Белок Выделение из развивающихся эмбриональных Mouse клапанов сердца регионе

Summary

Анализ экспрессии белка в клапанах молодых эмбрионов мышей был затруднен из-за ограниченного количества доступной ткани. В данной рукописи представлен протокол получения белка из развивающихся эмбриональных областей клапанов мыши для вестерн-блоттинга.

Abstract

Вестерн-блоттинг — это широко используемый метод для обнаружения и количественной оценки уровней белка. Однако для небольших образцов тканей этот метод анализа может быть недостаточно чувствительным для обнаружения белка, представляющего интерес. Чтобы преодолеть эти трудности, мы рассмотрели протоколы получения белка из сердечных клапанов взрослого человека и модифицировали эти протоколы для развивающихся ранних эмбриональных аналогов мышей. Короче говоря, области эмбрионального аортального клапана мыши, включая аортальный клапан и окружающую стенку аорты, собраны в минимально возможном объеме буфера для лизиса на основе Триса с ингибиторами протеазы. Если это требуется в соответствии со стратегией разведения, эмбрионы генотипируются перед объединением четырех областей эмбрионального аортального клапана для гомогенизации. После гомогенизации буфер для образцов на основе SDS используется для денатурации образца для запуска на геле SDS-PAGE и последующего анализа вестерн-блоттинга. Несмотря на то, что концентрация белка остается слишком низкой для количественного определения с помощью спектрофотометрических анализов белка и сохранения образца для последующих анализов, этот метод может быть использован для успешного обнаружения и полуколичественного определения фосфорилированных белков с помощью вестерн-блоттинга из объединенных образцов четырех эмбриональных областей аортального клапана мыши на 13,5-й день, каждая из которых дает примерно 1 мкг белка. Этот метод будет полезен для изучения активации клеточного сигнального пути и уровней экспрессии белков во время раннего развития эмбриональных клапанов мыши.

Introduction

Будучи в состоянии идентифицировать и количественно уровни экспрессии белка является стандартным методом с помощью животных и экспериментов на основе клеток. Однако, несмотря на давний интерес в начале эмбрионального развития сердечного клапана, оценки экспрессии белка в данном конкретном ткани во время развития в настоящее время ограничивается иммуногистохимии как в кур и мыши ^1,2. Часть трудностей в количественной оценки экспрессии белка в развивающихся клапанов большинстве модельных организмов (например, кур и мышей) является небольшой размер клапанов, что ограничивает количество белка, который может быть получен. Таким образом, для количествен....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл на.

1 Акцизный аортального клапана

1. Использование утвержденный технику эвтаназии для эмбриональной стадии интерес, усыпить беременную мышь с щенками в нужное эмбриональный день (E) развития.
2. Используйте 70% этанола для стерилизации живота беременной женщины. Подтяжка кожи и мышцы нижней части живота вверх и от внутренних органов, и препарировать полость внизу живота Откройте самки, чтобы разрешить доступ к роге матки.
3. Чтобы получить рог матки, провести шейку матки ....

Results

Используя эту технику подготовки, мы смогли обнаружить фосфорилированную Smad ^1,5,8 (pSmad) в единичных аорты регионах клапанов от E13.5 эмбрионов. Как показано на фиг.1А, белок, выделенный из даже одного региона клапана достаточно, чтобы обнаружить слабый pSmad группу. Интенсивность сигнала возрастает пропорционально количеству клапанов регионах, которые объединяют. Важно отметить, что / соотношение β-актина pSmad остается почти постоянной между различными размерами выборки (Рисунок .......

Discussion

Возможность количественно уровни белка в раннем эмбриональном мыши и цыпленок регионы клапана сердца обеспечивает дополнительный инструмент для понимания критических событий клеточные сигнальные для развития клапана. Наш протокол, описанный здесь, не сильно отличаются от стандартных процедур выделения белка. Однако, изменив некоторые ключевые шаги, мы успешно получили фосфорилированные белки от чрезвычайно малых размеров выборки. Для достижения этого результата, следующие шаги имеют особое значение. Чтобы гарантировать,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Временная беременность мыши			Препарируется на эмбриональной стадии интереса
Стереоскопический микроскоп	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
Микроножницы	Fine Science Tools	15003-08
Тонкие щипцы, #5	Fine Science Tools	11251-30
Игла для препарирования держатели	Ted Pella Inc.	13560
Иглы для препарирования	Ted Pella Inc.	13561-10
Микропипетка, 20 мкм; l, с наконечниками
Lysis buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	Добавить 1 таблетку в 10 мл лизисного буфера
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Гранулы из нержавеющей стали	Qiagen	69989
Микроцентрифуга