Вся цитотоксичность крови для анализа (WCA) является цитотоксичности разработана путем включения технологии позиционирования клеток с высокой пропускной с флуоресцентной микроскопии и автоматизированной обработки изображений. Здесь мы описываем, как лимфома клеток, обработанных анти-CD20-антитела могут быть проанализированы в реальном времени в цельной крови человека, чтобы обеспечить количественный анализ клеточную цитотоксичность.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В режиме реального времени на цитотоксичность в человека цельной крови
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Живых клеток на основе цельной крови цитотоксичности (WCA), что позволяет получить доступ к временной информации от общего цитотоксичности клеток разработан с технологией позиционирования клеток с высокой пропускной способностью. Целевые группы населения опухолевых клеток сначала запрограммированы на иммобилизации в формате массива, и помечены зеленым флуоресцентным цитозольными красителей. После формирования массива клеток, антител препараты добавляются в сочетании с цельной крови человека. Пропидиум йодида (PI) Затем добавляют для оценки гибели клеток. Массив клеток анализировали с автоматической системой обработки изображений. В то время как цитозольный краситель этикетки целевых групп населения опухолевых клеток, PI этикетки мертвые населения опухолевых клеток. Таким образом, процент гибели клеток мишени рака может быть определена количественно путем подсчета количества выживших целевые клетки с числом мертвых клеток-мишеней. С помощью этого метода, исследователи могут получить доступ зависит от времени и зависимости от дозы цитотоксичности клеток информацию. не Примечательно, нет опасных радиохимические вещества используются. WCA представлены здесь была протестирована с лимфомой, лейкемией, и опухолевых клеточных линий твердых. Поэтому, WCA позволяет исследователям оценить эффективность препарата в весьма актуального экс естественных состоянии.
Введение
Последние достижения в области фармацевтической промышленности, привели к увеличению интереса к реализации конкретных идентификацию опухолевых клеток антителами и персонализированных методов лечения рака; Однако, несколько препятствий встречаются в процессе. Только 5% средств, которые обладают противораковой активностью в доклинической разработке лицензированы после показа достаточную эффективность в фазе II-III испытаний 1,2. Доклинические стратегии (как в пробирке и в естественных) субоптимальны как много примеров показали, что противоопухолевые препараты ведут себя по-разному в человеческий и на лабораторных животных, главным образом из-за их разных компонентов крови 3-5.
Для решения о необходимости противоопухолевого скрининга лекарственных препаратов платформы и обеспечить регистрацию точку перед экспериментами дорогостоящим животных и клинических испытаний, в целом человеческой крови цитотоксичность тест (WCA) предлагается для оценки эффективности противоопухолевого лекарства в более подходящей биологической средой.Весь анализ цитотоксичности в крови может быть использован для оценки реакции отдельных клеток с антителами и других лекарств-кандидатов в цельной крови человека.
WCA разрабатывается путем включения высокой пропускной технологии позиционирования клеток с высокой пропускной и высокого содержания изображений 6. При использовании автоматизированной системы формирования изображения, количество живых и мертвых клеток может быть определена с высокой степенью точности. В связи с тем, что клетки-мишени, иммобилизованным на одной и той же фокальной плоскости, WCA способен обеспечить количественный анализ цитотоксичности в режиме реального времени без удаления эритроцитов. Кроме того, автоматическая система визуализации обеспечивает ряд преимуществ, таких как, что только клетки-мишени, которые достигли заданных критериев (например., Флуоресцентно меченых клеток и клеточной морфологии) пропускаются и обработанные. Кроме того, это позволяет получать 144 пластин в день. Следовательно, эта возможность визуализации и пропускная позволяет ход высокой сontent и высокой пропускной экспериментов одновременно. Объединив WCA и автоматизированной системы обработки изображений, высокой пропускной анализ количественного цитотоксичность клеток может быть достигнуто в течение более биологической соответствующей среде.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Целевая Сотовый Подготовка
- Поддержание клеток-мишеней (например. Raji клетки лимфомы) в ростовой среде (RPMI 1640 культуральной среды, с 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 4 нм L-глутамина, и 500 МЕ / мл пенициллина / стрептомицина) при 37 о С в 5% CO 2 инкубаторе.
- Центрифуга образца для осаждения клеток-мишеней в 15 мл пробирку. Центрифугирование времени меняется в зависимости от различных типов клеток; центрифугировать в течение 3 мин при 468 мкг в течение Raji-клеток.
- Во-первых аспирации пузырьки, образованные на поверхности надосадочной жидкости и удалить весь супернатант.
- Добавьте 10 мл PBS на пробирку. Повторное приостановить клеток с помощью пипетки раствор вверх и вниз несколько раз, чтобы разбить клеток глыбу.
- Центрифуга образец в течение 3 мин при 468 х г в.
- Аспирируйте любые пузырьки, образованные на поверхности надосадочной жидкости, и удалить весь супернатант.
2. Приготовление клеточных микрочипов
- ОКрепление btain клеток 96 комплектов также пластинчатые или отдельные массив ячеек 8 камерные хорошо скользит (см таблицу материалов / реагентов).
- Применяют 1,2 мкл активатора к реагенту ДНК из набора. Пробирки закрывают крышками, переверните его и осторожно встряхните, чтобы перемешать раствор.
- Разрешить решение реагировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Применение смешанного раствора к осадку клеток-мишеней (в 15 мл пробирку).
- Добавить зеленой флуоресценции красителей цитозольных в конечной концентрации 500 нМ.
- Инкубируйте клетки-мишени со смешанным раствором и красителя в течение 30 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере.
- Промывают клетки дважды с 5 мл PBS, и клетки вновь суспендируют в 10 мл питательной среды.
- Применение по 100 мкл раствора со стадии 2.7 в каждую лунку. Подсчитайте число клеток с помощью гемоцитометра. Убедитесь, что число клеток в диапазоне между 5 × 10 4 до 1 × 10 6 клеток на лунку.
- После 10-15 мин инкубации при комнатной температуре, аккуратно мыть образцы дважды 200-300 мкл СМИ роста, чтобы удалить любые несвязанных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Около 5-10 мкл питательной среды остается в каждую лунку после мытья.
3. цельная кровь цитотоксичность
- Добавить 180 мкл цельной крови человека в каждом образце хорошо.
- Получение раствора анти-CD20 антитела в количестве 5 мг / мл, и выполняют последовательное разбавление, чтобы сделать 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 мкг / мл раствора анти-CD20 антител в 1,5 мл пробирки. Добавить 20 мкл каждой концентрации анти-CD20-антитела к каждому образцу так что делает трех повторах.
- Добавить йодид пропидия в конечной концентрации 500 нМ в каждую лунку.
- Инкубируйте полученный пластину при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 16 часов.
- Изображение клетки на слайдах или 96-луночных с автоматической системой обработки изображений с 8-кратным увеличением.
- Используйте программу подсчета клеток системы автоматического формирования изображения для количественного определения результатов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение автоматической системы формирования изображения обеспечивает простойшаг за шагом операций для подсчета клеток. Протокол помощью этого программного обеспечения можно найти на веб-сайте провайдера. - Выберите пункт [Проверка Результаты] На главной странице программного обеспечения.
- Выберите [файл, сохраненный для образцов].
- Во-первых ворот FITC средняя интенсивность> 50, то ворота TxRed средней интенсивности> 20.
- Выберите [Plate Обзор].
- Выберите [Экспорт таблицы].
ПРИМЕЧАНИЕ: процент клеток убийство формула программы показан ниже:
% Клеток-мишеней убийство = (кол-во клеток, окрашенных как зеленый и красный / # клеток окрашивали зеленый) * 100%
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Анти-CD20 антитела и клетки лимфомы (Raji клетки и MC / CAR) были выбраны в качестве модельной системы для демонстрации всю цитотоксичности крови анализ (WCA) 7,8. Raji клетки имели высокую числа копий CD20 на поверхности клеток, в то время как MC / CAR-клетки имели низкую числа копий CD20 на их мембраны. Целевые клетки окрашивали первый зеленый с зеленой флуоресценции красителей цитозольных одел на 96-луночного планшета. 10000 - 50000 целевые клетки лимфомы были иммобилизованы в каждую лунку. 180 мкл свежеот...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
WCA является критическим в пробирке против рака скрининга с резолюцией одного сотового 12-16 идеально используемой после традиционных целевых показов, таких как CDC и ADCC анализов 9-11, и до доклинических испытаний на животных. В настоящее время, первичный целевые скрининговые анализы, такие как CDC или ADCC анализов все выполнены в упрощенном сред или буферной системы. Тем не менее, лекарств-кандидатов, которые показывают эффективность в этих упрощенной буферной системы не всегда эффекти...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Мы благодарим программу имать Национальный институт рака от NIH для финансирования этой работы [R33 CA174616-01A1].
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор пластин для ячеек 96 лунок | Adheren | AP9601 | |
| Суспензия Одноклеточная матрица 8-луночная камера | слайд Adheren | SS0801 | |
| Адгезивная Одноклеточная решетка 8-луночная камера | Адхерен | SS0802 | |
| Клеточная линия лимфомы CD20+ | ATCC | CCL-86 | Клетки Раджи |
| Клеточная линия лимфомы CD20-ATCC | CRL-8083 | MC/CAR | |
| RPMI 1640 с L-глутамином | Life Technologies | 11875-119 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Цитозольный краситель | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Зеленый |
| ритуксан (биоаналог) | Eureka Therapeutics | ||
| Цельная кровь человека | Allcells | WB001 | |
| Пропидиум йодид | Sigma | P4170-10MG | |
| Автоматическая система визуализации | Молекулярные устройства Связаться | с поставщиком | Cell Reporter |
| Программа подсчета клеток | Молекулярные устройства | Связаться с поставщиком | Cell Reporter |
Ссылки
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580(2009).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47(2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85(2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
