРС) в качестве лечения для подавления периферических Т-клеточные реакции был впервые описан в начале1970-е годы несколько групп. С тех пор множество подходов на основе клеток были разработаны (обзор в Schütz и соавт. ^2). Стратегии, использующие FasL-выражения убийца-APC как иммунорегуляторные клетки показали многообещающие результаты, указывающие терапевтический потенциал для лечения аутоиммунных заболеваний, отторжения трансплантата и хронических инфекций. Тем не менее, существуют значительные ограничения в стратегии с использованием FasL Killer-APC, которые в конечном счете ограничивается их клиническое применение; (Я) поколение или изоляция APC время, трудовых и временных затрат (II) пациенты, страдающие от цитопении вследствие иммуносупрессии предоставить ограниченное количество и качество клеток (III) покрытие или трансдукция APC с апоптоз сигналов, таких как результаты FASL в высоко переменных фенотипы и (IV) Убийца-APC чувствительны к цитотоксическим эффекторные функции Т-клеток как следствие, сокращает их терапевтический потенциал. Таким образом, трудно гарантировать определенную воспроизводимость Killer-APC Phenoтип, который может быть использован для антиген-специфической модуляции Т-клеточные ответы в естественных условиях.

На основании нашей предыдущей работе с FasL выражающей Killer-APC ^3-5 и искусственные антиген-представляющих клеток (AAPC) ^6,7 мы разработали шарик подхода (KaAPC) для антиген-специфической торможения или ликвидации авто-реактивных Т-клеток в пробирке. KaAPC состоят из HLA-A2-Ig-димера (сигнал 1) и анти-Fas мАт (апоптоз) сигнала, ковалентно иммобилизованы на поверхности парамагнитного латексного шарика 4,5 мкм. Они истощают антиген-специфических Т-клеток в Fas / FasL опосредованно от Т-клеточных культурах нескольких особенностей в антиген-специфическим образом и не зависит от активации индуцированной гибели клеток (AICD) пути. Доза зависит апоптоз в целевых Т-клеток быстро индуцируется уже через 30 мин ^8.

KaAPC может быть легко сгенерирована контролируемым образом обеспечивая определяется с полки phenotип и преодолеть большинство недостатков сотовых основе стратегий истощения. Следовательно, KaAPC отображения большой потенциал для лечения Т-клетки аутоиммунные заболевания и отторжения трансплантата, продвижении поле конкретных стратегий лечения Т-клеточных.

Протокол

1 Генерация HLA-A2-Ig Based KaAPC

1. Подготовьте стерильную буфер борат. Сделать 0,1 М раствор борной кислоты в воде и доведения рН до 7,0. Стерильный фильтр (0,22 мкм) буфера и хранят при температуре 4 ° С.
2. Подготовьте стерильную буфер шарик стирки. С помощью забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) без магний и кальций. Добавить сыворотку человека AB для 3% конечной концентрации. Добавить этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в течение 2 мМ конечной концентрации. Добавить азид натрия (NaN ₃₎ для 0,01% конечной концентрации. Стерильный фильтр (0,22 мкм) буфера и хранят при температуре 4 ° С.
3. Перевести 250 мкл эпоксидных шариков (около 100 х 10 ⁶ бисером) со склада в стерильный, с завинчивающейся крышкой стеклянный пузырек.
4. Добавить 250 мкл боратного буфера.
5. Поместите стеклянный флакон на магнит, и пусть шарики придерживаться в течение 2 мин; аспирируйте буфер и удалить стеклянный пузырек от магнита.
6. Вымойте бисером один раз 1 мл боратного буфера.
7. Ресуспендируйте гранул, в 550 мкл 0,018 мкг/ Мл HLA-A2-Ig и 3,64 мкг / мл анти-человеческий CD95 моноклональное антитело (клон CH11) и аккуратно перемешать путем встряхивания. (Пожалуйста, смотрите дискуссионный раздел для получения дополнительной информации.)
8. Инкубируйте стеклянный пузырек на конце поворотного устройства над концом, при 4 ° С в течение 24 часов.
9. Спин вниз бусы при 300 мкг в течение 2 мин.
10. Поместите стеклянный пузырек на магнит в течение 2 мин и аспирации "KaAPC загрузки решение"; удалить стеклянный пузырек с магнитом, добавить 1 мл борта промывочного буфера и ресуспендируйте тщательно встряхивая.
11. Повторите шаг 1,10 раза.
12. Инкубируйте стеклянный пузырек на ротатор при 4 ° С в течение 24 ч в 1 мл промывочного буфера шарик. В этот момент все остаточного белка сайты связывания будет заблокирован человека АВ сыворотки, содержащейся в буфере шарик стирки.
13. Спин вниз бусы при 300 мкг в течение 2 мин.
14. Место стеклянный флакон на магнит в течение 2 мин и аспирата стирки шарик буфера; удалить стеклянный пузырек от магнита и заменить решение с 1 мл PBS.

2 Контроль качества, пептид Загрузка, Wзолы, хранения, и устойчивость KaAPC

1. Трансфер 1,5 х 10 ⁵ KaAPC в FACS трубы и промыть 1 мл FACS промывочного буфера.
2. Ресуспендируют бусины в 100 мкл FACS буфера для промывки и добавить 1 мкл анти-мыши IgG1 PE (для обнаружения Fc части HLA-A2-Ig) и 1 мкл анти-мышиных IgM-FITC (клон R6-60.2, для обнаружения анти-человеческого CD95 МКА).
3. Выдержите в течение 15 мин при 4 ° С, промыть 1 мл FACS промывочного буфера, и ресуспендируют в 250 мкл FACS моющим буфером и читать окрашивание с помощью проточной цитометрии.

Рис.1 QC пятно партии KaAPC сделал, как указано в разделе протокола. Окрашивание проводили, как описано в разделе протокола 2 HLA-A2-Ig был обнаружен с помощью анти-мышь-IgG1 PE МКА, в то время как анти-человеческого-CD95 (анти-Fas) был обнаружен с анти-IgM мыши-FITC мАт (см протокол SEводств 2.2) (синяя линия). Заполненные черные графики представляют пустые шарики, окрашенных анти-мышь-IgG1 PE МКА или против мышиного IgM FITC МКА, соответственно. Числа в правом верхнем углу указать среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

4. Для пептидной погрузки передачи 20 х 10 ⁶ KaAPC в новую стерильную стеклянную пробирку, поместить на магнит в течение 2 мин, аспирация PBS и ресуспендируют гранул, в 500 мкл свежей PBS с 5 мкг пептида (Имейте в виду, только HLA-A2 ограниченные пептиды связать на димера!).
5. Магазин не загружен KaAPC при 4 ° С до использования, по меньшей мере, 3-х дней, чтобы обеспечить достаточное пептидный нагрузку на HLA-A2-Ig димера.
6. Непосредственно перед применением, мыть пептид загружалась KaAPC как указано в 1.14; повторите этот шаг, по крайней мере 6x.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важный шаг для того, чтобы свободный пептид имеет то полностью удалить, чтобы избежать ложных положительных результатов для убийства; Остаточный свободный пептид, как было показано, индуцирует апоптоз в антиген-специфических Т-клеток культур ^9. Чтобы исключить растворимый эффект пептида, запустить образцы супернатанта управления пептида загруженной и промывают KaAPC (см 3.8).
7. Количество бусы, используя гемоцитометра и этикетка с датой, названием пептида и концентрации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Loaded KaAPC оставаться функциональным при 4 ° С в течение не менее одного месяца. После одного месяца, повторно загрузка с той же пептида позволяет KaAPC быть использованы на срок до одного года.

3 KaAPC In Vitro Убийство Анализ

1. Подготовить совместно питательных сред. Подготовить всю RPMI среду, дополненную 3% T фактора роста клеток (сделано в лаборатории ⁶⁾ и 3% доноров собственной плазмы. Если донор аутологичной плазмы недоступен, используйте инактивированной нагреванием сыворотку человека AB.
2. Подготовьте AnnexinV связывания подготовку буфера. Растворить 8,12 г хлорида натрия (NaCl) и 0,12 г вычий хлорида (CaCl ₂₎ в 990 мл DDH ₂ O.Add 10 мл 1М HEPES буфер.
3. Генерация человека антиген-специфических Т-клеток. (Для детального протокола смотрите предыдущую публикацию ⁷ с использованием искусственных антигенпредставляющих клеток (AAPC)). Убедитесь, что пептид, специфичность по крайней мере,> 75%, как определено окрашиванием тетрамера.
4. Для каждого образца инкубируют 2 х 10 ⁵ антиген-специфических Т клеток / лунку (в 96 и круглой нижней пластине) в 200 мкл со-культуральной средой в соотношении 1: 1 с KaAPC в течение 48 часов в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C и 5% CO _2.
5. Образцы промыслом и передать в FACS трубы; мыть с 1 мл AnnexinV буфера для связывания, спин вниз при 300 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант и ресуспендируют в 100 мкл AnnexinV буфера для связывания
6. Образцы пятен с 1 мкл AnnexinV FITC и 5 мкл 7-AAD в течение 10-15 минут при комнатной температуре, промывают 1 мл AnnexinV связывающего буфера; спин вниз при 300 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант апд ресуспендируют в 250 мкл буфера для связывания AnnexinV
7. Немедленно прочитаны образцы на проточном цитометре.
8. Подготовьте следующие образцы для определения антиген-специфическую убийство по KaAPC: только Т-клеток; Т-клетки + растворимый анти-CD95; Т-клетки + выгружен KaAPC; Т-клетки + не-родственные пептид загружалась KaAPC; Т-клетки + родственно пептид загружалась KaAPC; Т-клетки + супернатант родственного пептида загружалась KaAPC.

. Рисунок 2 KaAPC убивать анализа пептида загружалась KaAPC или контрольные шарики (HLA-A2-Ig только шарики) культивировали в течение 48 ч при соотношении 1: 1 с CMVpp65 специфических Т-клеток (~ 80%), собирают и затем окрашивают AnnexinV и пропидийиодида (PI) для определения апоптоза методом проточной цитометрии (смотрите раздел протокол 3,3-3,7). ^{"родственно"} относится к бисера загружалась с CMVpp65 и ^{"не-родственным"} бытьобъявления нагруженные Mart-1 пептида. Цифры указывают процент жизнеспособных Т-клеток в левом нижнем квадранте каждого участка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

9. Для выполнения крест-накрест-эксперименты, генерации антиген-специфических Т-клеток двух различных особенностей.
10. Кроме того оценить антиген-специфических обеднения способности KaAPC с одновременным анализом антиген-специфического устранения Т-клеток в Т гетерогенной клеточной популяции. (Для детального протокола смотрите Шютц и др. ^10).

Результаты

Особенности этого протокола включают определенных поколение фенотипа KaAPC который отображает HLA-A2-Ig (сигнал 1) и анти-Fas МКА (апоптоз сигнал) в то же время, что по сравнению с подходами, основанными клеток не изменяется покрытием или трансдукции полезного действия и может быть легко модулируется в процессе производства (рисунок 1). Кроме того, KaAPC, не чувствительны к цитотоксическим эффекторных функций Т-клеток и их функциональность не зависит от качества аутологичных антиген-представляющих клеток до и после в пробирке манипуляции.

KaAPC способны разрушающих антиген-специфические Т-клеток в пробирке при загрузке с родственным пептида, в то время как не-родственные загружалась KaAPC не будет истощать Т-клетки (рисунок 2). Таким образом, KaAPC индуцируют апоптоз Т-клеток в антиген-специфическим образом. Впоследствии мы использовали KaAPC для селективного истощения антиген-специфических Т-клеток из смеси различных Т-клеток SPEcificities, демонстрируя, что только минимальное цитотоксичность просачивался в соседних Т-клеток (рисунок 3). Таким образом, KaAPC представляют изысканные инструмент для в пробирке антигенспецифической истощения человека активируется антиген-специфических Т клеток с потенциалом клинической применимости для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжение аллотрансплантата.

Обсуждение

Наиболее важным шагом в протоколе является обеспечение соответствующего соотношения сигнал 1 (пептида МНС) и сигнала 2 (анти-Fas МАБ). Мы провели интенсивные эксперименты титрования определить идеальное соотношение для сигнала 1 и 2; стало очевидно, что минимальные изменения в связи с различиями в HLA-A2 Ig димера или анти-Fas концентрации МАБ может нарушать нормальное функционирование в KaAPC. Таким образом, концентрация обоих сигналов всегда должны быть проверены и качество обоих белков должны быть проверены часто, даже если он был заказан из коммерческого источника. Кроме того, концентрации всегда должно быть определено том же анализе, поскольку различные анализы обнаружения может привести к различной концентрации. Функциональные возможности HLA-A2-Ig также может быть нарушена вследствие неполного повторной укладки и / или неэффективной пептида нагрузки. Кроме того димера молекулы могут агрегировать в разной степени, которые могут оказывать влияние на функциональную активность белка. Поэтому, кималь количество димера, необходимое для генерации конкретного функционального и KaAPC может изменяться. Кроме того, мы обнаружили, что идеальный диапазон для смерти, вызывающего сигнала анти-Fas МКА на KaAPC крайне туго. В наших руках количествах больше 3,64 мкг / мл приводит к неспецифической убийства Fas позитивных Т-клеток, а количество ниже 3,64 мкг / мл привело дозы в зависимости снижения активности убийства. Хотя эти условия кажутся довольно плотно, внимание на эти детали будут приводить к образованию функционального и конкретной KaAPC.

Хотя в настоящее время фенотип KaAPC функционально истощения активированных антиген-специфических Т-клеток, первоначальных экспериментов, направленных на наивных или отдыхая антиген-специфичные Т-клетки не показали значительное индукцию антиген-специфической апоптоза как эти группы населения сократили выражение ФАС. Поэтому, можно предположить добавления дополнительных стимулирующих сигнал на KaAPC индуцировать регуляцию Fas на покоящихся Т-клеток, чтобы сделать превратить ихв мишень для KaAPC. В то время как это возможно все три сигнала должны быть тщательно титруют, чтобы обеспечить функциональную фенотип KaAPC.

Регулировка борта платформы для биосовместимого или биоразлагаемого матрицы повысит KaAPC в естественных условиях применимости. Недавно, Шен и др. Сообщили успешным в использовании естественных условиях KaAPC используя 5 латексные мкм бусы конъюгированных с анти-Fas (клон JO2) и анти-Его / H2-K ^б -TRP2 ^11. Мы смогли показать, что общая концепция искусственных антиген-представляющих клеток (AAPC) могут быть успешно переведены из мкм размер, чтобы нм размера частиц ¹² и что функциональность зависит от геометрии частиц ^13. Таким образом, путем изменения размера и / или формы будущего KaAPC конструкций можно было бы быть в состоянии повлиять на функциональность в естественных условиях и био-распределения, которая может стать ключом для успешного лечения органов конкретных аутоиммунных заболеваний.

2, развитие дополнительного класса HLA я димера молекул, а также продолжающуюся идентификацию новых аутоиммунных соответствующих антигенов приведет к дальнейшему увеличению и расширения применимости KaAPC. Кроме того можно было думать об использовании KaAPC направленную на различных эпитопов целевой несколько антигенов одновременно.

Таким образом, KaAPC представляют собой гибкую технологическую платформу дляTigen конкретных истощение Т-клеток. Их "лего-как" природа позволяет включение новых сигналов, таких как дополнительные костимулирующих или тормозящих сигналов, таких как ФД1 или TRAIL на различных матрицах, которые могли бы расширить и повысить их последующее в пробирке и в естественных условиях применимости. Здесь мы представляем протокол шаг за шагом, чтобы генерировать KaAPC, подход, основанный первый шарик в целях ликвидации антиген-специфических Т клеток из Т-клеток смесей с различными особенностями.

Рисунок 3 KaAPC исключить CTL в антиген-специфического образом PKH26 меченных активирована Fas ⁺ ЦТЛ эффектор-память и PKH67 меченных CMVpp65-специфических ЦТЛ из того же донора смешивают в соотношении 1:. Соотношении 1 и совместно культивировали с ^CMVpp65 KaAPC в течение 48 часов. Контрольные культуры обрабатывались с ^{выгружается} KaAPC, или 1 мкг / млрастворимого анти-Fas-МКА (клон CH11). Минимальные потери жизнеспособных клеток было определено в необработанных смешанных культур CTL (T _Mix). Исходные данные FACS для каждой популяции CTL _микса T показаны. Анализ апоптоза проводили, как описано ранее на отдельной стробирования на обеих популяций Т-клеток ^10. Номера, изображенные в верхнем левом квадранте представляет% от общего числа клеток. Иллюстрирующая цифра получена из одного репрезентативного эксперимента из трех независимых экспериментов. Это исследование было первоначально опубликовано в крови. . Шютц, С. и др Убийца искусственные антиген-представляющих клеток: новая стратегия для удаления специфические Т-клетки крови.. 2008; 111, 3546-52. Copyright Американского общества гематологии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
PBS	Corning	21-040-CV
Сыворотка AB человека	Atlanta biologics	S40110
EDTA	Sigma/Aldrich	E5134
Азид натрия	Sigma/Aldrich	71289
M-450 эпоксидные шарики	Invitrogen/Dynal	14011
MPC-1 магнит	Invitrogen/Dynal	12001D
Стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой	Fisher Scientific	03-338AA
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi	130-090-753
anti-CD95 (клон CH11)	Milliore	05-201
HLA-A2-Ig димер	BD/Pharmingen	551263
Крио-пробирка 2 мл	Corning	430488
антимышиный IgG1 PE	BD/ Pharmingen	559320
anti-mouse IgM FITC	BD/Pharmingen	553408
Хлорид натрия	Merck	S271-3
Хлорид кальция	Sigma/Aldrich	C5080
HEPES	cellgro/Mediatech	25-060-CI
RPMI	GIBCO/Life technologies	11875-085
96-луночный круглый нижняя плита	Falcon	353077
AnnexinV FITC	PromoKine	PK-CA577-1001-1000
7-AAD	BD/Pharmingen	51-68981E
FACS трубки	Falcon	352008