Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Распространение

11.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51953

⸱

25 сентября 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы приводим протокол для распространения Homalodisca vitripennis клетки и HoCV-1 в пробирке. Среду удаляли из HoCV-1 положительных культур и РНК, выделенная каждые 24 ч для 168 часов. Сотовый живучесть количественно путем окрашивания трипановым синим. Целые вирусные частицы были извлечены после инфицирования. Извлеченные РНК оценивали количественно путем Qrt-PCR.

Аннотация

Стекловидный крыльями снайпер (Homalodisca vitripennis) является весьма vagile и многоядны насекомое найти по всему юго-западе США. Эти насекомые являются преобладающими векторы Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), ксилемы ограниченной бактерия, которая является возбудителем болезни Пирса (PD) виноградной лозы. Болезнь Пирса является экономический ущерб; Таким образом, H. vitripennis стали мишенью для стратегии управления патоген. Dicistrovirus определены как Homalodisca coagulata вируса-01 (HoCV-01) была связана с повышенной смертностью в H. vitripennis населения. Потому что клетка-хозяин требуется для HoCV-01 репликации, культура клеток обеспечивает единую среду для целевого репликации, которая логистически и экономически ценным для производства биопестицидов. В этом исследовании, системы для широкомасштабного распространения H. vitripennis клетки через культуре ткани была разработана, рредоставление вирусную механизм репликации. HoCV-01 был извлечен из целых насекомых тела и использовали для инокуляции культурный H. vitripennis клетки при различных условиях. Культуральную среду удаляли каждые 24 ч в течение 168 часов, РНК экстрагировали и анализировали с Qrt-PCR. Клетки окрашивали трипановым синим и подсчитывали количественно клеток живучесть с использованием световой микроскопии. Целые вирусные частицы были извлечены до 96 часов после заражения, которое было время точка определена как до возникновения полный крах культуры клеток. Клетки также подвергаются флуоресцентной окраски и просматривать с помощью конфокальной микроскопии для исследования вирусной активности на F-актин привязанности и ядер целостности. Вывод этого исследования является то, что H. vitripennis клетки способны культивируются и используются для массового производства HoCV-01 на подходящем уровне, чтобы позволить производство биопестицида.

Введение

Стекловидный крыльями снайпер (Homalodisca vitripennis Germar 1821) была определена в качестве основного вектора Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), возбудителя болезни Пирса виноградной лозы (PD) в Северной Америке 1. Насекомое населения управления быстро стал основным направлением научных исследований в целях борьбы с этой страшной проблемы в виноградарско промышленности в Калифорнии и по всей южной части Соединенных Штатов. Положительным смысле, одноцепочечной РНК вируса, принадлежащий к семейству Dicistroviridae, Homalodisca вирус-01 coagulata (HoCV-01) был определен в дикой H. населения vitripennis и показано, что увеличение смертности в тех популяциях 2-4, в то время как понижение сопротивляемости насекомого к инсектицидам.

Разработка методов для эффективного заднего инфицированных H. vitripennis к взрослой жизни в лабораторных условиях было трудно, потому что H. vitripennis имеют различные сценические конкретных потребностей в питании, которые требуют различные растений-хозяев 5-8. Конкретные объекты обязаны задней живой H. vitripennis в США; Поэтому, культуры клеток является более экономичным и жизнеспособной альтернативой, а также все более важным для HoCV-01 обнаружения и репликации 2,9. В то время как основные методы для создания клеточных культур H. vitripennis описаны эти методы еще не были использованы для промышленного производства биологических средств защиты, таких как вирусы 2.

Общая цель из следующих процедур является создание высокой концентрации HoCV-01, пригодного для использования в качестве агента биологической борьбы. Вирусной репликации требуется живую клетку, поэтому успешно культивируя и оптимизации H. vitripennis культуры является жизненно важным для прогресса производства выгодные уровни вируса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 Культура клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Homalodisca vitripennis клеточные линии, установленные в лаборатории д-р Уэйн Хантер в Службы сельскохозяйственных исследований Министерства сельского хозяйства США (. Ft Pierce, FL США) были использованы для организации лаборатории запас, состоящий из этапов смешанных клеток, включая начальных фибробластов и монослоев.

  1. Выполните следующие процедуры в стерильной окружающей среде лаборатории, поддерживаемой при температуре в диапазоне 20-24 ° С с 25 см 2 колбы с культурой.
  2. Развивайте и поддерживать культуру в 25 см 2 колбах для культуры ткани с помощью H2G + цикадкой среды, изменение WH2 пчелы СМИ 10 (Таблица 1).
  3. Выдержите культуры колбы при 24 ° С с ~ 53% влажности.
  4. Используйте инвертированного микроскопа в общее увеличение (TM) из 100X контролировать рост культуры, например, проверить наличие аномального клеточного роста, следить за любых потенциальных загрязняющих веществ, и проверить ход роста по культура поверхности.
  5. Выполните полное среднее изменение (~ 4 мл культуральной среды в колбе) каждые 7 - 10 дней, не нарушая поверхность культуры.
  6. Pass культур, когда поверхность культуры составляет примерно 80% покрыта роста клеток (сливной) с использованием 0,25% трипсина, содержащий этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) для диссоциации клеток. Добавить ~ 2 - 3 мл трипсина каждому колбу культуры и подвергать культуру (ей) фермента в течение коротких периодов времени (5 - 10 мин) для достижения полной диссоциации клеток.
  7. Добавить равное количество свежей среды в колбу культуры (ы) (~ 2 - 3 мл), чтобы остановить ферментативную активность, и передавать весь раствор в коническую пробирку для центрифугирования.
  8. Гранул клетки центрифугированием при 4 ° С в течение 6 мин при 350 х г в.
  9. Удалить супернатант, не нарушая клеточный осадок и добавить ~ 8 мл свежей среды в каждую пробирку. Аккуратно гомогенизации клеток с помощью пипетки.
  10. Сплит культуры на 1: 2 Коэффициент для 25 см 2 колбы (~ 4 мл клеточной Solutiна за колбу) и оставить только что прошли культуры в покое на 48 часа, чтобы позволить клеток в суспензии надежно прикрепить к поверхности колбы.
    Примечание: Культивирование клеток в 48-луночных стерильных тканей культуральных планшетах с поверхности роста 1 см 2 также возможно, и они могут быть сохранены в том же образом, как и культуральных колбах со снижением объема культуральной среды до ~ 250 мкл.

2 Всего Вирус Добыча

  1. Перемешать все тело вируса положительного H. не vitripennis в фосфатный буфер, рН ~ 7,2, с 0,02% диэтилдитиокарбамат натрия тригидрата (DETCA) встряхиванием в течение ~ 10-секундными интервалами, пока нет более большие скопления ткани настоящему. Экстракт вирус через Superspeed центрифугированием при 124500 х г в течение 4 ч при 4 ° С или 22 000 мкг в течение 16 ч при 4 ° С. Если образуется осадок в верхней части, удалить его с помощью стерильного тампона хлопка 11.
  2. Удалите супернатант.
  3. Соберите осадок ирастворить с 5 мл 10 мМ фосфатного буфера (без DETCA), рН ~ 7,2, содержащий 0,4% Na-дезоксихолевой кислоты и 4% полиэтиленгликоль гексадецил эфир (Brij 52).
    1. Для смешивания гранул и, удалить осадок со стороны трубки и не давить до тех пор в растворе, если это необходимо.
    2. Добавить еще 10 мМ фосфатного буфера в ~ 5 мл шагом, чтобы помочь осадок переходит в раствор и при необходимости объединить в 2 трубок 11.
  4. Центрифуга решение в 300 мкг в течение 15 мин 11.
  5. Удалить супернатант и пройти раствора через 0,45 мкм фильтр, и собрать фильтрат в большой пробирку 11.
  6. Передача фильтрат в диализной мембраны с молекулярной массой отрезаны (MWCO) 3,5 кДа, при помощи небольших количеств 10 мМ фосфатного буфера (рН 7) при необходимости 11, не содержащий DETCA.
  7. Поместите диализной мембраны в большой химический стакан, наполненный DDH 2 O при 4 ° С. Меняйте DDh 2 O каждый час Fили 5 - 6 ч, до белого осадка форм в мембране 11.
  8. Сбор очищенного вируса в мембрану и подвергать 100% вирусов раствора до 10-кратного серии разведений путем добавления 10 мкл раствора 90 мкл DDH 2 O. Впоследствии не добавить 10 мкл разведения в еще 90 мкл DDH 2 O до достижения разбавление 1: 100 000.
  9. Магазин вирусный раствор при -80 ° С.

3 вирусной репликации

  1. Семенной клеток в культуре пластин 48-а и расти все строки до роста клеток не 80% сливной (примерно 72 часов после прохода, если клетки растут со средней скоростью).
  2. Привить каждую строку клеток с серийным разбавленной вируса раз рост клеток достигает слияния, то есть, один ряд разведении 1:10, одна строка 1: 100 разбавления, и т.д., для верхнего ряда, за исключением. Используйте верхнюю строку в качестве контроля и добавить 10 мкл DDH 2 O друг также регулятором громкости.
    1. Для того чтобы установить начальный концентрации исходных клеток для сравнения с экспериментальными пунктам клеток, диссоциируют и считать первую лунку каждого ряда до первоначального посева любых скважин в культурах с вирусом.
  3. Монитор пластин культуры каждые 24 ч после инокуляции вируса для любого изменения цвета в среде с указанием изменения рН и для любых изменений в морфологии клеток.
  4. Изображение один столбец испытательной пластине в каждый момент времени, с использованием инвертированного микроскопа в 100X TM.
  5. Удалить все средние из колонки, которая была изображаемого в каждый момент времени 24 ч и хранить его краткосрочные при -20 ° С в течение экстракции РНК и вирусной количественного или долгосрочной перспективе при -80 ° С.
  6. Диссоциируют клетки из лунок после удаления среды, как описано выше, с шагом 1,6 - 1,9, используя только ~ 250 мкл 0,25% трипсина ЭДТА и свежей средой, чтобы остановить активность ферментов и ~ 250 мкл свежей среды, чтобы повторно приостанавливать клеток Pelleт.
  7. Добавить 10 мкл 0,4% трипанового синевы в каждую пробирку, содержащую клетки для выполнения количество клеток после клеточной диссоциации для каждого периода 24 ч над одной недели. Разрешить пятно сидеть в течение 10 мин перед выполнением количество клеток.
    1. Выполните количество клеток в 1 ч экспозиции окрашивать или жизнеспособных клеток начнет поглощать пятно, а также нежизнеспособных клеток.
  8. Медленно добавляют 10 мкл окрашенного раствора клеток в каждую сторону от стандартной гемоцитометра с помощью микропипетки. Разрешить решение быть принято до под действием капиллярных сил, чтобы избежать воздушных пузырей.
  9. Подсчитайте количество жизнеспособных (не окрашенных) клеток с обеих сторон гемоцитометре (эквивалент 4 пунктам 16 квадратов в гемоцитометре). Выполните количество клеток для каждой лунки колонны, которая была удалена.
  10. Среднее значение на основании количества клеток из каждого столбца и использовать следующую формулу, чтобы получить общее количество количество элементов: (среднее количество клеток / 4) фактора х разбавления = количество ячеек х 10 4 мл. Это плотность клеток или количество жизнеспособных клеток в культуре.

4 Вирус Извлечение из клеточной культуре

  1. Удалить обработанную H. vitripennis клетки из культуральных колбах, как описано выше в пунктах 1.6 - 1.8, с использованием только ~ 250 мкл 0,25% трипсина ЭДТА и свежей средой, чтобы остановить ферментативную активность.
  2. Удалите супернатант.
  3. Выписка вирус из клеток культуры в соответствии с протоколом, описанным ранее в шагах 2,3 - 2,8.

5 Экстракция РНК

  1. Извлечение РНК из средних проб, взятых во время каждого вируса суда одну неделю с помощью гуанидина добычу тиоцианат-фенол-хлороформ, предназначенный для жидких образцов в протоколе производителя.
  2. Магазин экстрагируют образцы при -80 ° С.

6-ПЦР

  1. Создание вирусных стандарты для ОТ-ПЦР, выполнив традиционной ПЦР с использованиемпара праймеров HoCV ОТ-ПЦР праймер 1 (вперед 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', обратный 5'-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') с вирусом изолировать от всей H. тела vitripennis.
  2. С учетом ПЦР-продукт гель-электрофорезу в течение 60 мин при 120 В в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия 0,1%.
  3. Акцизный полос из геля и очищают с использованием набора для экстракции гелей согласно протоколу производителя.
  4. Бассейн все вырезали и очищали в геле продукт и далее очищают основной осаждения этанолом. Элюции осадков продукт в приблизительно 30 мкл Трис ЭДТА (ТЕ), чтобы повысить общую концентрацию образца.
  5. Количественной оценки уровня кДНК в объединенных пробах с помощью спектрофотометрии с использованием 260/230 настройки длин волн для обнаружения нуклеиновых кислот.
  6. Выполните десять раз серийный ряд разбавления очищенного образца в диапазоне от 57 нг / мкл до 57 Ag / мкл (10 -18). Выполнение серийное разведение аналогично описанному Iн 2.8 с корректировками на разницу в требованиях концентрации.
  7. Определить пределы обнаружения серии разбавления, выполняя Qrt-ПЦР с использованием набора Qrt-ПЦР с надежной количественной оценки низкой численности транскриптов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные концентрации ниже, чем 5 × 10 -3 копий, не могут быть обнаружены.
  8. Извлечение РНК из экспериментальных образцов, как описано выше в шаге 5.1 и количественно с помощью спектрофотометрии.
  9. Нормализовать все извлеченные образцы до 5 нг / мкл, используя нуклеазную бесплатную воду.
  10. Выполните Qrt-ПЦР на всех образцах, в двух экземплярах, а 25 мкл реакции с использованием одностадийного Qrt-ПЦР-комплект с возможностью ощутить низкие числа копий следующим образом: 50 ° C удерживайте в течение 10 мин; 95 ° C удержания в течение 5 мин; 30 циклов 95 ° С в течение 10 сек, 60 ° С в течение 30 сек; расплава от 50 - 99 ° С в течение 5 сек на каждом шаге.
    1. Сделайте основной смеси таким образом, чтобы каждый реакционную смесь содержит 12,5 мкл 1х MASTEг смеси, 1,0 мкл (0,3 мкМ) прямого праймера, 1,0 мкл (0,3 мкмоль) обратного праймера, 0,25 мкл обратной транскриптазы и различным количеством шаблона на основе значений по стандартизации.
    2. Довести общий объем реакционной смеси до 25 мкл с РНКазы свободной воды.
    3. Включить пять стандартные концентрации в каждой ПЦР работать со следующими числа копий: 5 х 10 -10, 5 х 10 -8, 5 х 10 -6, 5 х 10 -4, и 5 х 10 -2 копии. Установка порога для каждого запуска, чтобы чуть ниже флуоресценции 10x -2,5, чтобы снизить уровень шума во время раннего приобретения в начале каждого прогона.

7 конфокальной микроскопии

  1. Рост клеток Homalodisca vitripennis в двенадцать луночного планшета, содержащего покровные стекла измерительных диаметром 18 мм в каждую лунку.
  2. Посев один столбец на пластине каждые 24 ч в течение четырех дней, раз в монослой достигнута. Убедитесь, что каждый сЗаголовки столбцов содержит контрольный колодец, низкой вирусной разбавления (1:10) ну и высокая вирусная разбавления (1: 100 000) также. Используйте антивирусные решения, полученные с шага 2.8.
  3. Извлеките все носители на пятый день и мыть клетки дважды 1x PBS (рН 7,4).
  4. Зафиксировать клетки с холодной 4% параформальдегида при 4 ° С в течение 30 мин.
  5. Добавить 500 мкл 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) к клеткам и мыть их в течение 10 мин при комнатной температуре на качалке при низкой скорости. Вымойте клетки три раза.
  6. Добавить 500 мкл 0,1% Triton X-100 в клетки проницаемыми для их. Дайте настояться в течение 10 минут при комнатной температуре.
  7. Промывают клетки снова, как описано выше в пункте 7.5.
  8. Добавить 500 мкл 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) раствор для блокирования клеток при комнатной температуре. Дайте настояться в течение 2 часов, а затем удалить.
  9. Развести складе родамин красный-сопряженных фаллоидина (RCP) 1: 250 в 1x PBS, содержащий 5% BSA и добавить 250 мкл разведения в каждую лунку, чтобы пятно для F-актина.
  10. Крышка в алюминиевой Fмасла, чтобы предотвратить краску от отбеливания и инкубируют клетки при 4 ° С CO / N.
  11. Снимите RCP после 12 ч инкубации и заменить его 250 мкл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (250 мкг / мл) разводят в 1x PBS, содержащим 5% BSA, для окрашивания ядра клеток .
  12. Инкубируйте клетки, содержащие DAPI при комнатной температуре в течение 1 часа.
  13. Промывают клетки три раза 1х PBS, как описано выше в пункте 7.5.
  14. Аккуратно удалите покровные из скважин и установки для Предметные помощью монтажной СМИ с анти-выцветанию реагента.
  15. Разрешить слайды сушить в светонепроницаемые ящики пока не рассматривается под конфокальной микроскопии. Посмотреть подготовлены слайды как можно скорее, как красители могут быстро исчезать.
  16. Окрашивали Image ячеек с помощью конфокальной систему, оснащенную микроскопом, содержащей 63X (масло) план-apochromate объектив.
    1. Установите лазерных длин волн 543 ± 10 нм возбуждения и 575 ± 10 нм излучения для Rhoadmine красно-Сопряженное фаллоидином, И 369 ± 10 возбуждения нм и 450 ± 30 нм выбросов для DAPI.
    2. Используйте одинаковую прибыль и величину настройки для детектора для получения всех изображений.
    3. Изображения процесса с использованием соответствующего программного обеспечения для обработки изображений и сортировки и импорт необходимых изображений в управляющей программного обеспечения изображения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Прикрепление клеток и рост наблюдался в течение 48 часов прохождения в малых и больших колбах культуры, из первичных культур и продолжающихся проходов. Роста фибробластов и развитие наблюдалось также в течение этого времени. Когда недавно посеянные Колбы нарушается до 48 часов, было видно снижение прикрепление клеток, что приводит к медленно растущим культур, а иногда и нет привязанности или роста вообще. Клетки примерно 80% сливной течение одной недели мимоходом и формируется монослой через 10-14 дней (рисунок ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Рост беспокойства в отношении притока инвазивных сельскохозяйственных видов привели к увеличению спроса на новых методологий по защите от новых вредителей и патогенов. В центре внимания профилактике заболеваний и управления включает в себя управление патогенных векторов и было основной целью данного исследования. Экономика играть жизненно важную роль в решении производить этот тип биопестицида управлять патогенных векторов в сельском хозяйстве, потому что практическое применение должно быть большое количество на больших...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Техасскую программу исследований и образования в области болезни Пирса и USDA-APHIS за их финансовую поддержку этого проекта. Мы также хотели бы поблагодарить Хему Котари из Центра медицинских наук Техасского университета в Тайлере за ее помощь в проведении конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Колбы для клеточных культур CorningSigma AldrichCLS430168Площадь поверхности 25 см2, скошенная горловина, колпачок (заглушка)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71OlympusИнвертированный микроскоп и фотоаппарат
Trypsin-EDTA solutionSigma AldrichT40490,25%, стерильно отфильтрованный, биореагент, подходит для клеточной культуры, 2,5 г трипсина свиньи и 0,2 г ЭДТА и быка; 4Na на литр Hanks′ Сбалансированный солевой раствор с феноловым красным
Greiner CELLSTAR мультилуночные культуральные планшетыSigma AldrichM893748 лунок (ТС обработанный крышкой)
DETCASigma Aldrich228680Тригидрат натрия диэтилдитиокарбамат тригидрат
Corning бутылочная вакуумная фильтрующая системаSigma AldrichCLS431206Мембрана из ацетата целлюлозы, размер пор 0,45 мкм; m, площадь мембраны 54,5 см2, емкость фильтра 500 мл
Brij 52 SigmaAldrich388831Полиэтиленгликоль гексадециловый эфир
Фосфатный буферный растворSigma AldrichP5244Получен в виде 100 мМ разбавленный до 10 мМ стерильной водой
TRIzol LSLife Technologies10296-028
AgaroseSigma AldrichA5304Для электрофорез
Бромид этидияSigma AldrichE7637BioReagent, для молекулярной биологии, порошок
QIAquickQiagen28704
QuantiTect qRT-PCR kitQiagen204243
4% параформальдегидSigma AldrichP6148Реагент марки, кристаллический
PBSSigma AldrichP5368Фосфат буферный физиологический раствор
Triton X-100Sigma AldrichX100
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma AldrichA2153
Родамин красный конъюгированный фаллоидинLife TechnologiesR415Родамин фаллоидин представляет собой высокоаффинный F-актиновый зонд, конъюгированный с красно-оранжевым флуоресцентным красителем, тетраметилродамином
DAPISigma AldrichD9542
Реагент ProLong Gold AntifadeLife TechnologiesP36934
LSM510 Мета конфокальная системаCarl Zeiss
LSM Zen 2007 Программное обеспечениеCarl Zeiss
Grace' s Среда для насекомых (дополненная, 1x)Sigma AldrichG8142H2G+ цикадка средний компонент
L-гистидина моногидратSigma AldrichH8125H2G+ цикадка средний компонент
Средний 199 (10x)Sigma AldrichM4530H2G+ цикадка средний компонент
Средний 1066 (1x)Sigma AldrichC0422H2G+ цикадка средний компонент
Хэнк s Сбалансированные соли (1x)Sigma Aldrich51322CH2G+ цикадка средний компонент
L-глутамин (100x)Sigma AldrichG3126H2G+ цикадка средний компонент
MEM, смесь аминокислот (50x)Sigma Aldrich56419CH2G+ цикадка средний компонент
1 M раствор MgCl SigmaAldrichM8266H2G+ цикадка средний компонент
Pen-Strep (с глутамин)Sigma AldrichG6784H2G+ цикадка среднего компонента
НистатинSigma AldrichN6261H2G+ цикадка среднего компонента
GentamycinSigma Aldrich46305H2G+ цикадка среднего компонента
DextroseSigma AldrichD9434H2G+ цикадка среднего компонента
Фетальная бычья сывороткаSigma AldrichF2442H2G+ среднекомпонентная цикадока

Ссылки

  1. Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
  2. Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
  3. Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
  4. Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
  5. Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
  6. Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
  7. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
  8. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
  9. Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
  10. Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
  11. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).
  12. Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
  13. Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
  14. Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
  15. Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
  16. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
  17. Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
  18. Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).
  19. Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
  20. Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Репликация вирусаэкстракция РНКанализ методом ОТ-ПЦР в реальном времениконфокальная микроскопияокрашивание трипановым синимсверхскоростное центрифугированиефильтрация через диализную мембрануколичественное определение вируса
Распространение
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.