Методическая статья

В режиме реального времени изображений аксонов транспорта квантовой точке меченных BDNF в первичных нейронах

DOI:

10.3791/51899

⸱

15 сентября 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, University of California, San Diego, 2School of Biomedical Engineering and Med-X Research Institute, Shanghai Jiao Tong University, 3Department of Anesthesiology, University of California, San Diego, 4VA San Diego Healthcare System

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аксонов транспорт BDNF, нейротрофического фактора, имеет решающее значение для выживания и функции нескольких нейронных популяций. Некоторые дегенеративные заболевания отмечены нарушения аксонов структуры и функции. Мы продемонстрировали методы, используемые для изучения живой торговлей QD-BDNF в микрофлюидных камер с использованием первичных нейронов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BDNF играет важную роль в нескольких аспектах выживание нейронов, дифференцировку и функции. Структурные и функциональные дефициты в аксонов все чаще рассматриваются в качестве раннего признака нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Хантингтона (HD). Пока неясно, является механизм (ы), по которому аксональное повреждение индуцируется. Мы сообщили о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), которые могут быть использованы для отслеживания аксонов транспорт BDNF. Квантовая точка меченных BDNF (QD-BDNF) было произведено сопряжением квантовую точку 655 до mBtBDNF. Микрожидкостных устройство используется для изоляции аксонов от нейрона клеточных тел. Добавление QD-BDNF в аксонов отсеке допускаются Живая съемка BDNF транспорта в аксонов. Мы показали, что КТ-BDNF переехал существу исключительно ретроградно, с очень немногими пауз, по движущейся скорости около 1,06 мкм / сек. Эта система может быть использована для исследования мнеchanisms из разрушенного аксонов функции в AD или HD, а также других дегенеративных заболеваний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейроны очень поляризован ячейки, долго и часто весьма подробно процессы являются основой для установления и поддержания структуры и функции нейронных цепей. Аксон играет жизненно важную роль в перевозке грузов в и из синапсов. Белки и органеллы, синтезированные в клетке сомы необходимо транспортировать через аксонов, чтобы достичь пресинаптического терминала для поддержки функции нейронов. Соответственно, сигналы, полученные в дистальных аксоны должны быть трансдуцировали и передал сомы. Эти процессы имеют важное значение для жизнеспособности нейронов, дифференциации и технического обслуживания. В том, что аксонального транспорта в некоторых нейронов должна быть проведена через расстояния более 1000 раз больше диаметра тела клетки, возможность легко Предполагается, что даже незначительный дефицит может заметно повлиять нейронов и схемы функцию.

Головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), член нейротрофина семейства факторов роста, присутствует в мАNY области мозга, в том числе гиппокампа, коры головного мозга, и базальных отделах переднего мозга. BDNF играет решающую роль в формировании познания и памяти, поддерживая выживание, дифференциацию и функцию нейронов, которые участвуют в познавательных схем. BDNF связывается со своим рецептором, в тирозин-киназы TrkB, в аксона, где он активирует TrkB-опосредованного пути передачи сигналов, включая митоген активированной протеинкиназы / внеклеточной регулируемой протеинкиназы (МАРК / ERK), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и фосфолипаза С-гамма (PLCγ). Белки, которые участвуют в этих сигнальных путей упакованы на эндоцитотических везикулярного структур для формирования BDNF / TrkB эндосомы 1-6, которые затем ретроградно транспортируется к нейронов сомы сигнализации.

Микрожидкостных культура камера представляет собой очень удобную платформу для изучения аксонов биологию в нормальных условиях, а также при установлении травм и болезней, 7,8. По изолирующих аксоновот клеточных тел, устройство позволило изучить транспорт специально в аксонов 8-10. В основе PDMS микрожидкостных платформы с 450 мкм Microgroove барьеров, используемых в данном исследовании были коммерчески купил (см таблицу материалы). Чтобы изучить BDNF транспорт, мы разработали новую технологию для производства monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Мы воспользовались биотин акцепторной пептида, AP (также известный как AviTag). Это последовательность кислоты в 15 аминокислотных который содержит остаток лизина, которые могут быть специально лигировали с биотином по кишечной палочки фермент, биотин-лигазы, Бира. Мы слиты с AviTag к С-концу мыши предварительно proBDNF кДНК с помощью ПЦР (фиг.1А). Конструкцию клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих, pcDNA3.1 MYC-вектора его. Мы также клонировали бактериальную ДНК Бира в pcDNA3.1 Мус-его вектора. Два плазмиды временно совместно трансфицировали в клетки HEK293FT выразить как белки. Бира катализирует перевязка БиоВ частности, в лизина находятся в пределах AviTag на С-конце ФРГМ в соотношении 1: 1, с получением monobiotinylated BDNF мономера. Биотинилированное, зрелые BDNF с молекулярной массой ~ 18 кДа был восстановлен и очищен от СМИ с использованием Ni-смолу (Рисунок 1в). Биотинилирование BDNF была завершена, о чем судили по невозможности обнаружить без изменений BDNF с помощью иммуноблоттинга (Фигура 1D). Стрептавидином сопряженных квантовых точек, QD 655, были использованы для обозначения mBtBDNF сделать КТ-BDNF. Наличие AviTag не вмешиваться в деятельность BDNF как mBtBDNF смог активировать фосфорилированную TrkB (Рисунок 1E) и стимулировать рост аксонов (Рисунок 1F) в той мере, рекомбинантного человеческого BDNF (rhBDNF). Иммуноокрашивание показали, что КТ-BDNF локализуется с TrkB в гиппокампа аксонов, указывая, что QD-BDNF является биологически активным (Рисунок 1G). Для изучения BDNF транспорта, КТ-ФРГМ был добавлен в дистальном отделе аксоновмикрофлюидных культуры, содержащие крысы E18 нейронов гиппокампа (рисунок 2А). QD-BDNF ретроградного транспорта в аксонов был захвачен в реальном времени живого изображения красной флуоресцентной метки (Поддержка видео S1, S2). Анализируя кимографе сгенерированный, QD-BDNF наблюдалось транспортировать ретроградно по движущейся скорости около 1,06 мкм / сек (Рисунок 3А). GFP или mCherry-меченый BDNF были использованы для отслеживания аксонов движение BDNF. Основные недостатки в том, что они не являются достаточно ярким для единичных исследований молекул. Кроме того, присутствие обоих антероградной и ретроградных движений BDNF делает его трудно оценить, был ли ретроградно транспортируется BDNF в комплексе нейротрофин / рецептор.

В этом видео мы продемонстрируем методы, используемые для изучения живой торговлей QD-BDNF в микрофлюидных камер с использованием первичных нейронов. Ultrabrightness и отлично фотостабильность квантовых точек макES можно выполнять долгосрочное отслеживание BDNF транспорта. Эти методы могут быть использованы для повышения исследования аксонов функции в AD, HD, и других нейродегенеративных расстройств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хирургические и животных процедуры проводятся строго в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Все эксперименты, связанные с использованием животных утверждаются UCSD Уходу за животными и использованию комитета.

1 плазмиды Клонирование, экспрессия и очистка Mono-биотинилированного BDNF (mBtBDNF)

ПРИМЕЧАНИЕ: Построить предварительный proBDNFavi и Бира кДНК в pcDNA3.1 вектора и coexpress в HEK293FT ячеек 10. Очищают mBtBDNF использованием бисера Ni-NTA соответствии с ранее опубликованной способа получения зрелой и биологически активный фактор роста monobiotinylated нерва (mBtNGF) 10.

2 Получение микрофлюидных палат

Микрожидкостных нейрон культивирование устройство позволяет гидравлически изолировать аксоны от нейронов клеточных тел. Соберите камеры с покровные недавно покрытых прямо перед каждой вскрытия. Микрожидкостных камеры, используемыев этом протоколе коммерчески купил (см материалы и таблицы оборудования к). Ручная стирка и повторно использованы коммерчески приобретенные камеры до 5-6x.

  1. Ручная стирка микрофлюидных камеры в 1% Alconox. Промыть три раза Milli-Q воды в течение 30 мин каждый. Руки мыть Камеры снова в 70% этанола.
  2. Выложите камеры для просушки на парафильмом в ламинарном боксе. Radiate и стерилизовать обе стороны камер в течение 20 мин при УФ. Магазин стерилизуют камеры в стерильной 15-см чашку герметичной парафильмом при комнатной температуре.
  3. Поместите 24 х 40 мм № 1 покровные стекла в стеклянной таре. Замочите покровные в 35% соляной кислоты в течение ночи на ротатора. На следующий день, промыть покровные три раза в течение 30 мин каждый с водой.
  4. Стерилизовать покровные один за другим погружением каждый покровное в 100% этанола и пылающий над горелкой Бунзена. Хранить сухие покровные в стерильную чашку Петри и держать его при комнатной температуре до тех пор, покрытие.
  5. Положите НУт покровные в 15 см блюдо культуры. Шерсть каждого покровное с 0,7 мл 0,01% поли-L-лизин (PLL) и инкубируют в шкафу при комнатной температуре.
  6. После 1 ч, промыть покровные три раза стерильной водой. Сухие покровные с вакуумом и место каждого покровного в 6 см блюдо культуры.
  7. Чтобы собрать микрофлюидных камеру, разместить камеру с Microgroove стороне в нижней на покрытые покровным PLL с осторожностью, чтобы не коснуться микродорожек. Осторожно нажатой в камеру с наконечником пипетки, чтобы обеспечить камера плотно закрытыми.

3 Рассечение нейронов культуры и плиты на палат

  1. Поместите два E17-E18 крысы гиппокампа (один мозга) расчлененные в 15 мл коническую пробирку, содержащую 2 мл рассечение буфера (HBSS, ни кальций, ни магний, с 1% пера / стрептококк и 10 мМ HEPES. Промыть ткани 3x с 5 мл рассечение буфера каждый раз. Удалить буфер рассечение, насколько это возможно, и добавить 900 мкл свежей диssection буфера.
  2. Чтобы переварить ткани, добавить 100 мкл 10x трипсина (2,5%) в буфер рассечение сделать 1x рабочую концентрацию. Поместите коническую трубку в водяной бане при 37 °. Через 10 мин пищеварения, добавьте 100 мкл 10 мг / мл ДНКазы I до конечной концентрации около 1 мг / мл.
  3. Использование огневой полировкой Пастер стеклянную пипетку, мягко растирают ткани с помощью пипетки вверх и вниз в 5-10 раз. Сразу после растирания, утолить трипсина с 2 мл обшивки среды (Neurobasal с 10% FBS, 2 мМ Glutamax, 2% B27).
  4. Оставьте образец в капот в течение 5 мин, чтобы позволить любой мусор тканей поселиться на дно. Тщательно удалить 2 мл надосадочной жидкости в чистую стерильную 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин для осаждения клеток. Ресуспендируют гранул в 50 мкл покрытие СМИ
  5. Граф клеток с гемоцитометре. Нагрузка 15-20 мкл клеточной суспензии (~ 40000 клеток) в один отсек микрожидкостной камеры. Поместите камерув инкубаторе в течение 10 мин, чтобы позволить клеткам прикрепляться к покровное. Через 10 мин, добавить больше обшивки СМИ пополнить обе отсеков камеры.
  6. На второй день вскрытия, полностью заменить обшивки сред обслуживания средств массовой информации (Neurobasal 2 мМ Glutamax, 2% B27) как в теле клетки и аксона отсеке. Аксоны от нейронов гиппокампа начинают пересекать микродорожек в день 3 и достичь аксонов отсек между днем ​​5-7. В течение этого периода времени, вместо половины из культуральной среды с пресной обслуживания средств массовой информации каждые 24 ~ 48 час.

4 аксонов Перевозка QD-BDNF

  1. До жить визуализации КТ-BDNF аксонов транспорта, истощают BDNF как от тела клетки и аксонов отсеках микрожидкостной камере тщательно промыть оба отсека с BDNF-бесплатно, сыворотки свободных СМИ Neurobasal каждые 30 мин в течение 2 часов.
  2. Во время истощения BDNF, получения конъюгатов QD-BDNF. Смешайте 50 нМ моно-биотинилированное BDNF димера с 50 нм QD655-стрептавидин конъюгатов в Neurobasal массовой информации и инкубируют на льду в течение 60 мин.
  3. Удалить носитель в отсеке аксонов и добавить 300 мкл QD-BDNF с конечной концентрацией 0,25 нМ в течение 4 ч при 37 ° С. Чтобы свести к минимуму диффундирующего из КТ-BDNF в тело клетки отсека, это очень важно, чтобы всегда поддерживать высокий уровень массовой информации в теле клетки отсеке, чем в аксона отсеке. Смыть несвязанного QD-BDNF после инкубации до живого изображения.
  4. Провести Живая съемка QD-BDNF транспорта с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного нефти объектива 100X. Разминка сферу и окружающую камеру, прикрепленную к ней до постоянной температуры (37 ° C) и СО 2 (5%). Используйте набор Texas кубов красного возбуждения / эмиссии визуализировать сигнал QD655.
  5. Приобретать и захватить покадровой изображения в пределах средних аксонов со скоростью 1 кадр / сек в общей сложности 2 мин с использованием ПЗС-камеры. Используйте микродорожек с не аксонов тхат не имеют QD и, следовательно, отсутствие сигнала в качестве контроля для инфильтрации.
  6. Анализ BDNF транспорт с помощью любого программного обеспечения для анализа изображений или NIH ImageJ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Получение и очистка биологически активных моно-биотинилированного BDNF

Вектор экспрессии BDNF слиты с последовательностью AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) был создан в соответствии с ранее опубликованным протоколом 10. Молекулярная масса белка полной длины гибридного было предсказано, что ~ 32 кДа ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated зрелого BDNF с предсказанной молекулярной массой 18 кДа

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании, мы сообщают о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), который может использоваться, чтобы отследить аксонов транспорт BDNF. По конъюгации белка в квантовой точки стрептавидином, и с использованием микрожидкостных камеру, метод позволяет обнаружить аксонов транспорт BDNF в первичных нейронов с чувствительностью одной молекулы, в режиме реального времени и с пространственным и временным разрешением. Инструменты, используемые в данном документ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Юэ (Полин) Ху, Рэйчел Sinit для их технической помощи. Работа выполнена при поддержке гранта NIH (PN2 EY016525) и при финансовой синдромом Дауна исследований и лечения фонда и Ларри Л. Hillblom фонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ДНК-полимераза платины pfx Инвитроген11708021
ЭкоРИ ФерментасFD0274
БамHI ФерментасFD0054
HEK293FT клеткиInvitrogenR70007
DMEM-среда с высоким содержанием глюкозыMediatech10-013-CV
D-биотин SigmaB4639
TurboFect ФерментасR0531
PMSF   SigmaP7626
АпротининSigmaA6279
Ni-NTA смолыQiagen30250
Коктейль ингибиторов протеазыSigma  S8820
Набор для окрашивания серебра G-Biosciences786-30
Человеческий рекомбинантный BDNFGenentech
Микрофлюидные камерыXonaSND450
24 x 40 мм No1 стеклянные покровные стекла VWR48393-060
Поли-L-лизин Cultrex3438-100-01
HBSSGibco14185-052
DNase IRoche 10104159001
TrypsinGibco15090-046
Neurobasal Gibco21103-049
FBS Инвитроген16000-044
ГлутаМакс Инвитроген35050-061
B27   Gibco17504-044
QD655-стрептавидин конъюгируетInvitrogen 
антитело к Avi-меткеGenScriptA00674
стрептавидин-агарозные бусины Технологии Жизни  SA100-04
Трихлоруксусная кислотаSigmaT6399
HRP-стрептавидин Антитело Thermo ScientificN100
против pTrkB— щедрый подарок от доктора М. Чао из NYU
anti-TrkB антителаBD Science610101
Q10121MP

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
  2. Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
  3. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
  4. Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
  5. Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14(2012).
  6. Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
  7. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
  8. Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
  9. Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
  10. Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
  11. Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
  12. Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
  13. Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
  14. Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
  15. Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
  16. Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
  17. Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
  18. Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BDNFBDNF

Похожие статьи