Методическая статья

Секвенирование РНК анализ дифференциальных экспрессии генов в электропорации Чик эмбрионального спинного мозга

DOI:

10.3791/51951

⸱

1 ноября 2014 г.

 , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Universidade de São Paulo

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом видео показаны основные шаги для выполнения анализа полного транскриптома на рассеченных образцах спинного мозга куриного эмбриона после трансфекции с помощью электропорации in ovo.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электропорация нервной трубки цыпленка в яйце является быстрым и недорогим методом идентификации функции генов во время развития нервной системы. Полногеномный анализ дифференциально экспрессируемых транскриптов после такой экспериментальной манипуляции может раскрыть почти полную картину последующих эффектов, вызванных трансфицированной конструкцией. В данной работе описан простой метод сравнения транскриптомов из образцов трансфицированного эмбрионального спинного мозга, включающий в себя все этапы между электропорацией и идентификацией дифференциально экспрессируемых транскриптов. Первый этап состоит из рекомендаций по электропорации и инструкций по препарированию трансфицированных половин спинного мозга из эмбрионов HH23 в среде, свободной от рибонуклеазы, и экстракции высококачественных образцов РНК, пригодных для секвенирования транскриптома. Следующим этапом является биоинформатический анализ с общими рекомендациями по фильтрации и сравнению наборов данных RNA-Seq на публичном сервере Galaxy, что устраняет необходимость в локальной вычислительной структуре для малых и средних экспериментов. Репрезентативные результаты показывают, что методы препарирования позволяют получить образцы РНК высокого качества и что транскриптомы, полученные из двух контрольных образцов, по существу идентичны, что является важным требованием для обнаружения дифференциальной экспрессии генов в экспериментальных образцах. Кроме того, приведен один пример, в котором экспериментальная сверхэкспрессия конструкции ДНК может быть визуально проверена после сравнения с контрольными образцами. Применение этого метода может стать мощным инструментом для содействия новым открытиям в области функции нейронных факторов, участвующих в раннем развитии спинного мозга.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генетические исследования на живых организмах часто используют куриный эмбрион в качестве модели, потому что в ово электропорации представляет собой быстрый и недорогой способ частично трансфекции эмбриональных структур в естественных условиях с ДНК строит 1-5. Бицистронный векторы экспрессии, которые кодируют один транскрипт, содержащий флуоресцентный репортер вместе с представляющим интерес геном, таким как pCIG 6 или 7 ПМЭС, позволяют быстро проверку качества трансфекции в требуемой области под стереомикроскопом до обработки эмбрионов для нисходящего анализа.

С учетом последних достижений в секвенирования ДНК, что теперь можно получить цифровые целые профили экспрессии транскриптом с использованием образцов РНК Секвенирование РНК 8,9. Таким образом, вместо того, чтобы трудоемких методов, которые позволяют анализ лишь несколько генных продуктов в параллель, например, в гибридизация, иммуногистохимии и количественной ПЦР, приготовление библиотек кДНК длявысокопроизводительного секвенирования может предоставить информацию о всей транскриптома. Наблюдение за экспериментальными эффектов на уровни экспрессии каждого отдельного гена может, в свою очередь обеспечивают мощные представление о путях изменены конструкции, используемой. Это особенно легко, если геномной сборка для организма, используемой доступен, таким образом, снова куриного эмбриона является подходящей моделью.

Если пользователь имеет доступ к надежным секвенирования генома центра, главный вопрос заключается в получении образцов РНК высокого качества. Эта работа показывает, к способу получения образцов РНК из трансфицированных нейронных труб, пригодных для Секвенирование РНК, а также на последующих стадиях для силикомарганца в анализе полученных данных. После электропорации в HH12-13 последующим 48 ч инкубации трансфецировали магистральные половинки спинного мозга рассекали в рибонуклеазных свободной условиях, немедленно лизируют и дальше не защищены от разрушения сверхнизким замораживания до очистки РНК и библиотеки подготовка трион.

Общественность сервер Galaxy 10 обеспечивает доступ к бесплатным ресурсам для анализа данных секвенирования высокой пропускной. Объем пространства предложены для зарегистрированных пользователей достаточно для небольших экспериментов, тем самым устраняя необходимость в локальной вычислительной инфраструктуры. Анализ данных Секвенирование РНК включает в себя фильтрацию, выравнивание и количественного / сравнение экспрессии генов. Хотя существуют общие принципы для анализа данных Секвенирование РНК, параметры фильтрации во многом будет зависеть от качества секвенирования и должна быть определена после анализа контроля качества исходных данных.

Этот протокол описывает шаги, чтобы получить и сравнить Секвенирование РНК профили из куриных эмбриональных спинного мозга трансфектированных в естественных условиях. Как представительный результат, сравнение наборов данных, полученных от двух независимых контрольных образцов, трансфицированных пустым вектором, показали, что метод является воспроизводимым и должен позволить идентифицировать дифференциально ExpresSED транскриптов в экспериментальных образцах. Таким образом, применение этого метода имеет потенциал, чтобы значительно увеличить число открытий после одного эксперимента и, таким образом, обеспечить большой набор данных для последующего расследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. электропорации Construct интересов в нейронных труб из HH12-13 куриных эмбрионах В яйце

С помощью флуоресцентного репортера, предпочтительно в бицистронной транскрипта или слитый с представляющим интерес белком с интеркалирующего вирусной 2а пептида 11, с тем чтобы быстро идентифицировать людей с удовлетворительные уровни трансфекции. ПРИМЕЧАНИЕ: Типовое время инкубации для этой стадии составляет около 48 часов при температуре 37,8 ° С.

  1. Открыть небольшое окно в яйцах после удаления 3 мл альбумина с помощью шприца, соединенного с 18 G х 1 1/2 иглы. Для повышения визуализации эмбриона, вводят небольшое количество тушью разведенного 1:50 в стерильного раствора Рингера под эмбриона 1-4.
  2. После покрытия эмбриона с стерильного раствора Рингера, придать 10 мМ Трис-HCl, рН 8,2 и 0,1% пищевой краситель (F, D & C) раствора, содержащего 2,5 мкг не / мкл ДНК через задний конец нервной трубки, пока он заполняетдо заднего мозга области. Для электропорации, платиновые электроды позиции (0,5 мм в диаметре), разделенных на 4 мм 1 по фланкирующего и доставить 5 импульсов 50 мс и 20 V с интервалом 100 мс между ними 4.
  3. После электропорации, инкубировать манипулировать эмбрионов в течение 48 часов больше, пока они не достигнут стадии HH23 и выявления лиц, представляющие высокий уровень трансфекции в боку регионе под флуоресцентным стереомикроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность инкубации после электропорации зависит от цели эксперимента. Электропорированные плазмиды может генерировать значительные уровни экспрессии после 2 ч 2. Таким образом, если интерес заключается в ранних генов наступающими после электропорации Инкубационный период может быть уменьшен.

2. Урожай успешной трансфекции эмбрионов и Рассеките шнур таймах электропорации спинного

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура длится от 2-3 часов за каждые 10 эмбрионов и урожайности 1-2 Мкг общей РНК в зародыше. Рассечение нервных трубок требуется мелкие движения и некоторые практические занятия могут быть необходимы перед его применением в экспериментальных образцах.

  1. Дезактивации металлических инструментов рассечение РНКазой дезактивации раствора или путем обжига при 150 ° С в течение 4 ч 12 и подготовить DEPC обработанных PBS. Используйте только новый сертифицированный РНКазы Пластик.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора урожая, важно следовать стандартное лечение, чтобы предотвратить РНКазы загрязнения во время вскрытия.
  2. Заготавливают эмбрионов, используя пару тонких ножниц рассечения и просеивают ложки сбора. Держите эмбрионов в холодной DEPC обработанных PBS в 100 мм чашки Петри.
  3. С парой тонких пинцетом, вырезать всю фланговую область (между задней границы передней бутон конечностей и передней границы заднего почки конечности) и передать этот раздел для нового блюда, содержащего холодную DEPC обработанных PBS.
  4. Используйте два прекрасных стеклянных игл для перфорации на три разныеуказывает на каждой дорсолатеральной стороне эмбриона между нервной трубки и параксиальном мезодермы.
  5. Введем два стеклянных иголок в центральной перфорацией и медленно переместите один из них далеко вдоль нервной трубки передне-задней оси. Повторите эту процедуру для перфорации, не были достигнуты первые движений. Снимите отдельностоящий параксиальное мезодерму с парой тонких пинцетом.
  6. Поверните эмбрион в сторону, вставьте кончики пинцета между нервной трубки и хорды и сдвиньте их в противоположных направлениях вдоль передне-задней оси, чтобы разделить две структуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это также должно снять большую часть мезодермы еще привязаны к нервной трубки.
  7. При необходимости, удалить крупные куски mesodermic ткани, остаются прикрепленными потянув с пинцетом, слегка удерживая нервную трубку с другим пинцетом. Когда закончите, осторожно перенести нервную трубку в другую блюдо, содержащее холодный DEPC обработанных PBS, используяРНКазы стекло пипетки Пастера в сочетании с механической коробкой пипетки насоса и держать на льду, пока все трубки не расчленены.
  8. Разделите нервные трубки на две половины. Для этого вставьте острый кончик закрытом пинцетом в просвете и открыть верхнюю пластину, перемещая пинцет через него. После этого, разделите половинки разрезанием плиты перекрытия с помощью пинцета советы.
  9. Сорт электропорации от не-электропорации половин под флуоресцентным рамки вскрытии и переносят в 1,5 мл пробирку, наполненную ледяной DEPC обработанных PBS. Если необходимо, щелкнуть микропробирки осторожно, чтобы освободить любой ткани, прикрепленный к пластиковыми стенками и способствовать осаждению трубок.
  10. Спин на 100 мкг в течение 3 сек и удалить очень медленно, как много PBS, как это возможно с 1 мл микропипеткой. Сделайте это, глядя на источник света, который светит через микропробирку контролировать, если любой эмбриональный материал всасывается до кончика пипетки; если это произойдет, постепенно разряжается, и повторить centrifugaции.
  11. Добавить 70 мкл лизиса решение для экстракции РНК в нервных половине трубки и вылить трубку, чтобы перемешать содержимое. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 мин и вихря энергично. Повторите 5 мин инкубации и вихревание еще два раза. Хранить при -80 ° С.
  12. Соберите по крайней мере, восемь половинки нервной трубки на образец, чтобы обеспечить адекватную доходность для следующего шага. Бассейн меньшие образцы, если несколько сеансов электропорации / рассечение обязаны накопить достаточное количество нервных трубок. Храните достаточное образцы для дубликатов или трижды для каждого условия.

3. Очищение РНК и подготовить библиотеки для Illumina Секвенирование

  1. Удалить образцы из -80 ° C хранения и поместить на льду в течение 15-30 мин. не Возобновление оттаивания при комнатной температуре до полного.
  2. Вихревой хорошо и оставить при комнатной температуре в течение 5 мин. Vortex снова и центрифуге при 15000 мкг в течение 1 мин для осаждения нерастворимого материала.
  3. Передача супернатант в новую пробиркуи приступить к добыче РНК в соответствии с полной изоляции РНК инструкции комплект ручных. Элюции в минимальной рекомендованной объема для повышения концентрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДНКазы лечение после очистки рекомендуется во избежание возможного загрязнения геномных последовательностей ДНК в РНК-Seq данных.
  4. Флик трубку, чтобы перемешать содержимое и удалить 5 мкл для анализа контроля качества. Хранить оставшегося образца при -80 ° С до получения библиотеки; эти образцы можно разморозить только один раз, чтобы избежать деградации РНК.
  5. Запустите очищенной РНК в приборе Bioanalyzer помощью Nano комплект РНК 6000; Значение РИН должен составлять, как минимум 7, чтобы продолжить.
  6. Генерация библиотек с использованием совместимого Секвенирование РНК подготовки библиотека комплект Illumina и мультиплексирования до 4 библиотеки в одной полосы в HiSeq инструмента, установленного для генерации 100 б.п. один читает. Если это возможно, включать в себя все образцы в той же перспективе, чтобы минимизировать потенциальные технические артефакты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно дать до 50 млн тEADS на образец, который более чем достаточно, чтобы получить покрытие для большинства генов 13.

4. Сравните Секвенирование РНК наборов данных в Galaxy общественного Server 10.

ПРИМЕЧАНИЕ: место для хранения серверов ограничено и эксперименты, сравнивающие много образцов может потребоваться удаление промежуточных файлов, созданных в шагов фильтрации.

  1. Создайте учетную запись пользователя в публичном сервере Galaxy ( https://usegalaxy.org ) и FTP загружать наборы данных Illumina в формате fastq.
  2. Подготовка загруженные файлы с FastqGroomer 14 инструмента под NGS: КК и манипуляции меню; если баллы качество уже закодированы в Phred + 33 (Sanger), пропустить этот шаг, просто изменив тип файла для fastqsanger под атрибуты для каждого набора данных.
  3. Проанализируйте общее качество каждого набора данных, используя инструмент FastQC под NGS: КК и манипуляции меняню.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание должно быть уделено в результате графики для содержания последовательности в качестве базовой последовательности и в базовой, так как это обеспечит оценки параметров, используемых для отделки концы читает.
  4. Обрезать читает отбросить 3 'концы с низким качеством данных с помощью инструмента FASTQ качества триммер 14 под NGS: КК и манипуляции меню. Установите инструмент для обработки только 3 'концы для показателя качества ниже 20.
  5. Снимите адаптер последовательности из считывает с помощью клипа инструмент ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) под NGS: КК и манипуляции меню. Установите инструмент для отмены читает с менее 45 б.п. слева входной последовательности адаптера, используемого и выбрать выход включать как подрезанные и не обрезается последовательности. Кроме того, выбор не отбрасывать последовательности с неизвестными баз, так как большинство низкие основы качества были уже удалены в последнем шаге.
  6. Используя инструмент Сократить последовательности ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) под NGS: КК и меню манипуляции, обрезать первые основы читает удалить 5 'уклон последовательность, обнаруженную FastQC (обычно 10).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, это хорошая идея, чтобы запустить FastQC снова и сравнить с предыдущим анализом, чтобы определить, была улучшена качество набора данных.
  7. Скачать и распаковать последнюю курица генома сборку для УСК генома браузера от Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) и загрузить файл весь геном Fasta формат и формат файла GTF гены аннотаций в истории Галактики, используя инструмент Загрузить файл под меню Get Data.
  8. Карта читает для каждого образца в курином генома с использованием выпрямитель TopHat2 15 подв NGS: меню РНК анализ. Выберите использовать геном из истории (выберите файл Fasta закачанный в шаге 4.7).
  9. Построить предсказанный транскриптом для каждого образца с помощью Запонки 16 под NGS: меню РНК анализа. Выберите, чтобы использовать справочную аннотацию в качестве руководства (выберите GTF загруженных в шаге 4.7) и включить опции Выполните Bias Correction (от истории, Fasta файла с шагом 4,7) и использовать мульти-читать правильно.
  10. Слияние предсказанные transcriptomes для всех образцов с использованием Cuffmerge 16 под NGS: меню РНК анализа. Выберите, чтобы использовать справочную аннотацию (GTF файл из шага 4.7) и данных о последовательностях (от истории, FASTA файл с шага 4.7).
  11. Сравните BAM файлы, созданные TopHat2 для каждого образца, используя Cuffdiff 16 под NGS: меню РНК анализа. В полевых стенограммы выберите меняrged транскриптомный генерируется Cuffmerge и включить опции Выполните Bias Correction (от истории, Fasta файла с шагом 4,7) и использовать мульти-читать правильно.
  12. Сортировать дифференциальное выражение тестирования таблицы численно восходящие в столбце 13 (д стоимости) с помощью приспособления Сортировать под фильтр и меню сортировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гены / стенограммы, показывающие существенное дифференциальную экспрессию между экспериментальных условиях представит самые низкие значения Q.
  13. Чтобы проверить результаты визуально с покрытия графиков, сначала преобразовать BAM файлов в формате bedGraph используя инструмент Создать BedGraph покрытия генома 17 под меню BEDTools. Отключить отчетность регионах без покрытия, выбрать для лечения сплайсированные записи как отдельных интервалов и масштабировать покрытие с коэффициентом, который нормализует глубину секвенирования для всех наборов данных сравниваемых.
  14. Преобразование полученного bedGraph файл в формат воротила с помощьюПарик инструмент / BedGraph-на-воротила ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) в меню конвертировать форматы. Загрузите воротила файлы как пользовательские треки в геноме браузера УСК ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) для сборки galGal4 и поиск интересующего гена визуализировать освещение в наборах данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для проверки метода, описанного, две контрольные образцы были получены из эмбрионов электропорации с пустой вектор ПМЭС 7 и одного образца из эмбрионов, трансфицированных вектором, содержащим же вставка построить SCRT2-ZNF, который кодирует цинк-пальцев домены куриного SCRT2 18. Образцы, дающие 11-22 мкг общей РНК были получены друг из пулов 8 до 12 эмбрионов. Все три образца забил оптимальное значение РИН из 10 в проверке качества выполненных с прибором Bioanalyzer (рисунок 1), де...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы предлагаем рекомендации для анализа эффектов после электропорации куриного спинного мозга. Хотя электропорации векторов ДНК чаще используется для гиперэкспрессией гена интереса, можно также использовать конструкции, кодирующие доминантные негативов, quimeric белки или прекурсоры в миРНК для создания условий функция гена бросовым 19-21. На самом деле, сравнение транскриптом профили в результате как амплитудно и потери от-функции анализа могут указать на гены разному экспрессируются в противоположных н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CYIY поддерживается FAPESP (2012/14421-5), а FMV поддерживается стипендией FAPESP (2009/53695-0). Мы благодарим DNA Technologies Core из Калифорнийского университета в Дэвисе за подготовку и секвенирование библиотек RNA-Seq, используемых в этой работе, команду Galaxy за предоставление отличного и бесплатного интерфейса для высокопроизводительных инструментов анализа данных секвенирования и доктора Марианну Броннер за предоставленную возможность вести съемки в ее лабораторном пространстве.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Индийские чернилаЛюбой поставщик
18G x 1 1/2 иглаBD305196
шприц 3 млBD309657
TrisMP Biomedicals819620
F D & C Blue 1Spectra Colors Corporation5.FC.0010P0Пищевой краситель, используемый для визуализации инъекции ДНК
Раствор Рингера (1 л)
      - 7,2 г NaClSigma-AldrichS-9888
        - 0,37 г KClSigma-AldrichP-4504
        - 0,225 г CaCl2• 2H2OFisher Scientific10043-52-4
        - 0,217 г Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS-9390
        - 0,02 г KH2PO4Sigma-AldrichP-5379
        - ddH2O до 800 мл и отрегулировать pH до 7,4
        - ddH2O to 1 L
        - Фильтр и автоклав
PBS (фосфатный буферный раствор) (1 л)
      - 8 г NaClSigma-AldrichS-9888
        - 0,2 г KClSigma-AldrichP-4504
        - 1,15 г Na2HPO4• 7H2OSigma-AldrichS-9390
        - 0,2 г KH2PO4Sigma-AldrichP-5379
        - ddH2O до 800 мл и отрегулировать pH до 7,2
        - ddH2O до 1 л и filter
        - 1 мл DEPC (Диэтилпирокарбонат)Sigma-AldrichD-5758
        - Энергично встряхните и дайте постоять ночь при комнатной температуре
;       - Автоклав
Просеянная ложкаЛюбой поставщик
Стерильные 60 x 15 мм Чашки Петри из полистиренаCorning Life Sciences351007
РНКазеZap РНКаза раствор для обеззараживанияLife TechnologiesAM9780
Тонкие хирургические ножницыЛюбой поставщик
Прямой тонкий пинцетЛюбой
поставщик Тянущая стеклянная игла из стеклянных капиллярных трубок 1,1 x 75 ммKimble Chase40A502
9'' Пипетка ПастераЛюбой поставщик
Ручной насос для пипеткиЛюбой поставщик
Прозрачная микроцентрифуга 1,5 мл полипропиленовая пробиркаCorning Life SciencesMCT-150-C
МикроцентрифугаЛюбой поставщик
РНКпозднее решение для стабилизации РНКLife TechnologiesAM7020
РНКводный набор для выделения общей РНКLife TechnologiesAM1912
Молекулярная биология Сорт этаноллюбого поставщика
РНК 6000 Нано-наборAgilent Technologies5067-1511
2100 Электрофорез Биоанализатор AgilentTechnologiesG2939AA
Набор для подготовки образцов РНК Truseq v2IlluminaRS-122-2001/RS-122-2002

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
  2. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
  3. Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
  4. Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
  5. Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
  6. Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.
  7. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
  8. Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
  9. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  10. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86(2010).
  11. Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40(2008).
  12. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).
  13. Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
  14. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
  15. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36(2013).
  16. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
  19. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
  20. Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
  21. Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
  22. Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141(2009).
  23. Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
  24. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in ovoGalaxyFASTQ Quality TrimmerCufflinks

Похожие статьи