Аксонов транспорт BDNF, нейротрофического фактора, имеет решающее значение для выживания и функции нескольких нейронных популяций. Некоторые дегенеративные заболевания отмечены нарушения аксонов структуры и функции. Мы продемонстрировали методы, используемые для изучения живой торговлей QD-BDNF в микрофлюидных камер с использованием первичных нейронов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В режиме реального времени изображений аксонов транспорта квантовой точке меченных BDNF в первичных нейронах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
BDNF играет важную роль в нескольких аспектах выживание нейронов, дифференцировку и функции. Структурные и функциональные дефициты в аксонов все чаще рассматриваются в качестве раннего признака нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Хантингтона (HD). Пока неясно, является механизм (ы), по которому аксональное повреждение индуцируется. Мы сообщили о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), которые могут быть использованы для отслеживания аксонов транспорт BDNF. Квантовая точка меченных BDNF (QD-BDNF) было произведено сопряжением квантовую точку 655 до mBtBDNF. Микрожидкостных устройство используется для изоляции аксонов от нейрона клеточных тел. Добавление QD-BDNF в аксонов отсеке допускаются Живая съемка BDNF транспорта в аксонов. Мы показали, что КТ-BDNF переехал существу исключительно ретроградно, с очень немногими пауз, по движущейся скорости около 1,06 мкм / сек. Эта система может быть использована для исследования мнеchanisms из разрушенного аксонов функции в AD или HD, а также других дегенеративных заболеваний.
Введение
Нейроны очень поляризован ячейки, долго и часто весьма подробно процессы являются основой для установления и поддержания структуры и функции нейронных цепей. Аксон играет жизненно важную роль в перевозке грузов в и из синапсов. Белки и органеллы, синтезированные в клетке сомы необходимо транспортировать через аксонов, чтобы достичь пресинаптического терминала для поддержки функции нейронов. Соответственно, сигналы, полученные в дистальных аксоны должны быть трансдуцировали и передал сомы. Эти процессы имеют важное значение для жизнеспособности нейронов, дифференциации и технического обслуживания. В том, что аксонального транспорта в некоторых нейронов должна быть про....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Хирургические и животных процедуры проводятся строго в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Все эксперименты, связанные с использованием животных утверждаются UCSD Уходу за животными и использованию комитета.
1 плазмиды Клонирование, экспрессия и очистка Mono-биотинилированного BDNF (mBtBDNF)
ПРИМЕЧАНИЕ: Построить предварительный proBDNFavi и Бира кДНК в pcDNA3.1 вектора и coexpress в HEK293FT ячеек 10. Очищают mBtBDNF использованием бисера Ni-NTA соответствии с ранее опубликованной способа получения зрелой и биологически активный фактор роста monobiotinylate....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Получение и очистка биологически активных моно-биотинилированного BDNF
Вектор экспрессии BDNF слиты с последовательностью AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) был создан в соответствии с ранее опубликованным протоколом 10. Молекулярная масса белка полной длины гибридного было предсказано, что ~ 32 кДа ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated зрелого BDNF с предсказанной молекулярной массой 18 кДа
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом исследовании, мы сообщают о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), который может использоваться, чтобы отследить аксонов транспорт BDNF. По конъюгации белка в квантовой точки стрептавидином, и с использованием микрожидкостных камеру, метод позволяет обнаружить аксонов транспорт BDNF в первичных нейронов с чувствительностью одной молекулы, в режиме реального времени и с пространственным и временным разрешением. Инструменты, используемые в данном документ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Юэ (Полин) Ху, Рэйчел Sinit для их технической помощи. Работа выполнена при поддержке гранта NIH (PN2 EY016525) и при финансовой синдромом Дауна исследований и лечения фонда и Ларри Л. Hillblom фонда.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ДНК-полимераза платины pfx | Инвитроген | 11708021 | |
| ЭкоРИ | Ферментас | FD0274 | |
| БамHI | Ферментас | FD0054 | |
| HEK293FT клетки | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-среда с высоким содержанием глюкозы | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-биотин | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Ферментас | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Апротинин | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA смолы | Qiagen | 30250 | |
| Коктейль ингибиторов протеазы | Sigma | S8820 | |
| Набор для окрашивания серебра | G-Biosciences | 786-30 | |
| Человеческий рекомбинантный BDNF | Genentech | ||
| Микрофлюидные камеры | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 мм No1 стеклянные покровные стекла | VWR | 48393-060 | |
| Поли-L-лизин | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche 10104159001 | ||
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Инвитроген | 16000-044 | |
| ГлутаМакс | Инвитроген | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-стрептавидин конъюгирует | Invitrogen | ||
| антитело к Avi-метке | GenScript | A00674 | |
| стрептавидин-агарозные бусины | Технологии Жизни | SA100-04 | |
| Трихлоруксусная кислота | Sigma | T6399 | |
| HRP-стрептавидин | Антитело Thermo Scientific | N100 | |
| против pTrkB | — щедрый подарок от доктора М. Чао из NYU | ||
| anti-TrkB антитела | BD Science | 610101 |
Ссылки
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular O....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
