Запись токов Ca2+ на лицевой мембране пресинаптического высвобождения является ключом к точному пониманию входа Ca2+ и высвобождения нейротрансмиттеров. Мы представляем острую диссоциацию спинного мозга миноги, которая дает функциональные изолированные ретикулоспинальные аксоны, позволяющие регистрировать непосредственно из высвобождаемой лицевой мембраны отдельных пресинаптических окончаний.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Острая Диссоциация миноги ретикулоспинальных Аксоны активировать запись от выпуска Face мембраны отдельных функциональных пресинаптических окончаниях
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Синаптической передачи является чрезвычайно быстрый процесс. Действие потенциал приводом приток Са 2 + в пресинаптических окончаний, через напряжения закрытого кальциевых каналов (VGCCs), расположенных в релизе лица мембраны, является триггером для слияния пузырьков и высвобождение нейромедиаторов. Решающее значение для быстроты синаптической передачи является пространственная и временная синхронизация между прибытием потенциала действия, VGCCs и высвобождение нейромедиатора машин. Возможность напрямую записывать Ca 2 + токи от выпуска номинальной мембраны отдельных пресинаптических окончаний необходимо для точного понимания взаимосвязи между пресинаптической Са 2 + и высвобождения нейромедиатора. Доступ к пресинаптической релиз лица мембраны для электрофизиологические записи не доступен в большинстве препаратов и пресинаптической Са 2 + запись была охарактеризована с помощью методов визуализации и макроскопического тока MeasureMeНТС - методы, которые не имеют достаточного временное разрешение для визуализации запись Ca 2 +. Характеристика VGCCs непосредственно на отдельных пресинаптических окончаний не удалось в центральных синапсах и до сих пор успешно достигнуто только в чашечки типа синапса куриного мерцательной ганглии и в крысиных чашечек. Мы успешно решили эту проблему в гигантском ретикулоспинальных синапса миноги спинного мозга, разработав остро диссоциированную подготовку спинного мозга, что дает отдельные ретикулоспинальных аксоны с функциональными пресинаптических окончаниях, лишенных постсинаптических структур. Мы можем флуоресцентно маркировать и идентифицировать отдельные пресинаптические терминалы и нацелить их для записи. Использование этого препарата, мы охарактеризовали VGCCs непосредственно на выпуск лице отдельных пресинаптических терминалов, использующих иммуногистохимии и электрофизиологии подходы. Ca 2 + токи были записаны непосредственно на выпуск лица мембраны OF отдельные пресинаптические терминалы, первый такой записи будет осуществляться в центральных синапсах.
Введение
Синаптической передачи является чрезвычайно быстрый и точный процесс. Действие потенциал вторжение в пресинаптических окончаний приводит к открытию VGCCs расположенных в релиз лица мембраны, что привело к росту пресинаптической Са 2 +, действующей в качестве триггера для слияния пузырьков и высвобождение нейромедиаторов 1. Все эти шаги происходят в течение сотен микросекунд 2, и, следовательно, требуют жесткой пространственной сцепление VGCCs в слияния пузырьков машин 3. Пресинаптические Са 2 + потоки были, прежде всего, характеризуется через визуализации подходов с использованием Са 2 + чувствительные....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1 Получение поли-D-лизина гидробромида
- Подготовка 1 мг / мл поли-D-лизина гидробромид в 0,1 М боратного буфера (рН 8,5).
- Алиготе и хранить при температуре -20 ° С.
2 Поли-лизин Покрытие покровные
Примечание: Выполняйте все чистящие и покрытий шаги в камере ламинарного потока.
- Место покровные в чашку Петри, содержащую 1N хлористоводородной кислотой (HCl) в течение 2 часов.
- Аспирируйте все HCl и промыть 70% этанола (этанол) 2-3x.
- Оставьте в 70% EtOH в течение 1 часа.
- Аспирируйте все 70% этанола и промыть 100% этанола 2-3x.
- Оставьте в 1....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Это дает протокола диссоциации здоровые и функциональные изолированные ретикулоспинальных аксоны лишенные постсинаптической прогнозы рис 2F, но которые тем не менее сохраняют функциональные пресинаптические терминалы, способные вызвала синаптических пузырьков экзо-и эндоцитоза рисунке 4с и рис 4d. Разделы изолированных регионах ретикулоспинальных аксонов могут быть четко определены при световой микроскопии быть ясно из любых других нейронных процессов, позволяющих неогр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наш протокол диссоциации Показательно, уступая изолированных ретикулоспинальных аксоны лишенные постсинаптической прогнозы рис 2F, но которые тем не менее сохраняют функциональную пресинаптическое терминалы Рисунок 4с и рисунок 4d. Отсутствие постсинаптических процессов противоположных пресинаптический терминал позволяет прямой доступ записи к пресинаптической релиз лица мембраны в отдельных пресинаптических окончаний, ранее не возможно в центральных синапсах и успешно .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют каких-либо конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана NINDS, RO1NS52699 и MH84874 to SA.
Мы хотели бы поблагодарить доктора Дэйва Фезерстоуна (факультет биологических наук, Университет Иллинойса в Чикаго) за предоставление нам шовного клея, используемого в работе по иммуногистохимии. Мы благодарим Майкла Алперта за его комментарии и корректуру рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,2 & микро; m Шприцевой фильтр | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 мм Покровные стекла | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Фаллоидин | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 конъюгированное козье антитело против кролика вторичное антитело | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Антифриз | Престоун | ||
| Борная кислота | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Источник яркого поля света | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Хлорид кальция | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Коллагеназа типа IA от Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Покровное скольжение | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Декстроза | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Цифровая ПЗС-камера | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Тонкие щипцы для рассечения | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Щипцы для рассечения | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Диссекционный микроскоп | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Диссекционные ножницы | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Диссекционные ножницы тонкие | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Диссекционные ножницы ультратонкие | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Глицин | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Высоковакуумная смазка | Dow-Corning | ||
| Соляная кислота | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Погружное масло | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Промышленный азотный газовый бак | Praxair | UN1066 | |
| Булавки от насекомых | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Жидкий шовный клей | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | Шовный клей, который мы использовали в наших экспериментах, был предоставлен нам другой лабораторией. Он больше не производится. Мы получили гистакриловый шовный клей для будущего использования от Aesculap (Ts1050071FP) |
| Хлорид магния | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Метанол | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| обезжиренное сухое молоко | Технология клеточной сигнализации | 9999S | |
| P-87 Съемник микропипеток | Sutter Instruments | ||
| Параформальдегид | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Перфузионный насос | Cole-Palmer | Masterflex C/L чашка | |
| Петри 100 x 15 мм | Чашка Петри Fisher-Scientific | 875712 | |
| 35 x 10 мм | Fisher-scientific | 875712 | |
| Поли-D-лизина гидробромид | Sigma-Aldrich | P1024 | МВт > 300 000 |
| хлорид калия | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Фосфат калия одноосновной | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Первичные антитела R-типа кальциевого канала | Alomone | Labs ACC-006 | |
| Протеаза типа XIV от Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Лезвия скальпеля | World Precision Instruments | 500240 | |
| Бутылка давления Schot Duran | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Силиконовая трубка для нанесения клея | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Нарезка опорной плиты | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Камера для нарезки | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| хлорида натрия | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Гидроксид | S8045 | ||
| Двухосновной фосфат | натрия Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Тетраборат натрия | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Набор силиконовых эластомеров | Dow Corning | SYLGARD® 160 | Для приготовления смешайте эластомер А и эластомер В 10:1 по весу |
| Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров | Dow Corning | SYLGARD® 184 | Для приготовления смешайте эластомер и отвердитель в соотношении 10:1 по весу |
| Щипцы с тефлоновым покрытием | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Трикейн метансульфонат | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Вибратомные лезвия | World Precision Instruments | ЛЕЗВИЯ | |
| ксеноновой лампы | Nikon |
Ссылки
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 17....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
