В этой статье мы демонстрируем стандартный метод получения эмболической окклюзии средней мозговой артерии с гомологичными сгустками крови (богатыми фибрином) у взрослой крысы. Данная модель близко имитирует ишемический инсульт человека и подходит для доклинического изучения тромболитической терапии ишемического инсульта.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эмболические средней мозговой артерии Окклюзия (MCAO) для ишемического инсульта с гомологичными сгустки крови у крыс
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Клинически, тромболитическая терапия с использованием рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (ТАП) остается наиболее эффективным средством для лечения острого ишемического инсульта. Тем не менее, использование ТАП ограничивается его узким терапевтическим окном и с повышенным риском геморрагической трансформации. Существует настоятельная необходимость в разработке подходящих моделей инсульта изучать новые тромболитических препаратов и стратегий для лечения ишемического инсульта. В настоящее время, два основных типа ишемических моделей инсульта были разработаны в крыс и мышей: внутрипросветной шовного MCAO и эмболии MCAO. Хотя модели MCAO через внутрипросветной техники шва широко используются в механизме управляемой исследований инсульта, эти модели шовные не имитировать клиническую ситуацию и не подходят для тромболитических исследований. Среди этих моделей, эмболии модель MCAO точно имитирует ишемический инсульт человека и подходит для доклинических исследования тромболитической терапии. Эта модель эмболии была впервые разработана в крыс О.В.ergaard др. 1 в 1992 году и далее характеризовали Zhang и соавт. в 1997 году 2. Несмотря на то, эмболии MCAO приобрела все большее внимание, есть технические проблемы, с которыми сталкиваются многие лаборатории. Для удовлетворения растущих потребностей в тромболитической исследований, мы представляем хорошо воспроизводимый модель эмболии MCAO на крысах, которые могут развиваться предсказуемый объем инфаркта в пределах территории MCA. Вкратце, модифицированный трубки ПЭ-50 слегка расширенный от наружной сонной артерии (ECA) в просвет внутренней сонной артерии (ВСА) до кончика катетера достигает происхождение MCA. Через катетер, один гомологичны тромб находится в начале координат МСА. Чтобы определить успех окклюзии СМА, региональный церебральный кровоток контролировали, неврологические расстройства и объемы инфаркта были измерены. Методы, представленные в этой статье, должны помочь следователям по преодолению технических проблем для создания этой модели для исследования инсульта. </ P>
Введение
Инсульт является третьей ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах, но варианты лечения острого инсульта оставаться ограниченным. В настоящее время внутривенное вливание рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (ТАП), чтобы растворить тромбы является наиболее эффективным для лечения острого ишемического инсульта. Тем не менее, использование ТАП ограничивается его узким терапевтическим окном и с повышенным риском внутримозгового кровоизлияния. Поэтому модель инсульта подходящей для тромболитической исследования является насущной потребностью.
Средней мозговой артерии (МСА) является артерии окклюзии, чаще всего в инсульта у человека. Основное внимание на этой артерии, были созданы многие животные модели ишемического инсульта. В настоящее время, два основных типа грызунов фокусное моделей ишемии по окклюзии MCA были разработаны: шов MCAO модели и эмболии МСАО модель. Хотя модели MCAO через внутрипросветного техники шва были широко использованы в механизме приводом исследований инсульта, эти модели шовные неимитировать человеческое инсульт, а до 80% от ударов человека вызваны тромбоза или эмболии. Тем не менее, эмболии модель удара с использованием тромбов точно имитирует человеческую инсульт и считается подходящим для тромболитической исследования. Эта модель эмболии была впервые разработана в крыс Overgaard соавт. 1 в 1992 году и далее характеризовали Чжан соавт. В 1997 году 2 и ДиНаполи соавт. В 2006 году 3. Несмотря на то, эмболии MCAO приобрела все большее внимание, есть технические проблемы, с которыми сталкиваются многими лабораториями.
В этой статье мы покажем, стандартный способ получения эмболической MCAO с гомологичными тромбов в взрослой крысы, которые могут развиваться предсказуемый миокарда в пределах территории MCA. Методы, представленные в этой статье, должны помочь исследователям преодолеть технические проблемы для установления эту модель для исследования инсульта.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
О себе Этика: Мужской взрослых Спрэг Доули (весом 330-380 г) были использованы в данном протоколе. Этот протокол был одобрен уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) в ЛГУ Health Science Center-Шривпорте по и в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных" (восьмое издание, Национальной академии наук, 2011 ).
1 Получение модифицированной трубки ПЭ-50
- Держите 30 см длиной трубки ПЭ-50 выше газовой плитой руками, постепенно смягчить трубку. Осторожно потяните трубку.
- Выберите точку на растянутой трубки с использованием цифрового суппорта (рисунок 1), пометьте его, и сократить измененный трубки ПЭ-50 в 25 см длиной сегмента в с длиной 1 см чаевых (внешний диаметр: 0.30-0.34 мм).
2 Получение гомологичных тромбов
- Обезболить крысу с изофлураном (5% для индукции, 2-3% для технического обслуживания) в 70% N 2 O и 30% O <суб> 2 на лицевой маски в донорстве. Подтвердите анестезией забой крайнем случае.
- Выполнение бедренной артерии катетеризации донора крысы с опубликованным методом 4 и передавать бедренной артерии кровь непосредственно в 20 см длиной трубки ПЭ-50. Поместите пробирку в течение 2 ч при комнатной температуре для свертывания крови, а затем сохранить трубку в течение 22 ч при 4 ° С. Примечание: канюли осуществляется с помощью асептической техники, как описано на стадии 3.1. Донор крысы извлекают для дальнейшего отбора.
- Отрежьте трубки ПЭ-50 в 50 сегментах мм и промойте сгусток из трубки в стерильную чашку Петри, содержащую физиологический раствор.
- Трансфер 50 мм длинный сгусток в длинный 60 мм ПЭ-10 трубки и подключить каждый конец PE-10 трубки к длинной 20 см трубки ПЭ-50, подключенный к 1 мл шприц, содержащий физиологический раствор с 23 G иглы (Рисунок 2) .
- Сдвиг тромб путем непрерывного переменного движения из одного шприца в другой в течение 5 мин, которые можно удалить из клеток кровисгусток и минимизировать хрупкий из внесосудистой свернувшейся сгустка, не нарушая при этом ядро фибрина.
- Обрежьте сгусток в 40 мм с длинной сегмента и передают сегмент сгустка в модифицированный ПЭ-50 катетера, как описано в шаге 1.2 в асептических условиях. Примечание: Все PE трубки стерилизуют с этиленоксидом.
3 Эмболические средней мозговой артерии окклюзии (3А, Б)
- Стерилизацию всех хирургических инструментов в автоклаве (минимум 121 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 мин). Sanitize таблицу хирургии и связанного хирургического оборудования, используя 70% этанола.
- Обезболить крысу с изофлураном как описано в шаге 2.1. Проверьте глубину анестезии, выполняя ног щепотку на обоих задних ног, и любая наблюдается движение (снятия лапу) указывает, что животное не достаточно наркозом делать операцию. Нанесите небольшое количество ветеринарной мази на оба глаза, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом. Бритье мех на брюшной шеи и головы реобласти как с электрическими ножницами, чтобы разоблачить участки кожи.
- Поместите крысу в положении лежа на спине на грелку. Вставьте ректальный зонд, контроль и поддержание температуры тела между 36.5-37.5 ° С с использованием теплокровного блок управления одеяло.
- Лечить бритая кожей и окружающей мех с 10% повидон-йода с последующим 70% этанола.
- Сделайте 2-см длиной срединный разрез на шее под микроскопом рассекает. Используйте втягивающие выставить операционного поля и рассекают правая общая сонная артерия (CCA), наружной сонной артерии (ЭКА), внутренней сонной артерии (ВСА), и крыловидно артерии (PPA) бесплатно от окружающих нервов и фасции (рисунок 3А). Примечание: Перед операцией, изменить стерильные перчатки, если не помощник помогает подготовить животное.
- Проанализируйте CCA бесплатно от окружающих нервов (без ущерба для блуждающего нерва) и поместите стерильный 5-0 шелковой нити под артерии. Свяжите узел промаха (# 1) и понять шов с помощью небольшого Hemosтат и тянуть учил к телу.
- Проанализируйте ЭКА и свои две ветви, затылочная артерия (ОА) и верхняя щитовидная артерия (STA). Coagulate две ветви с помощью ветеринарного блока электрохирургической. Поместите две части стерильных 6-0 шелковыми швами под ЭКА.
- Отдельные два шелка, помещенных под артерии, одна часть к голове (дистальный конец), а другой к телу. Свяжите плотный лигатуры (# 2) на стороне, самой близкой к голове, понять шелк с небольшими кровоостанавливающих и тянуть учил к голове. Подготовьте свободную узел (# 3) с другой шелка, чтобы использовать позже.
- Рассеките ICA и PPA от окружающих нервов (без ущерба для блуждающего нерва). Свяжите PPA с 6-0 шва (# 4). Сделать скольжения узла с 6-0 шва вокруг ICA (# 5). Кроме того, клип ICA использованием микрососудистой клип.
- Сокращение маленькое отверстие (1/2 через) в ЭКА между жесткой сыпучих (# 3) лигатур (# 2) и с Vannas стиле весенних ножницами. Вставьте модифицированный ПЭ-50-ваннаэ содержащий сгусток крови в разрез и заранее к бифуркации ОСА. Затянуть свободную лигатуры (# 3) вокруг просвета достаточно просто обеспечить сохранение мобильности трубки в-жилища.
- Отрежьте ЭКА на месте небольшое отверстие, чтобы освободить пень и расположите пень ниже бифуркации ЭКА и ВСА; это позволит изменение трубка легко устанавливаться в ВСА. Открытие ICA и осторожно продвигать трубку из просвета ECA в ВСА, пока кончик катетера не достигнет происхождение MCA (~ 17 мм от бифуркации). Примечание: Перед вставить наконечник трубки в ECA, стерильной внешней поверхности трубки с 70% этанолом, а затем промывают стерильным физиологическим раствором.
- Введите сгусток через модифицированного ПЭ-50 катетера вместе с 10 мкл физиологического раствора в течение 10 сек с помощью 100 мкл Hamilton шприц (фиг.3В).
- Вывод катетера из ЭКА 5 мин позже. Свяжите ЭКА и открыть CCA. Шовный разрез на шее.
4 Мониторинг регионального мозгового кровотока (rCBF)
- До окклюзии СМА, сделать длинный 1,2 см срединный разрез в коже головы, чтобы выставить кости черепа. Удалить тканей на кости черепа с зубной скребком и стерильным ватным свопов. Примечание: Перед операцией, поврежденная площадь кожи головы и окружающих мех дезинфицируют 10% повидон-йода с последующим 70% этанола.
- Просверлите 1,5 мм Диаметр заусенцев отверстия расположены на 2 мм задней и 5 мм латеральнее брегмы используя сферическую заусенцев 0,7 мм из нержавеющей стали (рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите твердую мозговую оболочку в неприкосновенности. - Поместите зонд 0,5 мм над поверхностью твердой мозговой. Контролируйте rCBF в 0 (базового уровня), 5, 15, 30, 60, 90, и 120 мин после эмболизации и продолжить в 5, 15, 30, 45, и через 60 мин после внутривенного введения ТАП. После последнего измерения rCBF, волосистой части головы разрез закрывают швом. Примечание: Перед шеи разрез мы измеряем rCBF качестве базовых до MCA occlusионный. Сообщение MCA окклюзии мы измеряем rCBF после закрытия шва шеи разрез. Таким образом, шеи разрез сохраняется стерильным.
5 Послеоперационный уход
- Введите 2,5 мл физиологического раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание и привнести Buprenex (0,05 мг / кг, подкожно) сразу после операции и через каждые 6-12 часов при необходимости для облегчения боли.
- Стоп ИФ анестезии. Поместите крысу в 37 ° C ветеринарная восстановления камеры (держать животных в тепле) и держать наблюдение. Это обычно занимает 10 минут для крыс, чтобы оправиться от наркоза. Затем положить животное в стерилизованную клетке, место некоторые смоченной еду в чашке Петри в клетке, и вернуть клетку к животным стерилизации комнате.
- 24 ч после инсульта, эвтаназии крысу с передозировкой пентобарбитала натрия (100 мг / кг массы тела, IP).
6 неврологического дефицита Оценка
- Выполните счет Бедерсон до и в 2 ч после эмболизации. Используйте классификации SСетевой 0-3, как описано выше 5: 0, поднимая крысу хвостом, животное продления обе передние конечности на пол и не выставляется никаких других дефицитов (нормальное движение); 1, в результате чего крыса хвостом, согните контралатеральный переднюю конечность; 2, снижение устойчивости к боковому нажиму (и передних конечностей сгибания) без кружили; 3, то же поведение, класса 2 с кружили.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы не показывая Бедерсон балл = 0 (нет дефицита) в 2 часа после эмболизации исключены из дальнейшего исследования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Лазерной допплеровской флоуметрии (LDF) был использован для контроля rCBF при индукции ишемии головного мозга 6,7. Многие лаборатории в том числе нашу лабораторию уже используют rCBF для идентификации животных с успешной окклюзии МСА, но пороги базового варьировать между лабораториями, которые связаны с места измерения. Зонд из LDF расположен на 2 мм кзади и 5 мм латерально к темени, как описано выше 6. rCBF контролируют при 0, 5, 15, 30, 60, 90, и 120 мин после инъекции сгустка. На основании этих ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом исследовании мы показали стандартный метод для выполнения эмболической модель МСАО инсульта у крыс, в которой происхождение MCA окклюзии по фибрина богатых сгустка. Основным преимуществом данной модели является: окклюзия ствола СМА с фибрина богатых тромба похожа на тромбоэмболических инсульта у человека, модель эмболии инсульта подходит для выполнения доклинические исследования фибринолитической терапией, и что эта модель может развиваться воспроизводимым и предсказуемым объем инфаркта на территории, предоставле...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У нас нет никаких потенциальных конфликтующих интересов, которые можно было бы раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения HL087990 (G.L.).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| rh-tPA | Chemical | Genentech | |
| 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид | Chemical | Sigma | T8877 |
| Оборудование для испарителя анестезии | Soma Technology | Dräger Vapor 19.1 | |
| Перезаряжаемая высокоскоростная микродрель | Оборудование | Fine Science Tools | 18000-17 |
| Изогнутые ножницы | Оборудование | Fine Science Tools | 14117-14 |
| Щипцы Dumont (Медицинский #7) | Оборудование | Fine Science Tools | 11270-20 |
| Щипцы Dumont (Медицинский #5) | Оборудование | Fine Science Tools | 11251-35 |
| Пружинные | ножницы типа VannasОборудование | Fine Science Tools | 15000-03 |
| Ветеринарная камера восстановления | Оборудование | Услуги Peco | V1200 |
| Genie plus шприцевой насос | Оборудование | Kent Scientific Corporation | |
| Матрица мозга крысы | Оборудование | Kent Scientific Corporation | RBMA-310C |
| Цифровой суппорт | Оборудование | Мир прецизионных приборов | 501601 |
| Препарирующий микроскоп | Мировой | прецизионный прибор | Шприц PZMTIII-BS-LWD |
| Аппарат | Гамильтон | модель 710 | |
| Гомеотермический блок управления одеялом | Оборудование | Гарвардский аппарат | |
| Электрическая клипсовочная | машина Оборудование | Braintree Scientific | CLP-9931 |
| Ветеринарный электрохирургический аппарат | Оборудование | MACAN Производственная компания MV-9 | |
| Расходомер крови | Оборудование | Adinstruments | |
| PowerLab 4/30 | Оборудование | Adinstruments | |
| LabChart 7.2 | программное обеспечение | Adinstruments | |
| 1 мл шприц | Расходный материал | Becton, Dickinson and Company | 309659 |
| Расходные материалы | игл 23 G | Becton, Dickinson and Company | 305143 |
| Расходные материалы | игл 30 G Расходные материалы для трубок | Becton, Dickinson and Company | 305106 |
| PE-50 | Расходные материалы | Becton, Dickinson and Company | 427517 |
| Расходные материалы для трубок PE-10 | Becton, Dickinson and Company | 427400 | |
| 6-0 Шелковые шовные материалы | Гарвардский аппарат | 723287 | |
| 5-0 Шелковый шовный материал | Расходный материал | Гарвардский аппарат 517607 |
Ссылки
- Overgaard, K., Sereghy, T., Boysen, G., Pedersen, H., Høyer, S., Diemer, N. H. A rat model of reproducible cerebral infarction using thrombotic blood clot emboli. J Cereb Blood Flow Metab. 12 (3), 484-490 (1992).
- Zhang, R. L., Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q., Ewing, J. R. A rat model of focal embolic cerebral ischemia. Brain Res. 766 (1-2), 83-92 (1997).
- Dinapoli, V. A., Rosen, C. L., Nagamine, T., Crocco, T. Selective MCA occlusion: a precise embolic stroke model. J. Neurosci. Methods. 154 (1-2), 233-238 (2006).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J Vis Exp. 59 (3496), (2012).
- Bederson, J. B., Pitts, L. H., Tsuji, M., Nishimura, M. C., Davis, R. L., Bartkowski, H. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17 (3), 472-476 (1986).
- Henninger, N., Bouley, J., Bråtane, B. T., Bastan, B., Shea, M., Fisher, M. Laser Doppler flowmetry predicts occlusion but not tPA-mediated reperfusion success after rat embolic stroke. Exp Neurol. 215 (2), 290-297 (2009).
- Zhu, H., et al. Annexin A2 combined with low-dose tPA improves thrombolytic therapy in a rat model of focal embolic stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (6), 1137-1146 (2010).
- Cheng, T., et al. Activated protein C inhibits tissue plasminogen activator-induced brain hemorrhage. Nat Med. 2 (11), 1278-1285 (2006).
- Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. 21 (955), (2008).
- Sicard, K. M., Fisher, M. Animal models of focal brain ischemia. Exp Transl Stroke Med. 1 (7), (2009).
- Florian, B., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Westendorp, W. F., Nederkoorn, P. J., Vermeij, J. D., Dijkgraaf, M. G., van de Beek, D. Post-stroke infection: a systematic review and meta-analysis. BMC Neurol. 11 (110), (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats
Posted by JoVE Editors on 11/01/2014. Citeable Link.
A correction was made to Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats. The institution information was updated.
The institution "Louisiana State University Health Science Center" was changed to "Louisiana State University Health Science Center, Shreveport".
