gDNA для секвенирования NGS является простым и мощным инструментом для изучения конституциональных мутаций. В этой статье мы представляем процедуру простого анализа полной последовательности 11 генов, участвующих в восстановлении повреждений ДНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
гДНК Обогащение на транспозазу основе технологии для NGS Анализ всей последовательности BRCA1, BRCA2, и 9 генов, вовлеченных в ДНК Нанесенный Ремонт
В этой статье
Краткое содержание
Обогащение
Аннотация
Широкое использование следующего поколения последовательности открыло новые возможности для исследования рака и диагностики. NGS принесет огромные суммы новых данных по раку, и особенно генетики рака. Современные знания и будущие открытия сделает его необходимо изучить огромное количество генов, которые могут быть вовлечены в генетической предрасположенности к раку. В связи с этим, мы разработали дизайн Nextera учиться 11 полных генов, участвующих в репарации ДНК повреждения. Этот протокол был разработан для безопасного учиться 11 генов (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, Rad50, RAD51C, RAD80, и TP53) от промоутера в 3'-UTR у 24 пациентов одновременно. Этот протокол, основанный на транспозазы технологии и гДНК обогащения, дает большое преимущество с точки зрения времени для генетической диагностики, благодаря отведать мультиплексирование. Этот протокол можно безопасно использовать с гДНК крови.
Введение
В 2010 году почти 1,5 миллиона человек (в основном женщины) развился рак молочной железы во всем мире. По оценкам, от 5 до 10% из этих случаев были наследственными. Почти 20 лет назад, BRCA1 и BRCA2 были определены как участие в наследственной рака груди и яичников 1. Поскольку около 15 лет назад, BRCA1 и BRCA2 кодирующие области были последовательными, чтобы определить генетическую предрасположенность к груди и рака яичников. Изменения в BRCA1 и BRCA2 обнаруживаются в 10 до 20% отдельных семей 2, предполагая, что анализ этих регионах не является достаточным для эффективного скрининга. В посл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1 Оценка гДНК (геномная ДНК) Выход
- Количественно недавно извлечены гДНК перед приготовлением библиотеке. Используйте метод флуорометрического оценки доходности количественно нетронутыми гДНК (избежать с помощью спектрофотометра для оценки доходности гДНК). Измерьте (260/280 нм) соотношение и убедитесь, что он находится между 1,8 и 2 Примечание: 50 нг гДНК необходимы для эксперимента.
2 гДНК Обогащение: День 1, Утро
- Перед началом
- Из комплекта по обогащению ДНК (см таблицу материалов / оборудования), оттепель буфера ДНК (TD) и фермент ДНК (TDE1) решений на льду. По крайней мере, за 30 минут до использова....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Образец КК Результаты
Способность этого метода для определения последовательности генов-мишеней на основе качества гДНК (фиг.2А) и качества шаге tagmentation. Если tagmentation не является достаточным (фиг.2В, верхняя панель), секвенирование не будет удовлетворительным. Как упоминалось выше, после очистки tagmentation, гДНК следует tagmented на фрагменты из 150 п.о. до 1000 п.о. с большинством фрагментов около 300 пар оснований (фиг.2В, нижняя .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Широкое использование устройств и технологий NGS предоставил новые возможности в изучении рака и генетических нарушений. В дополнение к целой секвенирования генома или РНК последовательности, анализ большого количества выбранных гДНК последовательностей в многочисленных пациентов одновременно предлагает большие перспективы в диагностике. Здесь, мы разработали специфический дизайн (предоставляется по запросу), используя технологию Nextera учиться 11 генов полной у 24 пациентов одновременно со средней пропускной последова.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Благодарности
Мы благодарим Ligue contre le Cancer de Côte d'Or и Centre Georges-François Leclerc за их финансовую поддержку. Мы благодарим Филиппа Бастейбла за редактирование рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Секвенирование/устройство средней пропускной способности |
| Nextera Набор для обогащения | Illumina | FC-123-1208 | Технология на основе транспозазы |
| 300 цикл картридж | Illumina | 15033624 | |
| AMPure бусины | Beckman Coulter | A63881 | Магнитные очистительные бусины |
| Магнитная подставка | Alpaqua | A32782 | |
| 96-луночные пластины | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-луночные пластины | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | Это уплотнение необходимо только для ПЦР-амплификации. На протяжении всего эксперимента можно использовать другие стандартные пломбы |
| MiSeq | Illumina | Поставляется с устройством секвенирования программным обеспечением Experiment Manager Интернет-адрес: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Инструмент для сайта производителя |
Ссылки
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
