Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстрое Генотипирование животных Круги путем создания первичных культурах мозга нейронов

16.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51879

⸱

29 января 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем процедуры для маркировки и генотипирования новорожденных мышей и генерации первичных нейронов культур от них. Генотипирование является быстрым, эффективным и надежным, и позволяет для автоматического нуклеиновых кислот добычи. Это особенно полезно для неонатально летальных мышей и их культур, которые требуют предварительного завершения генотипирования.

Аннотация

Высокое разрешение анализ морфологии и функции нейронов млекопитающих часто требует генотипирование индивидуальных животных с последующим анализом первичных культурах нейронов. Мы описываем набор процедур для: маркировка новорожденных мышей генотипировать, быстрый генотипирование, а также создание низкой плотности культуры мозга нейронов этих мышей. Индивидуальные мышей помечены татуировки, которая позволяет для долгосрочного идентификации прочного во взрослую жизнь. Генотипирование с помощью описанного протокола является быстрым и эффективным, а также позволяет для автоматического извлечения нуклеиновой кислоты с хорошей надежности. Это полезно в условиях, когда достаточно времени для обычного генотипирования недоступен, например, у мышей, которые страдают от новорожденных летальности. Первичные культуры нейронов генерируются при низкой плотности, что позволяет эксперименты изображений с высоким пространственным разрешением. Этот метод культура требует подготовки глиальных слоев фидерных до нейронов покрытия. Рrotocol применяется в полном объеме в мышиной модели в двигательные расстройства DYT1 дистонии (Е-torsinA плей-у мышей), а нейронные культуры готовят из гиппокампа, коры головного мозга и полосатом теле этих мышей. Этот протокол может быть применен к мышей с другими генетических мутаций, а также животных других видов. Кроме того, отдельные компоненты протокола могут быть использованы для изоляции суб-проектов. Таким образом, этот протокол будет иметь широкое применение не только в неврологии, но и в других областях биологических и медицинских наук.

Введение

Моделях грызунов генетических заболеваний оказались полезными в установлении физиологических функций нормальных белков и нуклеиновых кислот, а также в патофизиологических последствий дефектов в них. Примеры включают мышей, дефицитных по белков, участвующих в ключевых клеточных функций, а также мышиные модели заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Тем не менее, некоторые генетические манипуляции могут привести к неонатальной смертности в ближайшее время или через несколько дней после рождения. В этих случаях, первичные культуры клеток являются важным инструментом, потому что живые клетки могут быть получены из эмбриональных или новорожденных щенков до смерти, они могут сохраняться в течение по крайней мере нескольких недель в пробирке, и в течение этого времени в начале развития нейронов может сопровождаться биохимические, функциональные и морфологические эксперименты. Для первичных культур, то может быть выгодно, чтобы пластины нейроны при низкой плотности; это позволяет визуализировать отдельные somata, дендриты, аксональные валы и нервных TERMIналов с высоким пространственным разрешением. Тем не менее, выживание и дифференциацию нейронов при низкой плотности, как правило, требует, чтобы они помещают на глиальных фидерного слоя, совместно культивировали с глиальных клеток в отсутствии физического контакта с ними, или культивировали в среде обусловлено глии 1.

Создание нейронных культур с низкой плотностью на глиальных слоев фидерных может зависеть от быстрого и надежного генотипирования заранее - в течение нескольких часов, в отличие от нескольких дней. Скорость особенно важно, когда генотип нейронов должно быть согласовано с, что из глиальной фидерного слоя, полученного заранее. В более практическом примере, это может быть необходимо, чтобы определить, какие щенки которых генотип для использования в генерирующих культур, чтобы оптимизировать эффективность эксперимента.

Здесь мы показываем, рабочий протокол, который был использован для быстрого, упрощенного и надежного генотипирования мыши в предыдущих публикациях 2-6. Хвосты мышь икоммерчески доступного набора используются. Этот протокол включает в себя пошаговое извлечение нуклеиновых кислот из тканей, и не требует ни стадии очистки нуклеиновой кислоты, ни использование окончания буфера ('универсальное решение »). Надежность этого метода генотипирования иллюстрируется представляя результаты серии тестов, когда различия вводятся в отношении исходного количества образцов, возраст животных и длину ампликонов ПЦР. Этот набор предлагает преимущества автоматизированной добычи и надежности.

Ради того, чтобы быть всеобъемлющим, использование татуировки для долгосрочного идентификации генотипированных мышей также показали. Татуировки достигается путем применения татуировки чернила в дерму кожи (под эпидермисом) 7. Процедура описана для татуировки подушечки лап новорожденных или 1 день старых мышей, хотя татуировки могут быть применены к другим частям тела, таких как хвосты и ног, а также AnimALS всех возрастов. Кроме того, процедуры будут продемонстрированы на покрытие и культивирование нейронов мыши при низкой плотности на основе оптимизированной подготовки различных типов глиальных фидерных слоях 2,8.

Мы используем генетический модель мыши наследуемого неврологического расстройства DYT1 дистонии - аутосомно-доминантное заболевание, движение, вызванное мутацией в гене TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Кодируемый белок, torsinA, принадлежит к «АТФаз, связанных с различными клеточными деятельности" (AAA +) семейства белков, члены которого в целом выполняет шаперон-как функции, помогая в: разворачивания белка, белка-комплекс разборки, торговля мембраны и слияния пузырьков 10-13. Мутация в в рамке удаления кодона для глутаминовой кислоты, что может привести к проявлению "раннего начала обобщенной изолированные дистония» 14,15. Тем не менее, путьophysiological механизмы, ответственные за этого расстройства остаются плохо понял. В детонации в мышиной модели, мутантный аллель является Tor1a tm2Wtd, указанными ниже, как Tor1a & Delta; E. Гетерозиготная & Delta; Е-torsinA плей-у мышей являются жизнеспособными и генетически мимические пациентов-людей с DYT1 дистонии, в то время как гомозиготные стучать в мыши погибают после рождения 16,17, с задержкой в послеродовой смерти, пострадавших от генетического фона 18. Ранняя смерть гомозиготной нокаут-мышей требует, чтобы оба генотипирование животных и создание нейронных культур быстро завершена. В качестве другого примера генотипирования Tfap2a (транскрипционный фактор AP-2α, активизируя усилитель связывания белка 2α) будет использоваться. Белок, кодируемый этим геном играет важную роль в регулировании многочисленных клеточных процессов, таких как пролиферации, дифференцировки, выживания и апоптоза 19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных, проведенные в этом исследовании, были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных из Университета Айовы мимо.

1. Долгосрочный Идентификация мышей с использованием Татуировка подушечки лап

  1. Остановите лапу с подушечек лап (подошвенной поверхности) с видом на экспериментатора. Держите лапу с большим и указательным пальцем. Будьте осторожны, чтобы не прищемить лапу.
    Примечание: Стабильный иммобилизации важно, чтобы гарантировать, что татуировки пигмента помещают в дерму лапы площадки, и, таким образом, является постоянным 7.
  2. Тампон подушечек лап с 70% этанола на марлевую губкой или тампоном.
  3. Смажьте маслом кожи на ватным аппликатором и аккуратно нажмите наконечником против поверхности подушечек лап несколько раз. Используйте только небольшое количество масла на кожу; если они присутствуют в больших количествах, это предотвратит пигмент татуировки от достижения кожу.
  4. Опустите кончики иглы татуировки в татуировки чернила непосредственно переддля татуировки. Используйте чистую, асептики и острые татуировок иглы, чтобы уменьшить боль и возможность заражения, а также для повышения эффективности татуировки.
  5. В то время как поверхность подушечек лап покрыта маслом кожи, нажмите кончики татуировки иглы вертикально и слегка против кожи в центре подушечек лап, и придать чернилам несколько раз. См таблицу материалов / Оборудование для получения информации о электрической системы татуировки.
  6. Спрей 70% этанола на марлевую губкой, слегка прижать ее лапой, чтобы удалить лишний пигмент татуировки на поверхности кожи, и проверить качество татуировки. Убедитесь, что середина подушечек лап имеет темный, круглое пятно, которое отличается от обычного пигментации кожи. Если татуировка не темный или достаточно большой для удобного просмотра, повторите предыдущие шаги для татуировок.

2. генотипирование новорожденных мышей с помощью быстрого набора ПЦР Genotyping

  1. Лечить дистального конца хвоста мыши с 70% этанола, вырезать 5 мм или меньше хвостчаевые и передать его на трубе 8-трубки полосы типа, используемого для ПЦР. Используйте Во-лезвие для каждого щенка, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами. В качестве альтернативы, использовать ножницы, но в этом случае, осторожно и тщательно удалить оставшуюся ткань на лопасти с использованием 70% этанола. Проверьте кровотечение. Если кровотечение происходит, оказать давление на отрезаемой части хвоста с марлевой губкой, пока кровотечение не остановилось.
  2. Добавить 200 мкл экстракционного раствора ДНК в каждой ПЦР пробирки, содержащей образец. См таблицу материалов / Оборудование по своему составу и информацию о наборе.
  3. Поместите полосу пробки в ПЦР термоциклер, и начать добычу ДНК с помощью следующей программы: 1 цикл при 55 ° С в течение 10 мин, 1 цикл при 95 ° С в течение 10 мин, а выдержка при температуре 4 ° С.
    Примечание: Это то же самое ПЦР термоциклер, который затем используется для ПЦР.
  4. После выделения ДНК закончена, снимите полосками из термоциклера ай инвертировать 5 раз.
  5. Передача 4 мкл раствора (экстракта ДНК) каждого образца неиспользованной трубки из полосы 8-трубки, и смешать с: 10 мкл 2X PCR Ready Mix II, 2 мкл смешанного вперед и обратного праймеров (рекомендуется 0,5 мкм, см таблицу материалов / Оборудование для последовательностей), и 4 мкл нуклеазы без H 2 O, для каждого образца. Спин кратко (например, 3 сек), используя настольный центрифуги. Держите труб на льду во все времена, за исключением во время эксплуатации.
  6. Выполните Амплифицируйте. Увидеть Таблица Материалы / Оборудование для термической программы.
  7. Обнаружение амплифицированных продуктов ДНК. Загрузите полную реакционного раствора из ПЦР (20 мкл) непосредственно в скважине агарозном геле. Загрузка маркеров молекулярной массы в отдельную лунку. Применить электрическое поле.
  8. Приобретать флуоресцентные изображения полос в ультрафиолетовом свете.

3. Первичная культура мозга мыши Нейронс на глиальные фидерного слоя

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры для вскрытия головного мозга и клеток диссоциации (3.1) являются общими для всех последующих процедур. Процедуры для мыши глиальных культур (3,2), крысы глиальные культуры (3,3) и мышь нейронов культуры (3,4) описаны отдельно после этого.

  1. Мозг Вскрытие и сотовых Dissocaiation
    1. Пожертвовать одним мыши или крысы щенка путем обезглавливания, быстро удалить мозг, и поместить его в раствор Хэнкса (см таблицу 1 для определения состава) + 20% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в 35 мм блюдо (хранили на льду).
    2. Разрежьте мозг через срединной линии на два полушария. Удалить область интереса (например, кора головного мозга, полосатом теле и гиппокампе) от каждого полушария головного мозга. Удалить мозговых оболочек и крупных кровеносных сосудов с поверхности. Вырезать область мозга, в 4-10 тонкими ломтиками с помощью хирургического ножа.
    3. Промыть срезах мозга в 15 мл центрифужную пробирку, когда именно"Решение + 20% FBS, затем 3 раза с Хэнкса 'H Хэнкс решение (т.е. без сыворотки) (все при 4 ° С). Для полоскания, добавить 5-10 мл раствора, пусть мозг ломтики оседают на дне пробирки, аспирации раствора из верхней части, а также добавить свежий раствор. Закончить полоскания процедуру аспирации решение.
    4. Фильтр 2 мл трипсина раствора, содержащего пищеварения (см таблицу 1 для композиции) с помощью шприца 3 мл и шприцевой фильтр 0,2 мкм, и фильтрат добавляют непосредственно в пробирку, содержащую в срезах мозга. Пусть трипсинизации продолжаться в течение 13 мин при комнатной температуре.
    5. Нейтрализовать раствор трипсина, первый путем аспирации большинство из них, а затем добавлением 7-10 мл раствора Хэнкса + 20% FBS (4 ° С).
    6. Промыть срезах мозга, дважды раствором Хэнкса + 20% FBS, и затем три раза с раствором Хэнкса (т.е. без сыворотки) (все при 4 ° С). Закончить полоскания процедуру аспирации Solutиона.
    7. Фильтр 2 мл диссоциации раствора (см Таблицу 1 композиции) с помощью шприца 3 мл, шприц 0,2 мкм фильтр и добавить фильтрата непосредственно к трубе с кусочками мозга.
    8. Механически отделить клетки мягко растирая в 10-20 раз, до тех пор, видимые части ткани не исчезнут. Используйте ватными пробками, огневой полировкой пипетки Пастера и избежать пузырей во время растирания.
    9. Подождите 3 мин для маленьких кусочков, чтобы успокоиться.
    10. Передача большинство раствора (~ 1,5 мл, в результате чего какое-то решение внизу) в 15 мл центрифужную пробирку, которая содержит 3 мл раствора Хэнкса + 20% FBS, раствор (4 ° C), с помощью ватными пробками, пожаро- полированный пипетки Пастера. Не передавать весь раствор, так как включение любого осадка на дне, как правило, приводит к ухудшению культуры.
    11. Центрифуга 13 мин при ~ 185 г (~ 1100 оборотов в минуту) при 4 ° С.
    12. Аспирата супернатант осторожно,добавить 1 мл подогретого покрытие среды (37 ° С) к осадку и ресуспендируйте его, осторожно пипеткой несколько раз, используя ватными пробками, огневой полировкой пипетки Пастера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три различных типов гальванических СМИ используются для различных целей культуры: покрытие средней-1 для мыши глиальных клеток, покрытие средней 2 для нейронов мыши и покрытие среднесрочные 3 для крыс нейронов и глиальных клеток (см Таблицу 1 композиций) ,
    13. Вынуть 10 мкл клеточной суспензии, смешать его с 10 мкл 0,4% трипанового синего раствора и измеряют плотность живых клеток с использованием либо гемоцитометра или автоматизированный счетчик клеток.
  2. Мышь Глиальные культуры
    1. Вымойте покровные, чтобы помочь установить здоровые культуры клеток мыши.
      1. Погрузитесь покровные стекла (круглые, диаметром 12 мм) в 70% -ной азотной кислоты в стеклянную чашку Петри. Защищать от света с помощью алюминиевой фольги, и положите его на орбитальном шейкере O / N.
      2. Промойте стекло coversliPS В чашке Петри, по крайней мере в три раза дистиллированной водой. Погружают их в дистиллированной воде. Поместите блюдо на орбитальном шейкере O / N.
      3. Высушите покровные на Ватман 150 мм фильтровальной бумаги в кабинете биологической безопасности.
      4. Автоклав покровные.
      5. Поместите покровные в культуральной чашке 24-а.
    2. Этикетка и генотипов новорожденных мышей в соответствии с шагами 1 и 2.
    3. Получите клетки мозга от щенков мыши, в соответствии со стадией 3.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование коры головного мозга характерно для подготовки мышь глиальных фидерного слоя. Тем не менее, другие области мозга, такие как гиппокамп и полосатое тело, будет работать после соответствующей регулировки плотности клеток из-за различных чисел и выходов клеток из различных регионов.
    4. Добавить ~ 4 мл предварительно нагретого покрытие средней 1 до конечной клеточной суспензии (~ 1 мл). Для предварительного подогрева питательной среды, поместите решение в культуральной инкубатора (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, кпозволяют значения температуры и рН стабилизируется.
    5. Передача клеточной суспензии без покрытия T25 культуры колбу, используя ватными пробками, огневой полировкой пипетки Пастера. Колбу помещают в культуральную инкубаторе.
    6. В один день в пробирке (DIV), промыть культивируемые клетки в колбы Т25 дважды покрытие среднего 1 (4 ° С). Поместить колбу обратно в инкубатор. Выполнение промывки путем аспирации среды внутри колбы полностью с помощью пастеровской пипетки, добавляя ~ 5 мл свежей среды и осторожно наклоняя колбу несколько раз в вихревое движение.
    7. В 6-9 DIV (т.е., за день до трипсинизации и покрытие на стеклах, на этапах 3.2.8-3.2.13), поместите 100 мкл материала покрытия с белками внеклеточного матрикса (табл материалов / оборудования для комментариев о Материал покрытия) на покровные стекла в культуральной чашке, и место культуры блюдо в культуре инкубатора.
    8. В 7-10 DIV, когда клетки 20-40% сливной (пространственно непрерывными), Trypsinize их.
      1. Промыть колбу один раз, путем аспирации все решение в колбу и добавления ~ 13 мл раствора Хэнкса (4 ° C), осторожно наклонить колбу несколько раз в вихревое движение, и аспирации решение полностью.
      2. Добавить 40 мкл раствора ДНКазы (конечная концентрация, 750 единиц / мл) с 4 мл раствора трипсина-ЭДТА, проходят раствора через шприцевой фильтр 0,2 мкм, и фильтрат добавляют непосредственно к клеткам в колбе.
      3. Пусть трипсинизации протекать в течение 13 мин при 37 ° С в инкубаторе.
      4. Нейтрализовать трипсина путем добавления раствора 2 мл 100% FBS (4 ° C) в колбу.
      5. Передача трипсином клетки в 15 мл центрифужную пробирку с использованием 5- до 10-мл пипетки, добавьте ~ 4 мл раствора Хэнкса + 20% FBS (4 ° С), центрифуге при ~ 185 г и 4 ° С в течение 13 мин и аспирации супернатант.
    9. Ресуспендируют осадок в 1 мл предварительно Wärmed покрытие среднего 1.
    10. Измерьте плотность клеток в соответствии со стадией 3.1.13.
    11. Аспирируйте материал покрытия полностью из стекла покровные, и пластины ~ 50 мкл ресуспендированных глиальных клеток на покровные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки установит глиальных фидерного слоя.
    12. Место культуры блюдо с покровные в инкубаторе.
    13. 20-60 мин позже, добавьте 1 мл подогретого покрытие среднего 1 в каждую лунку, и поместите блюдо обратно в инкубатор. Примечание: Во время покрытие среду добавляют, это будет полезно использовать другой пипетки, чтобы нажать на периферию покровного стекла (там, где нет никаких покрытием клетки), так что покровное не будет плавать в среде.
    14. В 1 DIV в глиальных фидерного слоя (то есть, на покровным стеклом), заменить жидкость с 1 мл предварительно нагретого покрытие среднего 1, путем аспирации всех раствора в скважине, а затем заполняя его свежей средой.
    15. В 2-3 DIV глиальных фидерного слоя при челLs 80-100% сплошности, добавить ингибитор митотической (10 мкл смеси 5-фтор-2'-дезоксиуридина + уридина; конечные концентрации 81,2 и 204,8 мкм соответственно) на каждую лунку, чтобы ингибировать репликацию ДНК и, следовательно, подавить пролиферацию глиальных клеток.
    16. В 7-9 DIV, когда клетки 90-100% сливной (1-2 ч до посева нейронов на глиальные фидерного слоя), заменить культуральной среды с предварительно нагревают покрытие средней 2 (37 ° С).
      ПРИМЕЧАНИЕ: нейроны будут высевали на тот же день, используя шаг 3,4.
  3. Крыса Глиальные культуры
    1. Шерсть культуры колбу Т25 с одной и той же материала покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для последующего удаления без прикрепленных клеток на стадии 3.3.5.
      1. Добавить 2,0 мл покрывающего материала в колбу и колбу помещают в культуральную инкубаторе.
      2. После 2-3 ч, аспирации материала покрытия полностью, таким образом, что пол становится сухой колбе.
    2. Получите клеткиот крысят, согласно шагу 3.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CA3-CA1 область гиппокампа используется для подготовки глиальных подачи крыса слой. Тем не менее, другие области мозга, такие как коры головного мозга и полосатое тело, будет работать после корректировки на различия в плотности клеток из-за различных чисел и выходов клеток из различных регионов.
    3. Добавить ~ 4 мл подогретого покрытие среднего 3 до конечной суспензии клеток (~ 1 мл).
    4. Передача клеточной суспензии в покрытой культуральной колбы Т25, используя закрытые ватными пробками, огневой полировкой пипетки Пастера. Поместить колбу в культуральной инкубатор (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. В 2-3 DIV, когда клетки на 20-40% сплошности, удалить не соблюдают или слабо прилипшие клетки, закрыв крышку плотно, встряхивая колбу энергично ~ 10 раз, аспирации раствора и добавление 4-5 мл обшивки средне-3 (при 4 ° С). Повторите эту процедуру один раз. Проверьте культивируемых клеток по всей колбы этаже (например,с помощью фазового контрастного микроскопа), чтобы подтвердить, что те, которые появляются нейронов (т.е. те, для которых внешний обод тела клетки появляется фаза-яркий) полностью удаляются. Повторите процедуру так часто, как необходимо удалить эти клетки, а затем вернуться колбу в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: сила и общее число «трясет», необходимых могут отличаться среди отдельных экспериментаторов. Важно то, чтобы не держать общее количество коктейлей, чтобы заданное количество, но, чтобы подтвердить, что нейронные клетки, как будут устранены.
    6. В 6-8 DIV, когда клетки 90-100% сливающиеся, прохождение глиальных клеток от trypsinizing их, как в шаге 3.2.8.
    7. После центрифугирования, ресуспендируют осадок в 1 мл посева средний-3 (4 ° C), добавляют 10 мл металлизированный средний-3 (4 ° С), передать трипсином клетки к не-покрытием T75 колбу, и культура их в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крыса глиальные клетки пассировать дважды; В отличие от мыши глиальные клетки аре пассировать только один раз, потому что они становятся нездоровыми после нескольких пассажей. Крыса глиальные клетки будут пассируют в колбах Т75, которые не покрыты любым материалом покрытия. Покрытие обеспечивает крысы глиальные клетки расти слишком быстро, и выход многих ресничных клеток (предполагаемые эпендимные клетки), которые разрушают нейронов условиях культивирования позже.
    8. В 17-19 DIV глиальных культуры в колбе (т.е. через 11 дней после пересева и один день до обработки трипсином и покрытие на покровные с шагом 3.3.9-3.3.14), поместить 100 мкл покрывающего материала на неумытых покровные стекла ( круглый, диаметр 12 мм) в культуральной чашке, и место культуры блюдо в культуре инкубатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для глиальных культур крысы, разница не была замечена в результатах культуры с или без промывки покровные.
    9. В 18-20 DIV глиальных культуры в колбе (т.е. через 12 дней после пересева), подготовить глиальных фидерного слоя по trypsinizing культивируемых клеток, в соответствии с стEP 3.2.8.
    10. Во центрифугированием, аспирации материала покрытия полностью из покровные стекла.
    11. После центрифугирования, ресуспендируют осадок в 1 мл посева средний-3 (4 ° C), и измерить плотность клеток, в соответствии со стадией 3.1.13.
    12. Регулировка глиальных плотность 10 4 живых клеток / мл, и пластины 100 мкл суспензии клеток глии на покровные стекла с покрытием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки установит глиальных фидерного слоя.
    13. Место культуры блюдо с покровные в инкубаторе в течение 20-60 мин.
    14. Добавить 1 мл посева на среднесрочную 3 (4 ° С) в каждую лунку, и поместите блюдо обратно в инкубатор.
    15. В 3-4 DIV глиальных фидерного слоя, когда клетки на покровное 40-80% сливной, добавить 1 мл подогретого ростовой среде (см Таблицу 1 состава), который содержит цитозин β-D-арабинофуранозида ( AraC, конечная концентрация 4 мкМ), чтобы остановить распространение глиальных клеток. Plate нейронс при 7-9 DIV глиальных фидерного слоя, когда клетки 60-80% сливной, используя шаг 3,4.
  4. Мышь нейронные культуры
    1. Этикетка и генотипов новорожденных мышей в соответствии с шагами 1 и 2.
    2. Используйте щенков мыши для шага 3.1.
    3. Отрегулируйте плотность живых клеток суспензии ~ 2,0 х 10 5 клеток / мл, с помощью подогретого покрытие среднего-2 для высева на мышь глиальных клеток, или с использованием покрытие среднего 3 для высева на крыс глиальных клеток.
    4. Пластина клеток на глиальных фидерного слоя, осторожно добавив клеточной суспензии в культуральной среде в каждой лунке. Примечание: объем клеточной суспензии, чтобы быть добавленной будет определяться целевой количества клеток в культуре хорошо. Например, пластины ~ 60 мкл клеточной суспензии, чтобы достичь 12000 клеток / лунку.
    5. Обратите внимание, что никаких изменений решение не требуется после того, как нейроны покрытием. Быть осторожным, чтобы избежать испарения раствора из лунок в течение культуры, путем увлажнения внутреннего диаметраF культуры инкубатора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В качестве примера применения этого протокола, показательные результаты показаны для маркировки мышей татуировки, надежной генотипирования в различных экспериментальных условиях, а также создание первичных нейронов культур на глиальных слоев фидерных.

Татуировка

Новорожденные щенки были помечены на подушечках лап с использованием системы нанесения татуировки ('новорожденного "на рисунке 1). Этикетки оставались хорошо видны на 3 н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, представленные здесь включает в себя процедуры для татуировки для обозначения / определить мышей, для генотипирования мышей из хвостовой советы, и для культивирования нейронов мозга мыши при низкой плотности. В одном раунде экспериментов с использованием 6-8 щенков, эти процедуры, как правило, требуют ~ 0,5 ч, ~ 4 ч и ~ 2 ч, соответственно, в общей сложности 6-7 часов. Это делает его практичным для одного экспериментатора, чтобы завершить все процедуры, необходимые с момента рождения щенков »к обшивке нейронов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор (Чжэнминь Хуанг) является президентом компании EZ BioResearch LLC, производящей реагенты, описанные в этой статье.

Благодарности

Авторы благодарят исследователей из Университета Айовы, докторов Луиса Теседора, Инес Мартинс и Беверли Дэвидсон за инструкции и полезные комментарии относительно стриарных культур, а также докторов Кару Гордон, Николь Боде и Педро Гонсалес-Алегре за помощь в генотипировании и обсуждения. Мы также благодарим доктора Эрика Вейанда (Системы идентификации и маркировки животных) за полезные комментарии о татуировках, а также доктора Сютаро Кацурабаяси (Университет Фукуока) за полезные комментарии о мышиной культуре. Эта работа была поддержана грантами Американской кардиологической ассоциации, Министерства обороны (премия Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), Фонда медицинских исследований дистонии, Фонда Эдварда Маллинкродта-младшего, Национального научного фонда и Фонда Уайтхолла (N.C.H.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
РЕАГЕНТЫ - очиститель татуировочных
машинок AnimalIdentification and Marking Systems, Inc.NMCR3Используется для очистки игл и держателя после нанесения татуировки.
Машинный сушильный агентСистемы идентификации и маркировки животныхNDAR4Используется для сушки игл и держателя после очистки.
Татуировка новорожденного Черный пигментСистемы идентификации и маркировки животных, Inc.NBP01
Аппликатор для подготовки кожиСистемы идентификации и маркировки животных, Inc.Ватная палочкаNSPA1
Решение для подготовки кожиAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01Этот реагент обеспечивает тонкий слой масла, который повышает эффективность татуировки и предотвращает выцветание татуировки за счет (информация от поставщика): 1) предотвращает временное окрашивание нетатуированной кожи, тем самым позволяя легко оценить качество татуировки на подушечке лапы, прежде чем щенок будет возвращен в свою домашнюю клетку. испачканную поверхность кожи можно спутать с татуированной кожей, 2) уменьшение повреждений кожи во время нанесения татуировки; Смягчение кожи и смазка иглы поможет игле проникнуть в кожу, не вызывая ее повреждения, и 3) предотвратить попадание молекулярного кислорода в кожу, тем самым уменьшая воспалительные реакции на активные формы кислорода, которые могут генерироваться.
РЕАГЕНТЫ - генотипирование
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (формат стрип-пробирки)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100Красный, нагрузочный краситель для электрофореза входит в состав раствора 2X PCR Ready Mix.
Раствор для лизиса тканей AEZ BioResearch LLCG2001-100Приготовьте раствор для экстракции ДНК путем смешивания 20 и микро; л раствора для лизиса тканей А и 180 & микро; l раствора для лизиса тканей B на образец.
Раствор для лизиса тканей BEZ BioResearch LLCG2001-100Приготовление раствора для экстракции ДНК путем смешивания 20 и микро; л раствора для лизиса тканей А и 180 & микро; l раствора для лизиса тканей B на образец.
Уксусная кислота, ледниковаяVWR BDH3092
Агароза оптимизированная марка, молекулярная биология маркаRPIA20090-500 Мы используем 2% агарозные гели в буфере TAE, содержащем гелевый краситель SYBR Safe DNA (разбавленный в 10 000 раз) или бромид этидия (0,5 & микро; г/мл объема геля).
Бромид этидияSigma-AldrichE7637-1G
Этилендиаминтетрауксусная кислота, дигидрат соли натрия (ЭДТА)FisherBP120-500
, без аэрозоля, 0,1-10 и микро; lДот Сайнчер ИнкUG104-96RS Используйте стерильные наконечники для пипеток, не содержащие ДНК, РНКазы и ДНКазы. На всех этапах, связанных с ДНК, используйте отфильтрованные наконечники для пипеток, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Фильтрованные наконечники для пипеток, фильтрующие наконечники Premium Fit, 0,5-20 и микро; l Dot Scientific IncUG2020-RSИспользуйте стерильные наконечники для пипеток, не содержащие ДНК, РНКазы и ДНКазы. На всех этапах, связанных с ДНК, используйте отфильтрованные наконечники для пипеток, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Фильтрованные наконечники для пипеток, фильтрующие наконечники Premium Fit, 1-200 и микро; l Dot Scientific IncUG2812-RSИспользуйте стерильные наконечники для пипеток, не содержащие ДНК, РНКазы и ДНКазы. На всех этапах, связанных с ДНК, используйте отфильтрованные наконечники для пипеток, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Маркер молекулярной массы, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001Мы используем любой из этих трех маркеров молекулярной массы.
Маркер молекулярной массы, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Маркер молекулярной массы, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
ПЦР-пробирки, 8-пробирочные стрипы с индивидуально прикрепленными куполообразными верхними крышками, натуральные, 0,2 мл США Scientific1402-2900Используйте пробирки, которые являются стерильными и не содержат ДНК, РНКазы и ДНКазы. Полоска из 8 трубок проста в обращении и позволяет группировать образцы по сравнению с отдельными трубками.
Пробирки для ПЦР, Ultraflux Individual rpi145660Используйте стерильные пробирки, не содержащие ДНК, РНКазы и ДНКазы.
Тюбик для микроцентрифуги Seal-Rite 0,5 мл, натуральныйСША Scientific1605-0000Используйте пробирки, которые стерильны и не содержат ДНК, РНКазы и ДНКазы.
SYBR Safe DNA гель краситель * 10 000-кратная концентрация в DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Праймеры для амплификации гена Tor1a в Δ E-torsinA knock in мыши5'-AGT CTG TGG CTG CTC CC-3' (прямой) и 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (обратный) (ссылка 18). Эти праймеры использовались в конечной концентрации 1,0 нг/мкм; l (~0,16 &микро; М) (ссылка 2).
Праймеры для амплификации гена Tfap2a у мышей5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (прямой), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (обратный) для ампликона 498.о., 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (прямой), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GGA GAT CAT TC-3' (обратный) для ампликона 983.о., и 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (ВПЕРЕД), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (обратно) для ампликона 1990 б.о. Эти грунтовки используются при 0,5°М.
РЕАГЕНТЫ - клеточная культура
5-Фтор-2&прайм;-дезоксиуридинSigma-AldrichF0503-100MGСмотрите раздел комментариев к уридину для получения дополнительной информации.
Добавка B-27GIBCO-Invitrogen17504-044
Чашки для клеточных культур 35 x 10 мм, обработанные тканевой культуройколба BDfalcon 353001
Cell Cultures, T25, обработанные культурой тканей, скошенная горлышко, заглушка-крышка, 25 см2 зона роста, 70 млBD falcon353082
Колбы для клеточных культур, T75, обработанные тканевой культурой, скошенная горлышко, вентилируемая крышка, 75 см<суп>2 зона роста, 250 млBD falcon353136
конической трубкой, полипропилен, 15 млBD falcon352095
Countess (счетчик номеров клеток) предметные стеклакамеры GIBCO-InvitrogenC10312
Цитозин &бета;-D-арабинофуранозид гидрохлорид (Ara-C гидрохлорид)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-глюкоза (декстроза) безводная, SigmaUltra, 99,5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Тарелка, стекло Петри 100 x 15 ммPyrex3160-101
Дистиллированная водаGIBCO-Invitrogen15230-147
Днказа типа IISigma-AldrichD4527-200KUСтоковый раствор готовится из расчета 1 500 ед./20 шт; l = 75 000 ЕД/мл в дистиллированной воде.
Модифицированная орлиная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), высокий уровень глюкозы, GlutaMAX, пируватGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 мл
Fast PES Filter Unit, 250 мл, диаметр мембраны 50 мм, 0,2 и микро; m Pore SizeNalgene 568-0020
Фильтрующий блок быстрого PES, 500 мл, мембрана диаметром 90 мм, 0,2 &; m Размер порNalgene569-0020
Фетальная бычья сыворотка (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Стеклянный покровный лист, 12 мм круглый, толщина 0,09– 0,12 мм, No 0Каролина633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Сбалансированные соли ХэнксаSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥ 99,5% (титрование)Sigma-AldrichH3375-250G
Соляная кислота, 37%, реагент A.C.SSigma-Aldrich258148-100 мл
ИнсулинSigma-AldrichI5500-250 мг
Магния сульфат гептагидрат, MgSO4•( 7H2O), BioUltra, ≥ 99,5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix раствор, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237Это материал покрытия для покровных стекол и колб. 1) Чтобы его приготовить, разморозьте раствор Matrigel Basement Membrane Matrix на льду, что обычно занимает ~1 день. С помощью предварительно охлажденной пипетки разлейте размороженный раствор в предварительно охлажденные колбы T25 на льду и храните колбы при температуре -20°C. Для приготовления рабочего раствора Матригеля разморозьте аликотированный Матригель в колбе на льду, разбавьте в 50 раз, добавив предварительно охлажденный раствор МЭМ, и выдержите разбавленный раствор при температуре 4°С. Важно предварительно охладить всю посуду и среды, контактирующие с Матригелем, за исключением времени и после нанесения покрытия на покровные стекла, чтобы предотвратить преждевременное образование геля. 2) Чтобы покрыть стеклянные покровные стекла или колбы с культурой Матригелем, нанесите раствор Матригеля на поверхность. Перед нанесением покрытия на ячейки важно полностью просушить поверхность. Для этой цели может быть полезно аспирировать Матригель во время центрифугирования клеток непосредственно перед нанесением покрытия на клетки и дать достаточно времени для сушки.
Минимальная незаменимая среда (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ Разбавитель сыворотки, 5 млBD Biosciences355006
Multiwell Plates, 24-луночный планшетBD falcon353047
Multiwell Plates, обработанный культурой тканей 6-луночный планшетBD Falcon353046
Нейробазал-А Medium (1X), жидкийGIBCO-Invitrogen10888-022
Азотная кислотаVWRbdh 3044
NS (Нейрональная добавка) 21 приготовлено в лабораторииИсточник: ссылка 69
Пастер пипетец, 5 ¾ ”  Fisher13-678-6AИспользуйте эту ватную заглушку 5 ¾ ” Пастеровская пипетка для клеточного растирания. Предварительно отполируйте наконечник огневой полировкой, чтобы сгладить поверхность среза и уменьшить внутренний диаметр до 50-80% от первоначального. Слишком маленький наконечник нарушит работу клеток и снизит жизнеспособность клеток, но слишком большой наконечник снизит эффективность растирания.
Пастерские пипетки, 9"  Fisher13-678-6B
Хлорид калия (KCl), SigmaUltra, ≥ 99,0%Sigma-AldrichP9333-500G
Серологическая пипетка, 2 млBD falcon357507
серологическая пипетка, 5 мл&nbл;BD falcon357543
серологической пипеткой, 10 млBD falcon357551
серологической пипеткой, 25 млBD falcon357525
серологической пипеткой, 50 мл BD falcon357550
Бикарбонат натрия (NaHCO3, гидрокарбонат натрия), SigmaUltra, ≥ 99,5%Sigma-AldrichS6297-250G
хлорид натрия (NaCl), SigmaUltra, ≥ 99,5%Sigma-AldrichS7653-250G
Гидроксид натрия (NaOH), гранулы, 99,998% микропримеси металлов на основеSigma-Aldrich480878-250G
Двухосновной гептагидрат фосфата натрия (Na2HPO4•( 7H2O)), ≥ 99,99%, ОлдричСигма-Олдрич431478-250G
Сахароза, СигмаУльтра, ≥ 99,5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Шприцевой фильтр, стерильный, 0,2 & микро; mCorning431219
Шприц, 3 млBD Falcon309585
Transferrin, Holo, бычья плазмаCalbiochem616420
Трипан Синий краситель, 0,4%GIBCO-InvitrogenT10282Используется для подсчета живых/мертвых клеток. Замените старый раствор трипанового синего цвета, если он используется повторно много раз (например несколько раз в неделю в течение нескольких недель), потому что он будет образовывать осадки и приводить к ошибочным показаниям клеточной плотности.
Трипсин, тип XISigma-AldrichT1005-5G
раствор трипсина-ЭДТА, 0,25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5GСтоковый раствор готовят в дозе 50-мг 5-фтор-2'-дезоксиуридина и 125 мг уридина в дозе 25 мл DMEM (8,12 и 20,48 мМ соответственно).
РЕАГЕНТЫ - иммуноцитохимия
Антитела, кролик поликлональный анти-MAP2Merck MilliporeAB5622
мышиный моноклональный анти-GFAP коктейльMerck MilliporeNE1015
ОБОРУДОВАНИЕ - нанесение татуировки
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NEO– 9Эта система татуировки новорожденных грызунов представляет собой электрическую систему, которая работает путем быстрого перемещения 1- или 3-точечных татуировочных игл вертикально в кожу. Активируйте тату-машинку один раз примерно на 0,5 секунды, при этом кончики игл для татуировки держатся перпендикулярно поверхности кожи. Мы предпочитаем татуировку тремя иглами, чтобы максимально увеличить площадь татуировки, но татуировка одной иглой эффективна на более узких участках, например, пальцах ног, или, если необходим тонкий механический контроль, emнапример при татуировке номеров. Двух раундов нанесения татуировки на самой медленной скорости (установка «1» из 3 шагов) обычно достаточно для создания видимой и стойкой татуировки подушечек лап
ОБОРУДОВАНИЕ - система генотипирования
Электрофорез, горизонтальная, Wide Mini– Подячейка GTBIO– РАД170– 4405Типичными параметрами электрофореза являются напряженность электрического поля при 6 В/см и продолжительность 25 мин для геля толщиной 10 см.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUНаши ПЦР-реакции для гена Tor1a в Δ E-torsinA нокаутированные мыши следующие: 1 цикл денатурации при 94 ° С за 3 мин, 35 циклов денатурации при 94 ° C в течение 30 сек, отжиг при 58 ° C на 30 сек, удлинение на 72 ° C в течение 2 мин. За этим следует окончательное продление на 72 ° C в течение 10 мин и удерживая при 4 °C.
Источник питания, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
ОБОРУДОВАНИЕ - автоматический счетчик клеток для клеточных культур
, графиняGIBCO-InvitrogenC10310Этот автоматический счетчик клеток отдельно измеряет плотность живых и мертвых клеток (не окрашенных и окрашенных трипановым синим соответственно). Важно знать оптимальный диапазон измерений плотности: счетчик, который мы используем, имеет самую высокую точность в диапазоне от 1 x 105 до 4 x 106 клеток/мл. Если измеренные значения плотности ячеек выходят за пределы рекомендуемого диапазона, соответствующим образом отрегулируйте объем ресуспендирования.
Шкаф биологической безопасности, класс II, тип A2NUAIRENU-425-400Этот колпак используется для всех процедур по культивированию клеток, за исключением диссекции мозга.
CO2 Инкубатор, AutoFlow, водяная рубашка для контроля влажностиNUAIRENU-4850
Горизонтальная скамья для уборкиNUAIRENU-201-330Эта скамья для уборки используется для вскрытия головного мозга (шаги 3.1.1 и 3.1.2 раздела «Рассечение мозга и клеточная диссоциация)».
Низкоскоростной шейкер Orbit LSLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Сверхскоростная центрифугаFisher46910 (центрифуга)/46922 (ротор)
.Фильтрованные наконечники для пипеток дикого типа Антитело , .

Ссылки

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793(2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034(2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245(2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626(2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844(2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895(2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373(2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389(2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634(2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965(2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703(2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257(2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111(2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633(2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Первичные нейрональные культурыподстилающий слой глииэкстракция ДНКПЦР-амплификациягель-электрофорездиссекция мозгапереваривание тканидиссоциация клетокпосев нейронов
Быстрое Генотипирование животных Круги путем создания первичных культурах мозга нейронов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.