Методическая статья

Белок Выделение из развивающихся эмбриональных Mouse клапанов сердца регионе

DOI:

10.3791/51911

⸱

23 сентября 2014 г.

 ,  , 
1McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 2New York-Presbyterian Hospital/Weill-Cornell Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ экспрессии белка в клапанах молодых эмбрионов мышей был затруднен из-за ограниченного количества доступной ткани. В данной рукописи представлен протокол получения белка из развивающихся эмбриональных областей клапанов мыши для вестерн-блоттинга.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вестерн-блоттинг — это широко используемый метод для обнаружения и количественной оценки уровней белка. Однако для небольших образцов тканей этот метод анализа может быть недостаточно чувствительным для обнаружения белка, представляющего интерес. Чтобы преодолеть эти трудности, мы рассмотрели протоколы получения белка из сердечных клапанов взрослого человека и модифицировали эти протоколы для развивающихся ранних эмбриональных аналогов мышей. Короче говоря, области эмбрионального аортального клапана мыши, включая аортальный клапан и окружающую стенку аорты, собраны в минимально возможном объеме буфера для лизиса на основе Триса с ингибиторами протеазы. Если это требуется в соответствии со стратегией разведения, эмбрионы генотипируются перед объединением четырех областей эмбрионального аортального клапана для гомогенизации. После гомогенизации буфер для образцов на основе SDS используется для денатурации образца для запуска на геле SDS-PAGE и последующего анализа вестерн-блоттинга. Несмотря на то, что концентрация белка остается слишком низкой для количественного определения с помощью спектрофотометрических анализов белка и сохранения образца для последующих анализов, этот метод может быть использован для успешного обнаружения и полуколичественного определения фосфорилированных белков с помощью вестерн-блоттинга из объединенных образцов четырех эмбриональных областей аортального клапана мыши на 13,5-й день, каждая из которых дает примерно 1 мкг белка. Этот метод будет полезен для изучения активации клеточного сигнального пути и уровней экспрессии белков во время раннего развития эмбриональных клапанов мыши.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Будучи в состоянии идентифицировать и количественно уровни экспрессии белка является стандартным методом с помощью животных и экспериментов на основе клеток. Однако, несмотря на давний интерес в начале эмбрионального развития сердечного клапана, оценки экспрессии белка в данном конкретном ткани во время развития в настоящее время ограничивается иммуногистохимии как в кур и мыши 1,2. Часть трудностей в количественной оценки экспрессии белка в развивающихся клапанов большинстве модельных организмов (например, кур и мышей) является небольшой размер клапанов, что ограничивает количество белка, который может быть получен. Таким образом, для количественного анализа, исследователи, как правило, полагаются на экстракции РНК и амплификации для последующего количественного ПЦР или микрочипов анализа 2-5. Тем не менее, уровни экспрессии РНК и белка не полностью корреляционная 6, так упором на выражение РНК не может обеспечить строгий учет многочисленных изменений, которые происходят в той или иной сигнализациипуть в разное время разработок. На основании этого предела в имеющихся в настоящее время методологии, цель этой процедуры в том, чтобы разработать протокол для надежной получения достаточного количества белка из развивающихся эмбриональных мышиных регионах клапана сердца для количественного анализа изменений, происходящих в различных сигнальных путей, которые важны в созревание этой ткани.

Эмбриональные клапаны уже обычно вырезали у мышей для выделения РНК и последующее гена анализа экспрессии 2-5. Тем не менее, эти исследования были ограничены использованием генной экспрессии как считывания сигнализации активации пути, который не позволяет обнаруживать обнаружить посттрансляционные модификации белков, которые могут повлиять нижестоящую передачу сигналов. Используя методы выделения РНК в качестве отправной точки, мы начали с рассекает регионах, представляющих интерес. Потому что наш интерес был обнаружения фосфорилированные белки, которые свидетельствовали о сигнализации погладитьhway активности в течение определенного периода развития клапана аорты (E13.5-14.5), мы провели все вскрытия в фосфатном свободной Трис-буфера и собирали клапанов в Трис-буфере для лизиса, основанной с фосфатазы и ингибиторы протеазы. В нашем конкретном случае, только аорты области клапанов были собраны, но область легких клапана может быть легко получена в то же время. В области клапанов были затем гомогенизируют и в сочетании с буфера выборки, которые в настоящее время используются для изучения экспрессии белка у взрослых сердечных клапанов 7. Используя небольшие объемы проб (например, 2 мкл) и объединения клапанов регионы из эмбрионов с того же генотипа, мы смогли обнаружить фосфорилированные и nonphosphorylated белки в день эмбрионального 13,5 8. Поскольку регионы клапанов можно заморозить и хранить в буфере для лизиса, эмбрионы могут быть генотипированы при необходимости до объединения.

Эта техника расширяет набор инструментов, которые доступны для оценки клеток сигнализаторг путей во время развития и обеспечивает количественный комплимент иммуногистохимии, специально для развивающихся сердечных клапанов. Эта техника должна иметь выгоду не только к кардиологам развития, но и для всех биологов развития, которые работают с ранних эмбрионов на стадии заинтересованы в регионах, которые содержат ограниченный ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл на.

1 Акцизный аортального клапана

  1. Использование утвержденный технику эвтаназии для эмбриональной стадии интерес, усыпить беременную мышь с щенками в нужное эмбриональный день (E) развития.
  2. Используйте 70% этанола для стерилизации живота беременной женщины. Подтяжка кожи и мышцы нижней части живота вверх и от внутренних органов, и препарировать полость внизу живота Откройте самки, чтобы разрешить доступ к роге матки.
  3. Чтобы получить рог матки, провести шейку матки щипцами и осторожно вырезать каудальнее щипцов. Поднимите рог матки, резки любой соединительной ткани, которая держит рог на месте, и завершить удаление путем разрезания стык рога матки с яйцевода.
  4. Поместите расчлененный рог матки в чашку Петри, содержащую седловинеD 0,1 М Трис-буфер (рН 7,6) и промыть, если необходимо. Тогда, сократить рог матки открыт продольно разоблачить эмбриональные мешочки.
  5. Чтобы разоблачить эмбрион, разрезать эмбриональную мешок на стыке плаценты и эмбриона и сократить сосудов пуповины, чтобы освободить эмбрион. Поместите расчлененный зародыш во втором чашку Петри с холодной 0,1 М Трис-буфера. Вернуться первый чашку Петри с остальными undissected эмбрионов до льда до готовности к следующему эмбриона.
  6. Для улучшения груди доступ стены внутри эмбриона, обезглавить эмбриона. Если генотипирование необходимо, снимите и сэкономить лишний кусочек ткани в пробирку Эппендорф помещают на лед.
  7. Поместите эмбриона на его спине, и сократить грудной клетки по вертикали вдоль боковой поверхности грудной клетки, вблизи передних конечностей, так и по горизонтали над диафрагмой для визуализации сердца. Затем откройте грудную стенку, чтобы выставить сердце.
  8. Использование щипцов высоко держать вдоль магистральных сосудов, поднять сердце с помощью щипцов и сократить сосуды ниже.н, на голову выше пинцетом, чтобы освободить сердце. Если легочные сосуды остаются режиссерский, легкие могут быть удалены с сердцем и должны быть удалены, прежде чем продолжить.
  9. Отрежьте легочную артерию выше уровня клапана; на эмбриональной стадии, описанные в данном документе, легочной артерии немного непрозрачным, который помогает в его дискриминации из области клапана. Вырезать чуть ниже клапана легочной артерии, избегая trabeculated миокарда желудочков и собрать как описано в шаге 1,10, если этот регион также представляет интерес. Здесь и на следующем этапе с помощью капиллярного действия, чтобы сделать избыточный буфер Tris от области, представляющей интерес до сбора в буфере для лизиса.
  10. Осторожно снимите аорты дистальнее аортального клапана, непосредственно над уровнем клапана; как легочной артерии, аорта остается слегка матовой в этих эмбриональных стадиях, пособничество в его удалении. Вырезать чуть ниже аортального клапана, снова избегая trabeculated миокарда желудочков, и передаватьклапан с помощью щипцов для Эппендорф трубки с 2 мкл буфера для лизиса (описано в таблице материалов), содержащий протеазы и фосфатазы ингибиторы на льду.
  11. Повторите шаги 1.6-1.10 до клапаны не были вырезали из всех эмбрионов, собирая каждый клапан в отдельном пробирку Эппендорф. Если все эмбрионы имеют одинаковый генотип, все клапаны могут быть собраны в одной пробирке Эппендорфа.
  12. Если генотипирование должны быть выполнены, чтобы определить, какие клапаны, чтобы объединить вместе, сразу поместить образцы в буфере для лизиса при -80 ° С до дальнейшего использования. Образцы могут быть объединены после генотипирования (шаг 2.1.1).

2 Белки Добыча

  1. Оттепель собранные ткани на льду и центрифуге при 13100 х г в течение 1 мин для сбора ткани в буфере для лизиса в нижней части трубки.
    1. Если эмбрионы генотипировали, использовать пипетку осторожно собрать и бассейн лизис буфера, содержащего регионы клапанов из эмбрионов с аналогичными генотипов. Для обеспечения сильное би, объединяя 3-4 клапанов регионов из эмбрионов E13.5 за образец рекомендуется.
    2. Если все эмбрионы были одного и того же генотипа, и все регионы клапанов были собраны вместе в шаге 1,10, лизировать весь образец, как описано в шаге 2.2.
  2. Проверьте объем полученного объединенного образца и добавить лизирующего буфера в общем объеме 40 мкл; Затем, сорвать и гомогенизации образцов, используя 5 мм бусы из нержавеющей стали в Эппендорф. Управляйте lyser для 2-4 мин при 50 Гц, в соответствии с инструкциями изготовителя. Спиновые трубки кратко, (~ 13 100 мкг в течение 1 мин), и передачи образцов в новые пробирки, оставляя позади нерастворимого мусора.
  3. Подготовка и отдельные образцы для SDS-PAGE и передачи для последующего Вестерн-блоттинга, в соответствии с протоколом, таким как Ислами соавт 9. Блоттинга белок управления загрузкой имеет важное значение для количественной оценки белков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя эту технику подготовки, мы смогли обнаружить фосфорилированную Smad 1,5,8 (pSmad) в единичных аорты регионах клапанов от E13.5 эмбрионов. Как показано на фиг.1А, белок, выделенный из даже одного региона клапана достаточно, чтобы обнаружить слабый pSmad группу. Интенсивность сигнала возрастает пропорционально количеству клапанов регионах, которые объединяют. Важно отметить, что / соотношение β-актина pSmad остается почти постоянной между различными размерами выборки (Рисунок ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможность количественно уровни белка в раннем эмбриональном мыши и цыпленок регионы клапана сердца обеспечивает дополнительный инструмент для понимания критических событий клеточные сигнальные для развития клапана. Наш протокол, описанный здесь, не сильно отличаются от стандартных процедур выделения белка. Однако, изменив некоторые ключевые шаги, мы успешно получили фосфорилированные белки от чрезвычайно малых размеров выборки. Для достижения этого результата, следующие шаги имеют особое значение. Чтобы гарантировать,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Андреа Портбери и Дэвина Таунли-Тилсона за критическое прочтение рукописи и NIH (грант # R01HL061656) за финансовую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Временная беременность мышиПрепарируется на эмбриональной стадии интереса
Стереоскопический микроскопNikonSMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
МикроножницыFine Science Tools15003-08
Тонкие щипцы, #5Fine Science Tools11251-30
Игла для препарирования держателиTed Pella Inc.13560
Иглы для препарированияTed Pella Inc.13561-10
Микропипетка, 20 мкм; l, с наконечниками
Lysis buffer50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton
PhosSTOPRoche4906845001Добавить 1 таблетку в 10 мл лизисного буфера
TissueLyser LTQiagen85600
Гранулы из нержавеющей сталиQiagen69989
Микроцентрифуга

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
  2. Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
  3. Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
  4. Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
  5. Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
  6. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
  7. Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
  8. Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
  9. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
  10. Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
  11. Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Development. 127, 1607-1616 (2000).
  12. Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
  13. Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SDS PAGE135

Похожие статьи