Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метилнитрозомочевины (МНУ) -индуцированных дегенерации сетчатки и регенерации в данио рерио: гистологические и функциональные характеристики

11.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51909

⸱

20 октября 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Inselspital, University of Bern, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Basel, 3Department of Biology, University of Fribourg

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы показываем, количественное сетчатки де- и регенерации и ее влиянии на зрительные функции с использованием н-метил-N -nitrosourea в взрослых данио. Вслед за распространением во внутреннем ядерном слое снижения остроты зрения и снижение числа фоторецепторов. Полный морфологический и функциональный регенерации произошло через 30 дней после первоначального лечения.

Аннотация

Дегенеративных заболеваний сетчатки, например пигментный ретинит, с результате счет повреждения фоторецепторов для большинства потери зрения в индустриальном мире. Животные модели ключевое значение для изучения таких заболеваний. В этой связи фоторецепторов конкретных токсин N-метил-N -nitrosourea (МНУ) широко используется в грызунов фармакологически индуцировать дегенерацию сетчатки. Ранее мы установили МНУ-индуцированной сетчатки модель дегенерации в данио, другой популярной моделью системы в визуальном исследовании.

Увлекательный разница млекопитающим является стойким нейрогенез во взрослом сетчатке рыбок данио и его регенерации после повреждения. Для количественной оценки этого наблюдения мы использовали измерения остроты зрения в взрослых данио. Таким образом, оптокинетическим рефлекс был использован, чтобы следовать функциональные изменения в не-анестезированных рыбы. Это была дополнена гистологии, а также иммуногистохимического stainiнг для апоптоза (TUNEL) и пролиферации (PCNA) соотнести развивающимся морфологические изменения.

Таким образом, апоптоз фоторецепторов происходит через три дня после обработки НММ, за которым следует заметному снижению клеток во внешнем ядерном слое (ОНЛ). После этого, пролиферация клеток во внутреннем ядерном слое (INL) и ONL наблюдается. В данном случае мы показали, что не только полное гистологическое, но и функциональный регенерации происходит в течение времени течение 30 дней. Теперь мы иллюстрируют способы количественно и следить за данио сетчатки де- и регенерации с помощью MNU в видео-формате.

Введение

Видение является наиболее существенным смысл для человека и его обесценения имеет высокую социально-экономические последствия. В развитых странах мира, дегенеративных заболеваний сетчатки являются ведущей причиной потери зрения и слепоты среди пожилых людей 1. Причиной большинства дегенеративных заболеваний сетчатки лишь частично понял и лечебная решения, чтобы восстановить утраченное зрение очень ограничены. Пигментный ретинит является типичным примером сетчатки дегенеративных заболеваний с первичным потери фоторецепторов 2-3. N-метил-N -nitrosourea (MNU) индуцирует дегенерацию сетчатки и поэтому широко используется в грызунов моделировать заболевания со смертью первичного фоторецепторов клеток 4. Это алкилирующий агент и приводит к доброкачественных и злокачественных опухолей, которые обычно появляются через несколько месяцев после заражения 5-7. Кроме того, это приводит к смерти клетки фоторецептора конкретных пределах краткосрочного периода наблюдения. Таким образом, потеря сетчатки слоя structuповторно и значительное истончение сетчатки наблюдалось в зависимости от концентрации. Сетчатки глиальных клеток активировались, но никаких изменений в пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) не были найдены. Эндоплазматической сети (ER) связанные со стрессом апоптоз, кажется, основным каналом НММ действий в сетчатке 8.

Мы недавно ввели MNU как химической модели индуцировать дегенерацию фоторецепторов у рыбок данио 9. Среди других причин, данио (Danio rerio) стало важным в визуальном исследовании из-за сходства его зрительной системы в том, что из других позвоночных 10. Внешняя сетчатка содержит фоторецепторы, которые могут быть сгруппированы в четырех различных типов колбочек с пиковыми чувствительности в ультрафиолетовой, короткого, среднего и длительного длины волны видимого спектра и одной штанги типа фоторецепторов. Во внутреннем ядерном слое (INL), клеточных тел биполярных, горизонтальных и амакринных интернейронов встречаются, как вэйл как клетки сомы Мюллера глиальные клетки. Во внешнем слое плексиформной (ССО) синаптические контакты между фоторецепторов и внутренней сетчатки образуются, в то время как клетки слоя ближайший к линзе является слое ганглиозных клеток (ГХ), какие компоненты образуют длинные аксоны, содержащие зрительный нерв и зрительный тракт . Синаптических контактов между ганглиозных клеток и клеток во внутреннем ядерном слое образуются во внутреннем слое плексиформной (IPL) 11. НПП лежит вне нейросенсорной сетчатки и окружает наружных сегментов фоторецепторов с длинной апикальной микроворсинок 12. Кроме того, данио очень регенеративная и в состоянии вырастить поврежденного мозга, сетчатки, спинной мозг, сердце и другие ткани 13. При возникновении повреждения сетчатки, клетки в INL, которые, как считается, Мюллер клетки, активизируются и есть потенциал, чтобы дифференцироваться в различных типов клеток сетчатки. Кроме того, они также порождают стержневые клетки-предшественники, которые расположены в ONL. Другой такurce, которая поставляет на сетчатку взрослых данио с новых клеток является мерцательная маргинальной зоны. Этот источник необходим, чтобы обеспечить постоянную плотность стержневых фоторецепторов в постоянно растущей данио глаза 14.

Эта модель НММ можно использовать в качестве простого и воспроизводимым подход дегенерации / регенерации для ткани сетчатки. Благодаря их сходству биологических процессов у рыбок данио и у людей это может открыть двери для идентификации вовлеченных пути клеточной гибели и экранировать потенциальных ноотропных препаратов. Основываясь на предыдущем исследовании от нашей группы, мы сейчас иллюстрируют способы этого МНУ-индуцированной данио модели сетчатки де- и последующей регенерации включая функциональные изменения с соответствии лабораторный видео 9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты придерживался Заявление для использовании животных в офтальмологической и Vision Research Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO).

1. Животные

  1. Поддержание дикого типа данио (Danio rerio) от АВ (Орегон) штамма в возрасте от 6-12 месяцев при стандартных условиях в воде с температурой 26,5 ° С и 14/10 ч цикле свет / темнота 15.
  2. Следуйте инструкциям по уходу животное из участвующих учреждений для экспериментов на животных после утверждения кантона ветеринарии.

2 МНУ Лечение

  1. Подготовка воды, содержащей 150 мг / л сухого вещества N-метил-N -nitrosourea (НММ). ВНИМАНИЕ! МНУ токсичен; может вызвать рак, наследственные генетические нарушения или вред нерожденному ребенку.
  2. Инкубируйте данио в воде, содержащей МНМ в течение 60 мин при комнатной температуре.
  3. Промыть данио быстро спресная вода и положить рыбу на новый аквариуме без НММ. Поддержание рыбу в стандартных условиях сколь угодно долго для экспериментов.

3 Измерение остроты зрения

  1. Запустите систему оптомоторных, выберите 'тестирование' из меню и установите параметры, которые "Простая лестница", "Острота (Freq)" и "Рандомизированное / Отдельная" 16.
  2. Установите инфузионную бутылку с 500 мл воды около 1 м над системой оптомоторной.
  3. Поместите один данио в экзаменационном камеры и подключить его к бутылке инфузии. Поместите экспертизы камеру в системе оптомоторной.
  4. Начните измерение и наблюдать за движением глаз в режиме реального времени на экране компьютера. Таким образом, положительный ответ («да») определяется как последовательных саккад в правильном направлении, в то время как отрицательного ответа ("нет") представляет случайные движения глаз, похожие на те, наблюдаемых с вокзалаичных решетки. Если глазах данио выставке три или более последующие оптокинетического ответы (ОКР), нажмите «Да»; если нет, нажмите "нет".
  5. Извлеките остроты зрения, которая была рассчитана с помощью программного обеспечения, определяя порог пространственной частоты оптокинетического стимула, в разделе "Результаты" в меню.

4 гистологии

  1. Усыпить данио передозировкой этил 3-аминобензоата метансульфоната (200-300 мг / л) и enucleate глаза.
  2. Закрепить целые глаза в 4% параформальдегида (PFA) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) при 4 ° С в течение 12 ч и затем обезвоживают образцов в серии градуированных спирта.
  3. Вставить образцы в парафин, сократить 5 мкм разделы через зрительного нерва (ДЗН) и смонтировать их на стеклах.
  4. Пятно deparaffized разделы парафиновые с hemalum в течение 4 мин и окунуть слайды два раза в дистиллированной воде с последующим 0,2% соляной ациD и 0,8% аммиака. Пятно секции с эозином в течение 3 мин после развития окрашивания hemalum в водопроводной воде в течение не менее 10 мин (H & E).
  5. Вставить обезвоженные слайды в монтаже среды и наблюдать слайды под световым микроскопом.

5 Иммуногистохимия

  1. Терминал дезоксинуклеотидилтрансферазы дУТФ ник конец маркировка (TUNEL)
    1. Инкубируйте парафина секции с 20 мкг / мл протеиназы К при комнатной температуре в течение 15 мин. Промыть срезов три раза Трис-солевом буферном растворе (TBS) в течение 5 мин каждый.
    2. Инкубируйте секции с 50 мкл реакционной смеси TUNEL (10% раствор маркировки и 90% раствора фермента) во влажной камере при 37 ° С в течение 60 мин. Промыть три раза TBS в течение 5 мин каждый.
    3. Установите слайды с монтажной среды, содержащей DAPI и наблюдать слайды под флуоресцентным микроскопом.
  2. Пролиферирующие сотовый ядерного антигена окрашивание (PCNA)
    1. Кипение парафина секции в поисковой антигена буфера (Трис-ЭДТА + 0,05% Tween 20, рН 9,0) в течение 3 мин и мыть три раза TBS в течение 5 мин каждый. Блок 100 мкл блокирующего раствора (TBS + 10% козья сыворотка нормально + 1% бычьего сывороточного альбумина, pH 7,6) при комнатной температуре в течение 1 часа.
    2. Пятно с анти-PCNA первичными антителами в разведении 1: 200 в увлажненной камере при 4 ° С в течение ночи. Промыть три раза TBS + Твин 20 в течение 5 мин каждый.
    3. Завершение обнаружения с соответствующими вторичными антителами в разведении 1: 500 при комнатной температуре в течение 1 часа.
    4. Установите слайды с монтажной среды, содержащей DAPI и наблюдать слайды под флуоресцентным микроскопом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Острота зрения:

Экспериментальная установка [пространственная частота: 0,042 круги / степень (C / D); контрастируют: 100%; Скорость дрейфа: 20 градусов / секунду (г / SRC); подсветка яркость: 152 кд / м 2] данного исследования позволили ОКР оценку взрослых данио. Средняя продолжительность измерения В.А. было около 5 - 10 минут для каждого рыбок данио, которые терпимо процедуру хорошо. Острота зрения до воздействия НММ была 0,577 ± 0,014 циклов / степень (C / D). Рисунок 1<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ранее наша группа передала мну модель дегенерации фоторецептора от грызунов в данио системы 9. Последующие события были описаны и последовал на срок до 30 дней. В этот период времени полный сетчатки морфологическая дегенерация и регенерация произошедших после первоначального лечения. Во-первых, гистология показывает снижается клеток стержень считать от дня 3 на с минимумом в день 8 Соответственно, окрашивание TUNEL идентифицирует апоптоз стержневых фоторецепторов 3 дня после лечения НММ. Регенерация начинаетс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Монику Кильхенманн, Федерику Бисиньяни и Агату Дуду за их отличную техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислотаSigma-Aldrich, Букс, ШвейцарияA6283
АммиакSigma-Aldrich, Букс, Швейцария2949930,80%
бычьего сывороточного альбумина (BSA)Sigma-Aldrich, Букс, Швейцария05470
Dako PenDako, Glostrup, DanmarkS2002
DAPI монтажный носительVector Labs, Берлингейм, Калифорния, СШАH-1200
ЭозинSigma-Aldrich, Букс, Швейцария45260
ЭтанолSigma-Aldrich, Букс, Швейцария2860100%, 96%, 70%
этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma-Aldrich, Букс, ШвейцарияЭД
этил3-аминобензоат метансульфонат сольSigma-Aldrich, Букс, ШвейцарияE10521Трикейн
EukittSigma-Aldrich, Букс, Швейцария3989
Козий анти-кролик Alexa 594Life Technologies, Цуг, Швейцария A11012
Нормальная сыворотка для козDako, Glostrup, DanmarkX0907
Соляная кислотаSigma-Aldrich, Букс, Швейцария3203310,20%
Набор для обнаружения клеточной смерти in situRoche Applied Sciences, Rotkreuz, Швейцария11684795910TUNEL Kit
гемалума МайераMerck, Дармштадт, Германия109249
Метилнитрозомочевина (MNU)Sigma-Aldrich, Букс, ШвейцарияN4766Toxic
OptoMotryCerebralMechanics, Летбридж, AB, Канадаn.a.Параформальдегид
(PFA)Sigma-Aldrich, Букс, ШвейцарияP6148
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma-Aldrich, Бухс, ШвейцарияP5368
Протеиназа КDako, Glostrup, DanmarkS3004
Rabbit anti-PCNA Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, СШАsc-33756
Стеклянные горки Superfrost Plus GehardMenzel GmbH, Брауншвейг, Германия10149870
Трис буферизованный физиологический раствор (TBS)Sigma-Aldrich, Букс, ШвейцарияP5912
Тризма основаSigma-Aldrich, Букс, ШвейцарияT1503
Tween 20Sigma-Aldrich, Букс, ШвейцарияP1379
КсилолСигма-Олдрич, Букс, Швейцария534056
штамм данио-рерио (Danio rerio) AB (Орегон)Университет Фрибурга, биологический факультетн.а.Собственное рыбное хозяйство
раствор

Ссылки

  1. Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
  2. Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
  3. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
  4. Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
  5. Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
  6. Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
  7. Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
  8. Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
  9. Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
  10. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
  11. Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
  12. Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
  13. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  14. Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
  15. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
  16. Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10(2012).
  17. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
  18. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  19. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  20. Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
  21. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  22. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  23. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MNUPCNATUNEL
Метилнитрозомочевины (МНУ) -индуцированных дегенерации сетчатки и регенерации в данио рерио: гистологические и функциональные характеристики
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.