Методическая статья

Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

16.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51860

⸱

21 августа 2014 г.

 , 
1Molecular, Cellular and Developmental Biology Graduate Program, The Ohio State University, 2Center for Cardiovascular and Pulmonary Research, The Heart Center, The Research Institute at Nationwide Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, The Ohio State University

В этой статье

Краткое содержание

Способность выделять эндотелиальные клетки сердечного клапана (VECs) имеет решающее значение для понимания механизмов развития, поддержания и заболевания клапанов. Здесь мы описываем выделение VEC от эмбриональных и взрослых мышей Tie2-GFP с помощью FACS, что позволит провести исследования, определяющие вклад VECs в процессы развития и заболевания.

Аннотация

Нормальные структуры клапанов состоят из стратифицированных слоев специализированного внеклеточного матрикса (ВКМ), перемежающихся с интерстициальными клетками клапанов (ВИК) и окруженных монослоем эндотелиальных клеток клапанов (ВЭК). VEC играют важную роль в формировании структур клапанов во время эмбрионального развития и важны для поддержания целостности и функции клапанов на протяжении всей жизни. В отличие от непрерывного эндотелия на поверхности здоровых створок клапана, нарушение ВЭС обычно наблюдается при неисправных клапанах и связано с патологическими процессами, способствующими заболеванию и дисфункции клапанов. Несмотря на клиническую значимость, целенаправленные исследования, определяющие вклад ВЭК в развитие и патологические процессы, ограничены. Выделение VEC из животных моделей позволило бы проводить эксперименты на клетках. VEC были выделены из взрослых моделей крупных животных, но из-за их небольшого размера популяции, хрупкости и отсутствия специфических маркеров не сообщалось об изоляции VEC у эмбрионов или взрослых моделей мелких животных. Здесь мы описываем новый метод, который позволяет напрямую изолировать VEC от мышей на эмбриональной и взрослой стадиях. Используя репортерную модель Tie2-GFP, которая помечает все эндотелиальные клетки зеленым флуоресцентным белком (GFP), нам удалось изолировать GFP-положительные (и отрицательные) клетки из полулунной и атриовентрикулярной областей клапанов с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS). Изолированные GFP-положительные VEC обогащены эндотелиальными маркерами, включая CD31 и фактор фон Виллебранда (vWF), и сохраняют экспрессию эндотелиальных клеток при культивировании; в то время как GFP-отрицательные клетки демонстрируют молекулярные профили и клеточные формы, соответствующие фенотипам VIC. Способность выделять эмбриональные и взрослые мышиные VEC позволяет проводить ранее недостижимые молекулярные и функциональные исследования на конкретной популяции клеток клапана, что значительно улучшит наше понимание развития клапанов и механизмов заболевания.

Введение

Зрелый клапан состоит из трех слоев слоистых специализированной внеклеточного матрикса (ECM) перемежаются с клапаном интерстициальных клеток (ИКС) и инкапсулируются одного слоя клапанов сердца эндотелиальных клеток (ЗВТ) 1. Роль ECM является предоставление всех необходимых биомеханические свойства выдерживать постоянные изменения в гемодинамической силы во время сердечного цикла. Оборот клапана ЕСМ во взрослом клапана жестко регулируется ИКС которые в значительной степени в состоянии покоя, и фибробластов, как в отсутствие болезни. В дополнение к популяции VIC, клапанов сердца эндотелиальные клетки (ЗВТ) образуют непрерывную эндотелий по поверхности створок клапана 2. Хотя важность ECM и ВИНК для структуры клапана и функции были описаны нами и другими, роль ЗВТ менее известен. Однако, это сравнительно небольшое популяция клеток является критическим для формирования клапана в зародыше, и описывается как дисфункциональное в клапанеболезнь.

Формирование клапана сердца у эмбриона начинается тогда, когда подмножество эндотелиальных клеток в течение атриовентрикулярного канала и тракта оттока регионах пройти эндотелия к трансформации мезенхимальных (EMT) и форм опухолей, известных как эндокардиальных подушек 1,3. Вновь трансформированные мезенхимальные клетки в этих структурах позже дифференцироваться в ВИНК и образуют зрелые клапаны. После того, как ЕМТ является полным, эндотелиальные клетки, окружающие подушки, называют ЗВТ, образуют непрерывный слой эндотелиальных клеток, который защищает зрелую клапан от травм. Кроме того, ЗВТ ощутить среды гемодинамические и было показано, что молекулярно связи с базовых ИКС регулировать ЕСМ гомеостаза 1,3. В пораженных клапанов, VEC монослой нарушается в связи с аномальными изменениями в ECM организации и измененных биомеханики 4,5. Кроме того, исследования, проведенные в мышиных моделях показывают, что VEC дисфункция является основной причиной клапана Disease 1,6-9. Как ЗВТ играют важную роль в развитии клапана, технического обслуживания и болезни, важно, что мы полностью определить их временные фенотипы в целях продвижения поле и понять механизмы болезни.

Предыдущая работа нескольких лабораториях успешно изолированы ЗВТ из свиных и бараньих моделей 10-12. В связи с большим размером этих клапанов, выделений через подсос и / или ферментативным расщеплением с последующей ряда различных методов изоляции в том числе разделение магнитной шарик клеток и клональной экспансии одной ячейки был эффективен для генерации чистых популяций 11-13. Тем не менее, эти модели могут быть ограничительным в связи с неполной аннотации из свиней и овец геномов, ограничивающих доступность молекулярных инструментов в дополнение к высокой стоимости. Поэтому эксперименты из свинины и баранины ЗВТ после выделения может быть ограничительным. Мышиные модели предпочтительнее в связи с многочисленными возможностями для генетического манипулойния и молекулярные инструменты в зародыше и взрослого, но на сегодняшний день, не было зарегистрировано ни одного VEC изоляция в небольших животных моделях. Вероятно, это связано с трудностью работы с маленькие образцы ткани, которые включают население меньшинства клеток, что в настоящее время не хватает однозначная идентификация VEC-специфических маркеров, тем самым предотвращая основе антител методы изоляции.

В этой статье мы приводим новый метод прямого выделения мышиных ЗВТ в эмбриональных и взрослых этапах. Этот протокол использует Tie-2-GFP мышей, которые экспрессируют GFP во всех типах клеток эндотелия и широко используемых для изучения эндотелиальных клеток популяции 14. Тем не менее, новинка этого текущем исследовании является то, что эти мыши, впервые были использованы для выделения эндотелиальных клеток из клапанов. Путем тщательного рассечения ткани клапана и серии из девяти ферментных пищеварения с последующей FACS сортировки, ЗВТ, могут быть выделены и использованы для различных экспериментальных методов вчисле добычу и культуры РНК, непосредственно после сортировки.

Протокол

1 Подготовка оборудования и решений

  1. Стерилизовать рассечение инструменты - ножницы тонкие ткани для извлечения взрослых сердца и 2 тонких щипцов для рассечения клапанной области - в автоклаве в закрытом лотке инструментов. Спрей инструменты с 70% этанола (этанол) до вскрытия.
  2. Подготовить все решения непосредственно перед экспериментом и стерилизовать решения, пропуская их через стерильный фильтр 0,2 мкм. Хранить решения на льду до использования.
    1. Стерильный Диссоциация буфера (15 мл общего числа / образец). Комбинат 1,2 мл коллагеназы IV, 300 мкл 2,5% трипсина и 150 мкл цыплят сыворотку. Принесите объем до 15 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS).
    2. Стерильный Сортировка буфера (12 мл всего). Зерноуборочные 25 мкл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 12 мкл ДНКазы I (РНКазы). Принесите объемом до 12 мл HBSS.
    3. VEC Культура Медиа. Mix эндотелиальные грот-й СМИ в соответствии с инструкциями изготовителя (см материал таблицу), добавляя Определенную часть компонентов из комплекта к 500 мл EBM2 СМИ.
    4. GFP Отрицательный Культура Медиа (не эндотелиальных клеток СМИ). Смешайте 445 мл среды 199 1x 5 мл пенициллина / стрептомицина (ручка / стрептококк) (1% конечная концентрация) и 50 мл FBS (10% конечная концентрация).

2 Рассечение клапанной области от мышей взрослых и эмбрионов E14.5

  • Все процедуры животных были утверждены и выполняются в соответствии с руководящими принципами в Национальной детской больницы НИИ IACUC.
  • Мышей Tie-2-GFP были приобретены у Джексона Laboratories (номеру модели 003658) 14 и поддерживались как гомозиготных генотипов на FVB / N фоне, и, следовательно, обеспечение того, чтобы все пределы весной экспресс GFP в Tie2-положительных эндотелиальных клеток.
  • Для FACS сортировки, подготовки в одной возрастной соответствует отрицательное SAMPле, что не содержит GFP, такие как C57 / BL6 установить параметры GFP ворота для FACS сортировки. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол и показательные результаты основаны на использовании трех, четырех-месячного взрослых мышей или один помет в день эмбрионального (E) 14,5.
  1. Взрослых мышей: Сразу же после жертва по CO 2 аноксии, использовать рассечение ножницами осторожно открыть грудную полость и подвергать сердце и легкие. После того, как подвергается, сцепление сердце щипцами на магистральных артерий и оторваться от тела. Удалить легочной ткани, если нетронутыми, и место сердца в холодной HBSS для полоскания. Снимите желудочек и вырваться из предсердий оставляя атриовентрикулярного канала 'кольцо' и аорты регионы нетронутыми. Сделайте один надрез вниз сторона атриовентрикулярного канала, чтобы открыть 'кольцо' и разоблачить клапанных структур. Снимите миокарда и проксимальных аорты осторожно дразнить от пинцетом. Определить листовки клапанов как белый, плотной ткани над розовым миокарда. Аккуратно ДЭТАCH Отель хорды tendinae из атриовентрикулярных клапанов и удалить как можно больше оставшегося миокарда, насколько это возможно. Будьте осторожны, чтобы не тянуть или царапать листовки клапанов во время этого процесса, так как ЗВТ может быть смещена. Поместите обрезанные клапанных областей в 1,5 мл пробирку Эппендорфа, содержащую 1 мл HBSS и держать на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное рассечение важно устранить не-клапанных эндотелиальные клетки, которые могут загрязнить образец.
  2. Эмбрионы: Жертвоприношение самок мышей 14,0 дней после наблюдается совокупление плагин (утром совокупления вилки = 0,5 дней).
    1. Сразу же после жертву, рассекать матку (содержащий эмбрионов) и помойте в холодной HBSS. Проанализируйте индивидуальные эмбрионы из матки и снимите эмбрионального желточного мешка окружающий каждый эмбрион. Удалить сердца от каждого из эмбрионов и следовать шаг 2,1. (ПРИМЕЧАНИЕ: нежно сжимая эмбриона с пинцетом чуть ниже верхних придатков должно помочь разоблачить сердце и облегчающие извлечение.)
3. Диссоциации клеток и подготовка к FACS

  1. Использование стерильные наконечники пипеток, удалить HBSS из пробирки Эппендорф, содержащей клапанных регионы.
  2. Заменить 1 мл диссоциации буфера и 4 мкл ДНКазы I.
  3. Поворот трубы при 37 ° С в течение 7 мин.
  4. Внесите вверх и вниз 3 раза, а затем пусть образец урегулировать в течение 15 сек. Собирают супернатант, содержащий (диссоциированных клеток) в 15 мл коническую пробирку.
  5. Чтобы остановить реакцию коллагеназы, добавьте 125 мкл лошадиной сыворотки в пробирку. Держите пробирку на льду.
  6. Повторите шаги диссоциации (3,2 - 3,5) девять раз, чтобы собрать девять фракций супернатанта.
  7. Пропускают фракционировали путем сбора нейлоновый фильтр 70 мкм в новую пробирку, чтобы обеспечить суспензии отдельных клеток путем удаления любой мусор и комки.
  8. Спин суспензии при 400 г в течение 5 мин для осаждения клеток.
  9. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл сортировки буфера идержать на льду до FACS.

4. FACS Сортировка GFP положительный ЗВТ

  1. Установите ворота для прямого и бокового разброса исключить мусор и захватить отдельные клетки; исключить дублеты с помощью двойной дискриминации гейтинг. Запись отрицательного контрольного образца и определить параметры затвора, чтобы сравнить и точно определить GFP-положительных клеток популяции в образце Tie-2-GFP.
  2. Анализ GFP-положительных клеток с помощью FACS и уточнить параметры ворот.
  3. Сортировка образец Tie-2-GFP и собрать как GFP-положительных и GFP-отрицательные клетки. Если клетки будут использоваться для выделения РНК, вроде непосредственно в Распределяющей буфера. Для культуры клеток после FACS, собирать GFP-положительных клеток в стерильную пробирку, содержащую 1 мл VEC медиа с 1 мл FBS, и собирать GFP отрицательных клеток в 1 мл не-эндотелиальных сред с 1 мл FBS. Используйте этот 50% комбинацию СМИ / 50% сыворотки для улучшения жизнеспособности клеток. Держите на льду до анализа подайте FACS.

5 Сообщение FACS дифферес

  1. Экстракция РНК:
    1. Сразу же после FACS, центрифуги GFP положительные и отрицательные клетки в 1500 мкг в течение 8 мин.
    2. Тщательно пипетки супернатант (сортировка буфера) и выбросьте.
    3. Ресуспендируют осадок клеток (пеллет не видно для размеров выборки рекомендуемых здесь) в 200 мкл TRIzol.
    4. Замораживание при -80 ° С или начать стандартной экстракцией фенолом-хлороформом, чтобы изолировать общую мРНК, как описано ранее нашей лаборатории 15.
    5. Используйте 50-200 нг РНК для синтеза кДНК с использованием Mastermix соответствии с инструкциями изготовителя.
    6. Тема кДНК для количественного ПЦР-амплификации с использованием IDT Primetime КПЦР зондов против мыши эндотелиальных клеток маркеров (CD31, фактор Виллебранда (ФВ)), клапан интерстициальный клеточных маркеров (α-актин гладких мышц (α-SMA), Periostin (Postn)), миоцитов маркеры (Mhc6, Mhc7) и GAPDH.
    7. Культивирование мышиных VEC:
      1. После FACS сортировки и сбора клеток (стадия 4.3), центрифуги клеток при 300 мкг в течение 5 мин.
      2. Тщательно пипетки надосадочную (сортировка буфера + СМИ) и выбросьте.
      3. Ресуспендируют GFP-положительных клеток осадок в 1 мл VEC массовой информации и GFP-отрицательный осадок в 1 мл не-эндотелиальные средств массовой информации.
      4. Пластина каждого образца в одну лунку пластиковой камеры стекло и не растут до тех пор, сливной. Культура в течение приблизительно 1 недели для GFP негативных клеток сливаться и больше чем 2 недели для GFP-положительных клеток в сливаться (из образца 3, взрослых мышей). Изменение СМИ каждые два дня.
    8. Иммунофлуоресцентное Окрашивание:
      1. Удалить носитель из клеток и зафиксировать в 4% параформальдегида (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть фиксированные клетки три раза в течение 5 минут каждый в растворе фосфатно-солевом буфере (PBS).
      2. Удалить камеры скважин с горкой и блока 5% бычьего сывороточного альбумина / 1х PBS в течение 1 часа при комнатной температуре.
      3. Выдержитескользит O / N при 4 ° С с первичными антителами (CD31, 1: 1000 или α-актин гладких мышц (α-SMA), 1: 100). Промыть 3 раза в течение 5 мин в PBS.
      4. Развести вторичные антитела (Alexa Fluor-568 Коза анти-Rat) 1: 400 в PBS, добавить к слайдам, и инкубировать 1 час при комнатной температуре. Промыть слайдов 3x в течение 5 мин в PBS.
      5. Крепление в Vectashield-содержащей DAPI и инкубировать 1 час при 4 ° С до просмотра.

Результаты

Tie2-GFP клетки ко-локализуются с эндотелиальных маркеров клеток в эмбриональных и взрослых сердечных клапанов.

Для того чтобы подтвердить специфичность экспрессии Tie-2-GFP в ЗВТ из эмбриональных и взрослых мышей, иммунофлуоресценции осуществляли для определения совместной локализации с эндотелиальных клеток маркера CD31, в срезах ткани, полученных из E14.5 и 3 месяца взрослого Tie-2-GFP мышей с использованием методов, ранее опубликованного нашей лаборатории 16. Как показано на рисунке 1, ЗВТ со-экспресс GFP (Рисунок 1 A, B, E, F) и CD31 (Рисунок 1 C, D, E, F) на обоих взрослого (Рисунок 1 B, D, F) и эмбриональные ( Рисунок 1, С, Е) этапы, поэтому проверки нашей модели для последующего VEC изоляции.

Анализ FACS определены четкие GFP-положительных и GFP-отрицательный клеточных популяций в эмбриональных и взрослых сердечных клапанов, выделенных из мышей Tie-2-GFP.

Дикий тМышей C57 ип / BL6 были использованы для установки параметров GFP и примерно 2% от закрытого одиночных клеток мышей Tie-2-GFP показывают значительное обогащение GFP-положительных клеток с помощью анализа FACS в обоих эмбриональных и взрослых образцов (рисунок 2). На основании исследований совместно локализации, показанных на рисунке 1, эти клетки считаются ЗВТ и равна в среднем 61 800 общего числа клеток (образцы варьируются от 39,000-77,000 клеток / образец) в выборке взрослого населения (N = 3), и 8928 клеток (8,015- 11000 клеток / помет) из одного помета эмбрионов E14.5.

ПЦР-анализ подтверждает, обогащение эндотелиальных клеток маркеров в GFP-положительных клеток и интерстициальных клапанов маркеров клеток в GFP-негативных клеток, выделенных из мышей Tie-2-GFP.

Джин анализ выражение GFP положительных и отрицательных клеточных популяций КПЦР следующих FACS отчетливые молекулярные профили. По сравнению с GFP населения отрицательный клеток, выделенных из эмбрионов Tie2-GFP и AdulTS, GFP-положительных клеток обогащены для выражения эндотелия клеточные маркеры CD31 и фактора Виллебранда, (рисунок 3). Кроме того, выражение миоцитов маркеров (Myh6, MYH7) в этих клеточных популяций является очень низким, демонстрирует минимальную загрязнения не-эндотелиальных клеток. В отличие от этого, GFP негативные клетки, выделенные из взрослых Tie2-GFP мышей и эмбрионов E14.5 обогащены клапанов междоузельник (VIC) маркеров, α-SMA и Periostin (POSTN) по отношению к GFP-положительных клеток. Обогащение этих маркеров выше в GFP негативных клеток, выделенных из образцов E14.5 по сравнению со взрослыми в связи с фенотипом покоя взрослых ИКС и, следовательно, низкой экспрессией активированных маркеров.

GFP-положительных клеток, выделенных из взрослых мышей Tie-2-GFP можно культивировать в пробирке.

Возможность культуры GFP положительных и GFP негативных клеток, выделенных из образцов взрослых исследовали базуд на морфологии клеток и иммуногистохимического окрашивания. Использование протоколов, описанных ранее нами 17 мы показываем на рисунке 4, что GFP-положительных клеток появляются раунд в морфологии (рисунок 4А) и со-экспресс GFP с эндотелиальных клеток маркера CD31 после двух недель в культуре (Рисунок 4C). В отличие от этого, не-эндотелиальные клетки являются отрицательными для GFP, отображать мезенхимальных морфологию (Рисунок 4B) и выразить VIC маркерные α-SMA после девяти дней (Рисунок 4D).

figure-results-1
Рисунок 1. Tie2-GFP-положительных клеток ко-локализуются с CD31 в эмбриональных и взрослых сердечных клапанов. Иммунофлуоресцентное показать ассоциацию (Tie2-) выражения GFP (A, B) с эндотелиальных клеток маркера, CD31 (C, D) в Индекс Septal листовки митрального клапана в E14.5 (A, C, E) и взрослого (B, D, F) этапы. Регион клапан выделены A, C, E. (E, F) Присоединил изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2 Tie2-GFP-положительные ЗВТ можно определить по FACS. Сравнению с возраста из контрольной группы C57 / BL6 (А, С), клапаны, выделенные из эмбрионов Tie2-GFP (B) и взрослых (D) содержит явное GFP- положительное популяция клеток, как указано в зеленый. GFP-отрицательный события, показанные в красном были собраны в качестве контроля. Числа в (В) и (D) показывают среднее% от GFP-рositive клетки от общего числа событий, отсортированных по FACS (п = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рис.3 GFP-позитивные клетки обогащенный для маркеров эндотелиальной клеток, тогда как GFP-негативные клетки экспрессируют гены, связанные с клапанов интерстициальных клеток. Представитель КПЦР маркеров эндотелиальной клеток (CD31, фактор Виллебранда (ФВ)) и взрослых (Myh6) и плода ( MYH7) миоцитов маркеры в GFP-положительных клеток, выделенных из клапанных областей E14.5 (А) и взрослых (B) мышей Tie-2-GFP. Примечание обогащение эндотелиальных маркеров клеток и очень низким уровнем миоцитов генов, ассоциированных с. (C, D) Сложите чаНГРЭС в выражении клапанов интерстициальных маркеров клеток α-SMA и Postn в изолированных GFP-негативные клетки от E14.5 (C) и взрослых (D) мышей Tie-2-GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4 Tie2-GFP-положительных клеток поддерживать экспрессию маркеров эндотелиальной клеток в пробирке. Читает FACS, GFP положительные (A, C) и отрицательный (B, D) клеточных популяций из взрослых мышей культивировали до сливной и подлежащих фазового контраста изображений (A, B) и люминесцентные иммуноокрашивание (C, D). GFP-положительных клеток выразить CD31 (красный) (С) после10 дней культуры. В отличие от этого, экспрессия GFP, не был обнаружен в отрицательной клеточной популяции, которая окрашенных положительно в течение α-SMA, маркер активированных ИКС (D).

Обсуждение

Здесь мы описываем впервые, новый способ для выделения эмбриональных и взрослых мышей ЗВТ мышей Tie-2-GFP. В то время как эта мышь линия широко используется для выделения эндотелиальных клеточных популяций, это первый отчет, показывающий селективного выделения ЗВТ. В связи с хрупкостью населения VEC, мы разработали строгие протокол, который позволяет для выделения одной ячейки GFP положительной (и GFP отрицательным) клеток из сердечных клапанов эмбриональных и взрослых мышей. По сравнению с первоначальной публикации, используя целые эмбрионы или органов от Tie-2-GFP мышей 14, мы оптимизировали коллагеназа и рассечение шаги, основанные на низкой численности этой хрупкой эндотелиальной клеточной популяции, чтобы изолировать выбора популяцию клеток.

VEC изоляция ранее сообщалось только в больших моделях животных с ограниченными генетических и молекулярно-биологических средств. Эти инструменты хорошо известны у мышей и, следовательно, в ABILITY изолировать мышиных ЗВТ позволяет расширенным набором экспериментальных конструкций, которые будут использоваться для исследований клапана сердца. Таким образом, существенным преимуществом этого подхода является то, что ЗВТ может быть выделен во времени от мышей дикого типа и модели болезни клапана и травмы. Второе преимущество состоит в том, что ЗВТ, могут быть выделены и проанализированы практически сразу после вскрытия, сохраняя характер экспрессии, которые отражают ситуацию в естественных условиях более точно. Кроме того, этот протокол изоляция достаточно для устранения клеточной культуры для расширения числа и поэтому потенциальные изменения фенотипических, вызванных окружающей средой в пробирке предотвращаются.

Несмотря новинок и экспериментальных преимуществ этого протокола, мы признаем, что ограничения все еще существуют. Во-первых, численность населения VEC в мышиных клапанов очень мала и поэтому, несколько приурочен эмбриональные пометы необходимы для того, чтобы генерировать достаточное РНК для анализа экспрессии генов. Хотя Тхис могут быть преодолены с помощью нескольких заводчиков, это может оказать влияние на применении некоторых инструментов анализа пост-изоляции. Это ограничение было непросто, особенно для установления конфлюэнтных культур GFP-положительных ЗВТ для выполнения более тщательного анализа VEC фенотипов в том числе молекулярных профилей и функциональных анализов. Поэтому мы признаем, что не все трудности были преодолены с помощью нашего подхода, но это является сферой интересов, что мы стремимся преодолеть.

Этот подход выделения ЗВТ с клапанными регионов вводит возможность загрязнения от Тай-GFP-положительных, не-клапанных эндотелиальных клеток эндокарда, или сосудистых структур в миокарда желудочков. На сегодняшний день, молекулярная отличие ЗВТ от других популяций сердечных эндотелиальных клеток не выявлено. Тем не менее энхансера гена Nfatc1 была определена и показана в частности, маркировать ЗВТ, которые непройти EMT, и никакой другой эндотелиальных клеток население в сердце 18. Как Cre модель (Nfatc1 Encre) доступен, будущие исследования могли бы использовать специфику этой линии, чтобы минимизировать риски загрязнения. В дополнение к не-клапанных Tie2-GFP- положительных клеток, всегда есть возможность загрязнения от миоцитов в точке, где листовки клапанов прикрепляются к кольцевой области септальной и росписи миокарда стен. В данных не показаны здесь, мы изначально начали исследования, чтобы изолировать ЗВТ от расчлененных клапанных регионов с использованием антител, конъюгированных шарики, покрытые анти-GFP и анти-CD31. Хотя этот подход был успешным для выделения эндотелиальных клеток, мы испытали значительное слипания клеток из соседних, не-эндотелиальных типов клеток и, следовательно, ВИНК и клетки миокарда загрязненных наш опытный образец. Это было избежать с помощью анализа FACS, как параметры были установлены, чтобы изолировать только суспензии отдельных клетокс и ПЦР-анализ для обнаружения выражение миоцитов-специфических генов контролирует этого ограничения (рисунок 3). В то время как наша загрязнение может считаться как минимальные, это остается потенциальным экспериментальная сложность которых можно было бы избежать в будущем с двойным выбором GFP и эндотелиальных маркеров поверхностных клеточных конкретных.

Используя этот протокол, мы успешно изолированных ЗВТ из эмбриональных и взрослых мышей и приведены примеры того, как этот подход может быть использован для выделения РНК и культуре клеток GFP позитивных и GFP популяций клеток отрицательно. Тем не менее, этот подход не ограничивается этими приложений и может быть использован для множества молекулярных, клеточных и функциональных подходов. Кроме того, Tie2-GFP фон может быть выведена с генетическими мышиных моделях, что позволит сравнительных исследований VEC населения в норме и патологии. Развитие этого нового методологии будет, впервые, позволяют сфокусированных исследованийизучение вклада ЗВТ в развитии клапана и обслуживания и может выявить ранее неоцененные механизмы эндотелиальной-зависимых заболеваний клапана.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Университет штата Огайо Центр Комплексная Рак Аналитический Cytometry основной комплекс, а именно Катрина Мур, для оказания технической помощи с анализа FACS. Кроме того, мы признаем, доктора Уильяма Pu и его группу за их научных знаний. Эта работа была поддержана NIH HL091878 (JL) и сердечного центра в Национальной детской больницы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 568 Козий антикрысиный IgG (H+L)Life TechnologiesA-11077
70 μ m нейлоновое сетчатое фильтрBD Falcon352350
2,5% трипсинInvitrogen LT15090-046
Бычья сыворотка альбумин (BSA), фракция V, обработанный тепловым шокомFisher ScientificBP1600-100
CD31 крысиное антитело против мышиBD Pharmingen553370
Сыворотка для цыплятInvitrogen LT16110-082
Коллагеназа ВнутривенноInvitrogen LT17104-019Приготовлен в соответствии с инструкциями производителя
DNase I, без РНКазы (10 000 единиц)Roche4716728001
EBM-2LonzaCC3156Для VEC media
EDTA, 0,5 М раствор Hoefer03-500-506
EGM2 SingleQuot, BulletkitLonzaCC-4176Для VEC media
Фетальная бычья сыворотка (FBS), термоинактивированныйгиклонSH3007103IH
сбалансированный солевой раствор Hanks (HBSS)Life Technologies14025-092
Лошадиная сывороткаInvitrogen LT16050-130
Гибридизационная печьVWR230301V
Medium 199 1XCorning cellgro10-060-CV
Параформальдегид 16% раствор ЭМ классаЭлектронная микроскопияНауки 15710
Pen/StreppingMP-BiomedICN1670049
Перманокс стерильная камера предметное стекло с крышкойThermo-Scientific177429
Фосфатно-солевой буфер, 1XCorning cellgro21-040-CV
PrimeTime Mini qPCR AssayIntegrated DNA TechnologiesActa2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystems4376600
SuperScript VILO MastermixInvitrogen LT11755050
[header]
Tie2-GFP мышиJackson Laboratories3658
Тканевые щипцы #5 11 смDumont14096
TrizolAmbion15596018
α-SMA антимышиные антитела Sigma-AldrichA2547
VECTASHIELD HardSet Монтажный носитель с DAPIVector LaboratoriesH-1500

Ссылки

  1. Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
  2. Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
  3. Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
  4. Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
  5. Hinton, R. B. Jr Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
  6. Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
  7. Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
  8. Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
  9. Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
  10. Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
  11. Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2010).
  12. Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
  13. Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
  14. Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
  15. Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
  16. Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
  17. Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
  18. Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).

Перепечатки и разрешения

Теги

Изоляция клапанов мышидиссекция сердечного клапанасортировка эндотелиальных клетоксортировка клеток с помощью флуоресцентно-активированного сортерамыши Tie2-GFPэндотелиальные маркерыэкспрессия CD31интерстициальные клетки клапанаэмбриональные клетки клапана
Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.