Методическая статья

Использование микромасштабных кремниевые зонды для оценки Сотовый сократительной функции In Vitro

DOI:

10.3791/51866

⸱

3 октября 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1NanoScience Technology Center, University of Central Florida

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает использование микромасштабных кремниевых кантилеверов, гибких культуры поверхностей для измерения сократимость мышечных клеток в пробирке. Сотовый сокращение вызывает изгиба кантилевера, которое может быть измерено, записанного, и превращается в считываниями силы, обеспечивая неинвазивный и масштабируемую систему для измерения сократительной функции в пробирке.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развитие более интеллектуального и биологически соответствующих в пробирке анализов основывается на продвижении универсальных системах клеточных культур, которые облегчают функциональную оценку посеянных клеток. С этой целью, микромасштабная технологии консольные предлагает платформу, с которой для измерения функциональность сократительную диапазоне типов клеток, в том числе скелетных, сердечных, и гладкомышечных клеток, путем оценки сокращения, вызванного субстратом изгиба. Применение мультиплексированных массивов консольных предоставляет средства для разработки протоколов умеренной до высокой пропускной оценки эффективности лекарственного средства и токсичности, фенотип болезни и прогрессирования, а также нервно-мышечных и других межклеточных взаимодействий. Эта рукопись предоставляет детали для изготовления надежных массивов консольные для этой цели, и методы, необходимые для успешного культивирования клетки на этих поверхностях. Далее краткое описание приведено на ряд шагов, необходимых для выполнения приллиз типов сократительная клеток поддерживается на таких массивах, используя лазер нового и системы фото-детектора. Представительные данные, предоставленные моменты точность и воспроизводимость характер анализа функции возможного сократительной используя эту систему, а также широкий спектр исследований, в которой такая технология может быть применена. Успешное широкое внедрение этой системы может предоставить следователи с помощью выполнять быстрые, низкая стоимость функциональные исследования в пробирке, что приводит к более точными предсказаниями производительности тканей, развития заболевания и ответ на нового терапевтического лечения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культивирование in vitro мышечных клеток как из человеческих, так и из грызуновских источников было возможно в течение десятилетий1,2. Однако, в то время как стандартные препараты покровного стекла полезны для биохимической оценки, они не облегчают анализ первичной функциональной продукции клетки (сократительной способности) и поэтому имеют несколько ограниченную ценность в качестве средства для оценки созревания и производительности клеток. Для того, чтобы максимизировать объем данных, получаемых от таких культур in vitro, необходимо ускорить разработку систем, способных размещать такие клетки в конфигурациях, позволяющих оценивать их функциональные характеристики в режиме реального времени. Создание множества трехмерных мышечных моделей позволило добиться некоторого прогресса в удовлетворении этой потребности, и такие системы были использованы в ряде публикаций в качестве средства оценки сократительной способности культивируемых мышечных клеток in vitro3-5. Хотя такие системы бесценны для моделирования тканей и исследований по реконструкции, их применимость ограничена в их применимости для изучения реакций отдельных клеток. В тех случаях, когда необходимы исследования одного волокна, сложные и трудоемкие методологии ex vivo остаются единственным вариантом6-10. Кроме того, нынешнее движение в направлении разработки сложных, многоорганных платформ для разработки лекарств и протоколов скрининга требует создания систем, которые являются неинвазивными, легко масштабируемыми и легко интегрируются с поддерживающими клетками и тканевыми моделями.

Микромасштабные кантилеверы предлагают простой метод оценки функциональной сократительной способности одиночных клеток/малых популяций клеток12,13. Метод основан на модифицированной технологии атомно-силовой микроскопии (АСМ)14 и использует лазерную и фотодетекторную систему для измерения микромасштабного отклонения кантилевера в ответ на сократительную активность культивируемой миотрубки. Модифицированные уравнения Стоуни затем используются для расчета напряжения в миотрубке и силы, действующей на миотрубку для создания наблюдаемого прогиба субстрата15. Была написана программа сканирования, которая позволяет одновременно оценивать мультиплексные кантилеверные массивы, предлагая потенциальные приложения с умеренной и высокой пропускной способностью для исследований токсичности/эффективности лекарств15,16. Такая технология может оказаться неоценимой в разработке функциональных, доклинических анализов для прогнозирования эффективности лекарств in vivo. Кроме того, изготовление кантилеверных чипов из кремния не препятствует постаналитической обработке клеток для стандартных биомолекулярных анализов, таких как иммуноокрашивание, вестерн-блоттинг и ПЦР.

В этой рукописи содержатся подробные инструкции по изготовлению и подготовке микроразмерных кремниевых консолей, настройке аппаратного и программного обеспечения, а также рекомендации по оценке функциональности сократительных клеток, культивируемых на этих чипах. Для нанесения покрытия и поддержания клеток на этих поверхностях могут быть реализованы стандартные методы культивирования клеток, поэтому любой тип сократительных клеток, для которых существуют надежные параметры культуры, должен быть легко интегрирован с этим устройством. Относительно простые параметры 2D-культуры, используемые в этой системе, упрощают интеграцию других клеточных моделей или добавление типов клеток, которые могут взаимодействовать с мышцами (например, иннервирующими нейронами), что значительно повышает применимость этой модели при разработке более сложных функциональных анализов in vitro и мультиорганных моделей систем млекопитающих.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Консольные Чип Изготовление

Иллюстрированные сведения описанных шагов изготовления предоставляются на рисунке 1.

  1. Поместите кремний-на-изоляторе (SOI) пластин в духовку и выпекать при 125 ° С в течение 20 мин для обезвоживания их.
  2. Депозит толстый слой оксида кремния 1,5 мкм на ручки слоем обезвоженного SOI пластины с использованием усиленного плазмой отложение химического пара (PECVD) инструмент.
  3. Поместите пластину на спин нанесения покрытий патрона с уровня устройств вверх. Обеспечить пластина по центру, обойтись 2 мл P20 грунтовки по центру пластины, и спина в 3000 оборотах в минуту в течение 60 сек при ускорении 1000 об / сек. P20 праймер способствует адгезии фоторезиста на слое устройства.
  4. В то время как пластина по-прежнему на спин нанесения покрытий патрона, обойтись 2 мл S1818 фоторезиста по центру пластины, и спина в 3000 оборотах в минуту в течение 60 с с ускорением 1000 об / сек до выводаbtain толстый слой фоторезиста 1,5 мкм.
  5. Поместите пластину на горячей плите и выполнить мягкую запекать при 115 ° С в течение 1 мин.
  6. Выполните жесткий контакт воздействие УФ лучей, используя фотолитографии контактную маски выпрямитель для того, чтобы передать картину от консольной маски для фоторезиста на уровне устройств. Рассчитайте время экспозиции на основе энергетической ценности экспозиции 125 мДж / см 2 для S1818 фоторезиста.
  7. Разработка фоторезиста путем погружения пластины в 726 MIF фоторезиста разработчика в течение 1 мин при осторожном встряхивании пластины назад и вперед.
  8. Промыть пластины деионизированной (ДИ) водой и высушите его, предпочтительно с помощью инструмента спин полоскания сушилка (SRD).
  9. Удалить фоторезиста от края пластины (до 5 мм от края) с помощью ватного тампона, смоченного в ацетоне.
  10. Загрузите пластины в Deep Reactive Ion Etch (DRIE) инструмента, с фоторезиста стороной вверх, и запустить рецепт для травления узорной кремниевый слой через девисе слой. Скрытой оксидной слой функционирует как травление, так что выполнить травление с 50% до 100% более циклов, чем ожидается, будет необходимо обеспечить полное травления.
  11. Поместите пластину в горячем растворе фоторезиста бане в течение 20 мин, чтобы лишить фоторезиста. Перенести пластины к быстрому-самосвала ополаскивателем (QDR) для полоскания пластины с дистиллированной водой. После фоторезиста полосу, загрузите пластины в инструменте SRD полоскать и сушить пластины. Осмотрите пластину под микроскопом, чтобы обеспечить появляется картина консольные, как ожидалось.
  12. Депозит толстый слой не-легированного оксида кремния 1 мкм на уровне устройств пластины с помощью инструмента PECVD. Этот оксидный слой действует как защитный слой для консолей в ходе дальнейших стадий обработки.
  13. Поместите пластины на спине нанесения покрытий патрона с ручкой слоя, обращенной вверх, чтобы начать обработку задней стороне пластины. Убедитесь, пластина по центру, обойтись 2 мл P20 грунтовки по центру пластины, и спина в 3000 оборотов в минутув течение 60 с с ускорением 1000 об / сек.
  14. В то время как пластина по-прежнему на спин нанесения покрытий патрона, обойтись 2 мл SPR220-4.5 фоторезиста на центр пластины, и спина в 2000 оборотах в минуту в течение 45 сек при ускорении 1000 оборотов в минуту / с, чтобы получить толстый слой 6,5 мкм фоторезиста.
  15. Поместите пластину на близости горячей плите выполнять программный запекать при 115 ° С в течение 2 мин.
  16. Использование фотолитографии контактную выпрямитель способен передней / задней выравнивания, выравнивания окна задней маску к парадной картины сторона кантилевера и выполнения аппаратного контактную воздействие УФ лучей для передачи образец от маски окна задней фоторезисту на ручке слоя. Используйте время экспозиции рассчитывается на основе энергетической ценности экспозиции 480 мДж / см 2 для SPR220-4.5 фоторезиста.
  17. После УФ-облучения, пусть вафли остаются в темноте в течение 30 мин до начала следующего этапа обработки.
  18. Разработка фоторезиста путем погружения пластины в726 MIF фоторезиста разработчиком в течение 2 мин при осторожном встряхивании пластины назад и вперед.
  19. Промыть пластины деионизированной (ДИ) водой и высушите его, предпочтительно с помощью инструмента спин полоскания сушилка (SRD).
  20. Поместите пластины в сушильном шкафу при 90 ° С в течение 12 часов.
  21. Протравите оксида кремния слой на обратной стороне подложки с использованием системы с RIE фторсодержащих газов и рецепт для травления оксида. Оксид рисунком на задней стороне пластины действует в качестве маски травления для дальнейшей обработки. Проверьте пластины под микроскопом, чтобы гарантировать, что оксид кремния в открытой окна полностью травлению.
  22. Удалить фоторезиста на краю пластины (до 5 мм от края), используя чистую номера тампоном, смоченным в ацетоне.
  23. Загрузите пластины в DRIE инструмента с и запустить рецепт для травления узорной ручкой слой на глубину 500 мкм с погребенной функционирования оксидного слоя в качестве травление. Сплит этот травления на несколько трасс для предотвращения чрезмерного нагревавафельные, который вызывает противоречивую травление кремния. Этот шаг травление полностью удаляет кремний зоне под консолями.
  24. Выполните влажную шаг травления с использованием 25% разбавленный ВЧ травителя, чтобы лишить похоронили оксидного слоя ниже консолей и защитный слой оксида на вершине консолей.
    Примечание: Этот шаг освобождает нижней поверхности кремниевых кантилеверов, а также открывает окно внизу, чтобы обеспечить доступ для зондирования кантилевера с лазером.
  25. Промыть пластины, используя серию DI водяные бани и тщательно просушите азотом. Поскольку консоли поддерживаются только на своих базах, не используйте силовые брызги дистиллированной водой или инертным газом непосредственно на консолях.
  26. Клив отдельные чипы от пластины вдоль скола линии, возникающие во время стадии ручка слой травления.

2 Культура клеток

  1. Подготовьте 13F покровные согласно ранее опубликованным методов 17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если 13F бухтаrslips не доступны, любой гидрофобная поверхность с краевым углом выше 95 ° может быть использован.
  2. Стерилизовать консольные фишки и 13F покровные в 70% растворе этанола и дайте высохнуть на воздухе в капюшоне потока.
  3. Место отдельных чипов консольные на верхней части 13F покровные внутри стандартного 12-луночного планшета.
  4. Покрывают консоли с биополимера или модификации поверхности, оптимизированной для типа клеток используется в соответствии со стандартными протоколами клеточных культур.
  5. Повторное приостановить клеток в их конкретной среде роста до желаемой концентрации.
    Примечание: Этот протокол может привести к значительному числу падающих клеток через окно кантилевера, а не прилипших к желаемой поверхности кантилевера. Поэтому Клеточные препараты должны быть сделаны 3-4x более концентрированный, чем для стандартных препаратов покровное. Например, посев скелетной мышце крысы сателлитных клеток, как правило, проводят с использованием плотности посева от 500 до 700 клеток / мм квадрат 15,16, И могут быть использованы с консольными подложки при 2000 клеток / кв мм. Оптимизация эксперименты следует проводить с новыми источниками клеток, чтобы установить соответствующую плотности посева.
  6. Внесите 200 мкл клеточной суспензии на поверхность кантилевера чипа, обеспечивая пузырь среды охватывает консольные окна полностью. Если среда фитили через окно и не образует статическое пузырь в верхней части консолей заменить покровное 13F и повторить попытку в покрытие.
  7. Передача пластину, содержащую фишки в инкубаторе и позволяют клетки придерживаться в течение по крайней мере 1 ч (предпочтительно 2-3 ч).
  8. После этого периода покрытия, используют стерильные щипцы для передачи чип на чистую скважины, без покровного 13F и долить культуру с 1 мл ростовой среды.
  9. Вернуться пластину в инкубатор.
  10. Поддерживать клетки в зависимости от их стандартного протокола для поддержания в пробирке на покровные. Для клетки скелетных мышц,выключатель состава среды, чтобы вызвать myotube образование сразу клетки сливаться будет необходимо.

3 Настройка оборудования и программного обеспечения для анализа отклонений кантилевера

  1. Поставьте подогревом культуры блюдо в стадию вертикальном электрофизиологии микроскопом.
  2. Добавить 3 мл среды, питающих клеток, суспендированных в настоящее время (+ 10 мМ HEPES) к нагретой столике микроскопа.
  3. Установите электроды из нержавеющей стали на внутренней нагретой блюдо культуры на расстоянии не 15 мм и соединить их с генератором импульсов, способных производить поле стимуляции импульсы разной интенсивности, частоты и формы сигнала, чтобы позволить системе выдавать поля стимуляции клеток, когда это необходимо.
  4. Болт лазер гелий-неоновый, установленный на этапах поступательных XY, к нижней части таблицы микроскопа и регулировать его таким образом, что лазерный луч направляется через основание нагретой чашки для культивирования при 30 ° угла Relativ вэлектронной плоскости кантилевера.
  5. Болт квадранта модуль фото-детектора, установленный на этапах трансляционных XY, к нижней столик микроскопа и отрегулировать положение так, что отраженные земли лазерный луч в центре 4 квадрантов. Рисунок 2 представлен обзор аппаратных средств, созданной необходимы для осуществления, описанный протокол.
  6. Написать программу для управления линейные приводы, которые сканируют через консолей. Напишите программу со ссылкой на блок-схеме, представленной на рисунке 3. Графический интерфейс запрограммирован для использования с этой системы обеспечивается на рисунке 4.

4 Запись кантилевера данных

  1. Включите аппаратного анализа консольные и соответствующего программного обеспечения.
  2. Вставьте подогревом этап термистор в среде и ждать его, чтобы прочитать 37 ° C.
  3. Вставьте чип консольную в сцене с cantileveRS ориентированные на правой стороне сцены.
  4. Включение источника света микроскопа.
  5. Фокус микроскоп, чтобы принести края консолей в поле зрения и использовать программное обеспечение управления лазерной / фото-детектор позиционировать лазерный луч на кончике кантилевера 1 ПРИМЕЧАНИЕ: Если предположить, что консолей ориентированы справа от сцены, консольного 1 является один расположен в левой верхней части массива и числа бегут к 16 в левом нижнем углу. Консольные 17 находится в верхнем правом положении и работает до 32 в правом нижнем углу (рисунок 5А).
  6. Нажмите "играть" на программное обеспечение для записи.
  7. Поместите фотодетектора таким образом, что сигнал считывает "0" в обоих х и у кадров, регулируя шаговых двигателей, контролирующие фотодетектора.
  8. Установите консольные 1 позиция в программном обеспечении управления лазерной / фото-детектор (Рисунок 4).
  9. Перемещение лазер на кончике кантилевера 16, повторите шаг 4,7., И установить cantilevэ 16 позиция в программном обеспечении управления лазерной / фото-детектора.
  10. Перемещение лазер на кончике кантилевера 32, повторите шаг 4,7., И установить консольные 32 позицию в программном обеспечении управления лазерной / фото-детектора.
  11. Перемещение лазер на кончике кантилевера 17, повторите шаг 4,7., И установить консольные 17 позицию в программном обеспечении управления лазерной / фото-детектора.
  12. Выключите источник микроскоп света и верхний свет в лаборатории.
  13. Нажмите "запись" на программное обеспечение для записи.
  14. Установите генератор импульсов оборудования до 40 мс, 5 V импульсов с частотой 1 Гц, и включите устройство.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании, использовать оптимизированные протоколы стимуляции для конкретных источников клеток в этой точке, указанные параметры руководящие принципы, основанные на собранных данных, используя человека и грызунов клетки источники 12,13,15,16.
  15. С помощью программного обеспечения управления лазерной / фото-детектор, установить оборудование для сканирования через массив 32 кантилевера, останавливаясь в течение 5 сек на каждый наэ.
  16. Когда сканирование из 32 консолей завершена, выключите стимулятор, затем остановите программное обеспечение для записи и воспитывать файл данных.
  17. Изучите графической кривой от каждой консоли для доказательства сократительной активности. Запишите каждого кантилевера с положительных ответов. Сжатие определяется как пика, если отклонение составляет по меньшей мере 0,1 В выше базовой линии.
  18. Удалите все не отвечающих консолей из протокола сканирования на программное обеспечение управления лазерной / фото-детектора.
  19. Активные консоли могут быть повторно сканировать без стимуляции, чтобы получить чтение спонтанной сократительной активности клетки.
  20. Запустите сканирование с или без широкого поля электрической стимуляции, после добавления терапевтического соединения в среду для того, чтобы наблюдать его влияние на функциональное выходе культивируемых клеток.
  21. Провести усталость оценки электрически стимулируя клетки в течение длительных периодов и уровней сканирования центральным замком actility измерить, сколько времени потребуется для достижения максимальной силы, чтобы опуститься ниже определенного порога.
  22. В экспериментах, где двигательные нейроны, поддерживаемых в совместной культуре с мышцей, измерения образование нервно-мышечном соединении через лечения мотонейронов-myotube консольных совместных культурах нейронов с стимулятор (например, глутамат) или ингибитор синаптическую (например, D-тубокурарин) и сканирование по увеличение и уменьшение спонтанной активности соответственно 16.
  23. Выполните конкретные сканирования как продиктованные потребностями запланированных экспериментов.

5 Анализ отклонений кантилевера данных

  1. Использование модифицированных уравнений Стони 15 (подробно изложено ниже) для преобразования необработанных данных кантилевера (в вольтах) в считывании напряжения в слое клеток или myotube (в Па), и прямого измерения сотовой силы сокращения (в нано-ньютонов):
    объявление / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Уравнение 1
    figure-protocol-1 Уравнение 2
  2. Где δ = кантилевера наконечник и стресс производится по myotube, σ с = стресс производится по myotube, в предположении равномерного Толстопленочный всю ширину кантилевера, C детектора = коэффициент система конкретных относящиеся напряжение лазерного позиции на фотографию -detector, θ = угол лазерного и детектора по отношению к плоскости кантилевера, Е Si = модуль упругости кремния, т Si = толщин кантилевера, П = толщина myotube, V = Si соотношение по poison кремния, L = длина консольные, длина P = путь лазера от консольной кончика до детектора, и ш рисунке 6.
  3. Если предположить, что myotube является однородная пленка, сила в myotube равна силе в фильме, что приводит к уравнению 3, приравнивая расчет силы от стресса и область предполагается кросс клеток сечения, который был использован для нанесения Стони Уравнение.
    figure-protocol-2 Уравнение 3
  4. После сбора функциональной данных, исправить консольные чипы для иммуноцитохимического анализа или использовать клетки для белка или ДНК-анализа с использованием стандартных методов.
  5. При желании, вернуть клетки в инкубатор, а не готовится к молекулярного анализа для того, чтобы переоценить эксплуатационные качества на более поздний временной точке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешная культура сократительных клеток на консолях является относительно простой процедурой, с использованием стандартных методов культивирования клеток (рисунок 5). Процент консолей, поддерживающих договаривающиеся клетки будут варьироваться в зависимости от типа клеток рассматривается и конкретные методы культура используется. Использование первичных эмбриональных клеток крысы, полученных из задних конечностей, сократительной активности был обнаружен на 12% обследованных консолей (N = 4). Анализ сокр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги в анализе микромасштабной консолей для доказательства сотовой сокращения являются размещение чипа консольной в столике микроскопа, и последующее выравнивание лазера и фотодетектора с наконечником из угловых консолей в массиве. Если это не будет сделано точно, то программное обеспечение не сможет экстраполировать позиции остальных консолей в массиве, что потенциально ведет к накоплению ложных негативов во время сбора данных. Операторы должны позаботиться о том, что чип консольные лежит на одном уровне с ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было профинансировано Национальным институтом номера грантов Здоровье R01NS050452 и R01EB009429. Изготовление консольных чипов была выполнена внешне сотрудниками в нанофабрикацию фонда, расположенного в Корнельском университете. Все оборудование, используемое в процессе изготовления кантилевера был расположен в этом учреждении. Отдельное спасибо Мэнди Эш и Жан-Матье Prot за помощь с консольной микро-производства. Видео анимация функциональности консольной был создан Карлом Хьюз, Алекс Зеленин и Эрик Imperiale из синтетической реальности Lab на УКУ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Первичная среда
Нейробазальная средаLife Technologies21103-049
B27 (50x)Life Technologies175040441x
Глутамакс (100x)Life Technologies350500611x
добавка G5Life Technologies17503-0121x
Глиальное происхождение Нейротрофический факторКлеточные наукиCRG400B20 нг/мл
Нейротрофический фактор мозгаКлеточные наукиCRB600B20 нг/мл
Цилиарный нейротрофический факторКлеточные наукиCRC400A40 нг/мл
Нейротрофин-3Клеточные наукиCRN500B20 нг/мл
Нейротрофин-4Клеточные наукиCRN501B20 нг/мл
Фактор роста кислотных фибробластовLife Technologies13241-013 25 нг/мл
Кардиотропин-1Клеточные наукиCRC700B20 нг/мл
гепарина сульфатаSigmaD9809 100 нг/мл
Фактор ингибирования лейкемииSigmaL5158 20 нг/мл
ВитронектинSigmaV0132100 нг/мл
Первичная среда
крысы NB Activ 4Brain Bits LLCNB4-500
Оборудование
класса 2 красный диодный лазерNewport
ФотодетекторNoah Industries
Model 2100 Pulse стимуляторА-М системы
Multiclamp 700B ДигитайзерAxon Instruments
Патч-хомут микроскоп и столикOlympus
Delta T4 контроллер чашки для культурBioptechs
Молекулярные устройства
LabVIEW программное обеспечениеNational Instruments
37 oC, 5% CO2NAPCO
Class 2 микробиологический проточный колпакLabconco
Pipettes and tipsEppendorf
для роста мышц крысыдля дифференцировки мышц Программное обеспечение аксоскопа инкубатор

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
  2. Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
  3. Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
  4. Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
  5. Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
  6. Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
  7. Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
  8. Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
  9. Edman, K. A. Contractile performance of striated muscle. Advances in experimental medicine and biology. 682, 7-40 (2010).
  10. Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
  11. Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
  12. Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
  13. Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
  14. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
  15. Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108(2013).
  16. Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
  17. Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
  18. Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
  19. Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
  20. Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
  21. Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
  22. Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
  23. Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
  24. Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
  25. Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
  26. Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
  27. Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
  28. Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643(2010).
  29. Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
  30. Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
  31. Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи