Вся цитотоксичность крови для анализа (WCA) является цитотоксичности разработана путем включения технологии позиционирования клеток с высокой пропускной с флуоресцентной микроскопии и автоматизированной обработки изображений. Здесь мы описываем, как лимфома клеток, обработанных анти-CD20-антитела могут быть проанализированы в реальном времени в цельной крови человека, чтобы обеспечить количественный анализ клеточную цитотоксичность.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В режиме реального времени на цитотоксичность в человека цельной крови
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Живых клеток на основе цельной крови цитотоксичности (WCA), что позволяет получить доступ к временной информации от общего цитотоксичности клеток разработан с технологией позиционирования клеток с высокой пропускной способностью. Целевые группы населения опухолевых клеток сначала запрограммированы на иммобилизации в формате массива, и помечены зеленым флуоресцентным цитозольными красителей. После формирования массива клеток, антител препараты добавляются в сочетании с цельной крови человека. Пропидиум йодида (PI) Затем добавляют для оценки гибели клеток. Массив клеток анализировали с автоматической системой обработки изображений. В то время как цитозольный краситель этикетки целевых групп населения опухолевых клеток, PI этикетки мертвые населения опухолевых клеток. Таким образом, процент гибели клеток мишени рака может быть определена количественно путем подсчета количества выживших целевые клетки с числом мертвых клеток-мишеней. С помощью этого метода, исследователи могут получить доступ зависит от времени и зависимости от дозы цитотоксичности клеток информацию. не Примечательно, нет опасных радиохимические вещества используются. WCA представлены здесь была протестирована с лимфомой, лейкемией, и опухолевых клеточных линий твердых. Поэтому, WCA позволяет исследователям оценить эффективность препарата в весьма актуального экс естественных состоянии.
Введение
Последние достижения в области фармацевтической промышленности, привели к увеличению интереса к реализации конкретных идентификацию опухолевых клеток антителами и персонализированных методов лечения рака; Однако, несколько препятствий встречаются в процессе. Только 5% средств, которые обладают противораковой активностью в доклинической разработке лицензированы после показа достаточную эффективность в фазе II-III испытаний 1,2. Доклинические стратегии (как в пробирке и в естественных) субоптимальны как много примеров показали, что противоопухолевые препараты ведут себя по-разному в человеческий и на лабораторных животных, главным образом и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Целевая Сотовый Подготовка
- Поддержание клеток-мишеней (например. Raji клетки лимфомы) в ростовой среде (RPMI 1640 культуральной среды, с 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 4 нм L-глутамина, и 500 МЕ / мл пенициллина / стрептомицина) при 37 о С в 5% CO 2 инкубаторе.
- Центрифуга образца для осаждения клеток-мишеней в 15 мл пробирку. Центрифугирование времени меняется в зависимости от различных типов клеток; центрифугировать в течение 3 мин при 468 мкг в течение Raji-клеток.
- Во-первых аспирации пузырьки, образованные на поверхности надосадочной жидкости и удалить весь суперна....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Анти-CD20 антитела и клетки лимфомы (Raji клетки и MC / CAR) были выбраны в качестве модельной системы для демонстрации всю цитотоксичности крови анализ (WCA) 7,8. Raji клетки имели высокую числа копий CD20 на поверхности клеток, в то время как MC / CAR-клетки имели низкую числа копий CD20 на их мембраны. Целевые клетки окрашивали первый зеленый с зеленой флуоресценции красителей цитозольных одел на 96-луночного планшета. 10000 - 50000 целевые клетки лимфомы были иммобилизованы в каждую лунку. 180 мкл свежеот.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
WCA является критическим в пробирке против рака скрининга с резолюцией одного сотового 12-16 идеально используемой после традиционных целевых показов, таких как CDC и ADCC анализов 9-11, и до доклинических испытаний на животных. В настоящее время, первичный целевые скрининговые анализы, такие как CDC или ADCC анализов все выполнены в упрощенном сред или буферной системы. Тем не менее, лекарств-кандидатов, которые показывают эффективность в этих упрощенной буферной системы не всегда эффекти.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Мы благодарим программу имать Национальный институт рака от NIH для финансирования этой работы [R33 CA174616-01A1].
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор пластин для ячеек 96 лунок | Adheren | AP9601 | |
| Суспензия Одноклеточная матрица 8-луночная камера | слайд Adheren | SS0801 | |
| Адгезивная Одноклеточная решетка 8-луночная камера | Адхерен | SS0802 | |
| Клеточная линия лимфомы CD20+ | ATCC | CCL-86 | Клетки Раджи |
| Клеточная линия лимфомы CD20-ATCC | CRL-8083 | MC/CAR | |
| RPMI 1640 с L-глутамином | Life Technologies | 11875-119 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Цитозольный краситель | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Зеленый |
| ритуксан (биоаналог) | Eureka Therapeutics | ||
| Цельная кровь человека | Allcells | WB001 | |
| Пропидиум йодид | Sigma | P4170-10MG | |
| Автоматическая система визуализации | Молекулярные устройства Связаться | с поставщиком | Cell Reporter |
| Программа подсчета клеток | Молекулярные устройства | Связаться с поставщиком | Cell Reporter |
Ссылки
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
